爱玉种质资源遗传多样性的ISSR分析

1、宁德师范学院毕业设计（论文）爱玉种质资源遗传多样性的ISSR分析ISSR Analysis on Genetic Diversity of Ficus pumila var.awkeotsang Germplasm Resources院 系 ：生物系专业（班级）：2010级生物技术2班姓 名：吴泽江学 号:B2010072205指导教师：史辉职 称：副教授完成日期： 2014年 5 月 1 日宁德师范学院教务处制摘 要 研究爱玉品种分类、起源进化关系，为育种工作提供理论基础。采用ISSR-PCR分子标记方法对24个爱玉品种的遗传多样性进行分析。从100 条ISSR引物中筛选出17条扩增清晰、重

2、复性和多态性好的引物，从中选取4条多态性最强的引物进行扩增，对扩增结果进行统计分析和遗传聚类分析。结果表明：4条引物共扩增出48个位点，其中多态性位点43个，多态性百分率为89.6%，这4条引物可以将爱玉品种之间遗传差异完全区分开来。利用聚类分析和主坐标分析，可以将24个爱玉种质资源聚分为4大类，为爱玉种质的鉴定奠定良好的基础。关键词：爱玉；ISSR；遗传多样性；亲缘关系Abstract We study cultivars classification of Ficus pumila var.awkeotsang, and relationship of origin and evoluti

3、on relationship, which will provide a theoretical basis for breeding work. ISSR-PCR was used to detect the genetic diversity and relationship of 24 Ficus pumila var.awkeotsang cultivars. 17 primers that are amplified clear, good repeatability and polymorphism were screened from100 ISSR primers. And

4、then 4 polymorphic primers were selected from the strongest of amplification, and their amplification results were used to do statistical analysis and analysis of genetic clustering. It was found that the 48 sites were found by 4 primers, and 43 sites showed polymorphism, the percentage of polymorph

5、ism loci was 89.6%, and the difference of Ficus pumila var.awkeotsang cultivars can be completely separated by the 4 ISSR primers. 24 Ficus pumila var.awkeotsang cultivars can be divided into four groups by Cluster analysis and principal coordinate analysis, which lays a good foundation for the iden

6、tification of Ficus pumila var.awkeotsang germplasm.Key words: Ficus pumila var.awkeotsang; ISSR; Genetic diversity; Genetic relationship目 录1 引 言11.1 爱玉简介11.2 ISSR在植物遗传多样性研究中的运用11.2.1 品种鉴定和亲缘关系分析11.2.2 物种群体遗传结构和遗传多样性研究21.3 本研究的目的及意义22 材料与方法32.1 材料32.1.1 试材32.1.2 试剂32.1.3 仪器32.2 方法32.2.1 基因组DNA提取和纯度检

7、测32.2.2 ISSR引物的筛选和退火温度优化42.2.3 爱玉群体的ISSR-PCR分析42.2.4 数据分析43 结果与分析43.1 爱玉基因组DNA质量检测43.2 ISSR引物筛选及退火温度优化53.3 爱玉ISSR-PCR遗传分析63.3.1 ISSR引物扩增结果多态性分析63.3.2 爱玉品系遗传多样性分析83.3.3 爱玉品系遗传分化的主坐标分析94 讨 论11致 谢13参 考 文 献14爱玉种质资源遗传多样性的ISSR分析1 引 言1.1 爱玉简介爱玉（Ficus pumila L.var.awkeotsang）是一种桑科榕属常绿大藤本野生植物，雌雄异株。爱玉的主要产地为台湾

8、嘉义县和南投县，1996年台湾林业专家胡大维教授首次将其引种至福建1。主要分布于我国的福建省东北部、浙江南部和台湾。爱玉瘦果制成的爱玉冻是一种高贵的天然食品，富含果胶、维生素和矿质元素，而且低脂、低糖、低热量，符合当代人的饮食风尚，故可作为低脂低热食品研发的重要资源，具有良好的应用前景。1.2 ISSR在植物遗传多样性研究中的运用ISSR（Inter-simple sequence repeats，ISSR）又称简单序列重复区间扩增，是一种新型的分子标记，由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz于1994年创立。ISSR技术是在微卫星（Simple sequence repeats，SSR）

9、标记技术上发展起来的标记技术，具有多态性高和产物特异性强等特点2，广泛应用于物种鉴定、遗传作图、基因定位、系统发育与进化等领域3-7 。1.2.1 品种鉴定和亲缘关系分析 ISSR标记因其有操作简单，多态性和稳定性强等优点，在农作物的品种及其野生近缘种的鉴定方面获得良好地应用，如在葡萄8、柑橘9、枣树10 -11、芒果 12、石榴13等品种研究中都取得了很好的结果。Huang等14采用ISSR分子标记技术对番薯属（Ipomoea）植物的遗传多样性和亲缘关系进行研究，结果表明与常见栽培种番薯（Ipomoea batatas）亲缘关系最远的是I.umbraticola和I.ra

10、mosissima，而最为接近的是I.trifida。薛艺敏等15用ISSR指纹图谱鉴定了九节茶（Sarcandra glabra(Thunb) Nakai）不同品种，通过17条引物产生的ISSR标记可用于区分37个九节茶品种。由此可见，ISSR是一种行之有效的基因型鉴定手段，在品种鉴定、品种注册等方面将会发挥重要作用。1.2.2 物种群体遗传结构和遗传多样性研究 缪横彬等16采用22条引物研究了85个大菊品种，共获得160条清晰可辨普带，其中多态性条带148条，多态位点百分率高达92.5%，多态性较高。Jian等17利用ISSR分子标记技术研究了华南地区银叶树（Heritiera&

11、#160;littoralis）6个自然种群的遗传多样性，使用11个ISSR引物，获得了119个位点，其中多态性位点95个，多态位点百分率达83.19%。总的基因多样度为0.233，基因分化系数为0.239，种群间的遗传相似性平均为0.919。表明银叶树有较高的遗传变异水平，大部分遗传变异在种群内。Li等18用ISSR标记研究了我国西北地区固沙植物沙鞭（Psammochloa villosa）7个自然种群共157份个体的遗传变异。该研究采用12个引物共扩增出173个位点，其中122个位点具有多态性，多态位点百分率为70.5%。结果表明遗传多样性在物种中的水平较高；而在种群内水平较低，

12、多态位点百分率仅为6.1%26.8%。沙鞭绝大部分遗传变异分布在种群间（87.46%），仅有12.54%的遗传变异存在于种群内的个体间。以上这些实验事实都表明ISSR在研究作物遗传结构和遗传多样性方面发挥着巨大的作用，可以作为植物育种研究有力的辅助工具。通过与目标基因连锁的ISSR标记来辅助育种在小麦（Triticum aestivum）、椰子（Cocos nucifera）、鹰嘴豆（Cicerarietinum）等已经有相关研究的报道19 。综上所述，ISSR分子标记技术在研究植物遗传多样性的研究具有重要作用。1.3 本研究的目的及意义近年来爱玉栽培面积不断扩大，对优良品

13、系的需求越来越多。目前，对爱玉种质资源鉴定和遗传多样性研究的报道很少，对其遗传背景不是很了解，为防止因伪劣品系或品系混乱造成的生产损失，对爱玉优良品系进行准确鉴别尤为重要。传统的品种区分方法主要依据其叶型、隐头花序等形态学特征，而这些特征须待到性成熟时方可确定，因此性状鉴定周期较长，且这些性状的表现常受环境的影响，精确度低。DNA分子标记是在基因水平上直接反映遗传多样性，能对各个发育时期的个体、组织器官甚至细胞做检测，不受坏境与基因表达与否的限制，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，而被广泛应用于植物品种鉴定、亲缘关系及遗传多样性分析等方面。本研究采用ISSR标记技术初步对福建引种的

14、24份爱玉品种进行遗传多样性及亲缘关系分析，以期为爱玉优良品种的鉴定和资源保护提供技术参考， 为这种新型经济植物种质资源引种栽培和遗传改良提供理论依据。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 试材供试材料为斗1、太6、乐野6、里19、日野20、新25、台60等24份爱玉种质（下文中C1-C4分别代表：斗1，斗2，斗3，斗4；V5-V24分别代表：太2，太6，太7，特选A1，石光文1，石光文2，石光文B1，乐野6，乐野8，里19，日野20，新25，台60，A，B，太谢3（），太和11（），红9（），W13（），台1（吴国政），采自福州闽侯南屿镇爱玉生态研究园。取新鲜叶片组织，放冰盒中带回实验室，用

15、去离子水涤洗，液氮速冻后- 70 超低温冰箱保存备用。2.1.2 试剂 复杂植物基因组提取试剂盒、rTaq、Marker（DM2000）购自北京康为世纪生物科技有限公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，琼脂糖为西班牙Biowest进口，上海Gene Tech公司分装，其他试剂均为国药分析纯。2.1.3 仪器 梯度PCR扩增仪（美国Biometra C-412），超微量核酸蛋白测定仪（美国ACTGene Nanodrop 1000），高速冷冻离心机（德国SIGMA 3-30K），台式小型高速离心机（德国SIGMA 1-14），移液枪（法国吉尔森 Ppetman系列），超低温冰箱（日本SANY

16、O MDF-382E），制冰机（Scotsman AF100-AS)，超纯水系统（美国MILLI-Q），涡旋振荡器（德国IKA MS3digital)，电泳仪（北京六一 DYY-10C型），凝胶透射分析仪( 上海嘉鹏 ZF型) ，相机（Nikon 3200D），全自动凝胶电泳成像仪（Gel DocTM EZ型）。2.2 方法2.2.1 基因组DNA提取和纯度检测 采用北京康为世纪复杂植物基因组提取试剂盒提取，1%琼脂糖电泳和超微量核酸蛋白测定仪测定所提DNA的纯度与浓度。2.2.2 ISSR引物的筛选和退火温度优化在前期实验建立的爱玉ISSR反应体系的基础上，以遗传差异较大的两个爱玉品种（A和

17、W13）的DNA为模板，对100 条ISSR引物进行ISSR-PCR扩增筛选，退火温度参考引物合成报告单上的Tm，从中筛选出扩增清晰、重复性和多态性好的引物。筛选出的引物以Tm为中心，1为梯度，设置退火温度，用梯度PCR仪上自动生成的退火温度进行温度梯度扩增，选择扩增条带多、清晰度高、背景浅的温度为引物最适退火温度。2.2.3 爱玉群体的ISSR-PCR分析选用808、811、861和864引物（不同的引物Tm值不一样，808为53.0、811为51.1、861为65.5、864为49.7），对24个爱玉进行ISSR-PCR分析。ISSR-PCR扩增体系（20uL）：1ng模板DNA，1.0U

18、Taq酶，0.4mol/L引物，0.18mmol/L dNTPs；PCR扩增程序：94预变性4 min；94变性45s，相应引物的退火温度下45s，72延伸2.5min，共30个循环；72延伸7min，4保存。扩增产物经2%琼脂糖电泳检测，紫外成像拍照记录数据。2.2.4 数据分析ISSR扩增结果分别由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测拍照后，统计多态性条带并进行赋值，有带为“1”， 无带为“0”，根据Nei-Li相似系数法计算出24份供试品种之间ISSR数据的遗传相似系数，并用NTSYS软件进行UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Me

19、an)聚类分析和主坐标分析（Principal Coordinates Analysis）。3 结果与分析3.1 爱玉基因组DNA质量检测琼脂糖凝胶电泳检测所提取的爱玉基因组DNA质量，结果如图3-1 所示，DNA 电泳条带整齐，点样孔内无杂质，电泳条带大部分无拖尾，表明所得的DNA没有降解，大小在15000bp左右，纯度较高，质量较好。紫外检测结果表明（表3-1），所抽提样品DNA的OD260/ OD280比值平均为1.86 左右，说明蛋白质、RNA去除干净，OD260/OD230比值平均在3.16左右，说明多糖和其他杂质去除干净，所得DNA纯度较高，可以满足后续PCR扩增要求。表3-1 2

20、4个爱玉品系基因组DNA的平均纯度和产量材料名称浓度(ng/µL)A230A260A280A260/A280A260/A230产率(ug.gFW-1)24份爱玉37.10.2340.7410.4011.863.1655.59bp15000100007500500025001000M C1 C2 C3 C4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 V15 V16 V17 V18 V19 V20 V21 V22 V23 V24注：C1-C4分别代表：斗1，斗2，斗3，斗4；V5-V24分别代表：太2，太6，太7，特选A1，石光文1，石光文2，石光文B1，乐野

21、6，乐野8，里19，日野20，新25，台60，A，B，太谢3（），太和11（），红9（），W13（），台1（吴国政）图3-1 爱玉24个样品的基因组DNA电泳图3.2 ISSR引物筛选及退火温度优化利用在预实验中差异较大的两个爱玉材料A和W13对ISSR的100个引物进行引物的初筛（图3-2），共选出17条扩增谱带清晰、多态性高，可用于爱玉遗传多样性分析的引物，分别是UBC807、808、810、811、821、825、827、829、834、840、861、864、866、867、868、876、880。其余引物扩增条带较少或者扩增条带模糊。M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6

22、 7 7 8 8 9 9 10 10 11 1120001000500bp750500250100M: DM 2000; 1-11: UBC869、873、876、880、864、868、883、882、875、863、879图3-2 引物筛选筛选出的引物以引物合成报告单上面的Tm为中心，1为梯度，设置退火温度，用梯度PCR仪上自动生成的退温度进行温度梯度扩增，结果如图3-3，其中17条引物的最适退火温度只有7条引物和引物合成报告单上的退火温度基本保持一致，其余10引物和引物合成报告单中的Tm都有不同程度上的偏差，平均偏低2.04，（表3-2）。bp20001000750500250100M

23、1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10(a) 图 (b)图 22 23注：M: DM 2000; (a)图: UBC827:1-10:62.1,61.0,59.7,58.9,57,8,56.5,54.9,53.8,52.5,51.2; (b)图: UBC829; 1-10:51.4,52.5,53.6,54.6,55.9,56.9,58.1,59.2,60.4, 61.4. 图3-3 引物退火温度优化表3-2 退火温度优化结果编号引物理论最适温度（）优化退火温度（）偏差（）编号引物理论最适温度（）优化退火温度（）偏差（）1UBC80751.535

24、1.100.4310UBC84053.8948.405.492UBC80856.6953.003.6911UBC86165.4665.500.043UBC81050.0350.000.0312UBC86449.7049.700.004UBC81151.3551.100.2513UBC86660.2455.804.445UBC82155.6453.901.7414UBC86781.8080.501.306UBC82556.5655.101.4615UBC86849.2749.000.277UBC82758.5554.903.6516UBC87643.8143.800.018UBC82958.23

25、55.902.3317UBC88049.7946.103.699UBC83455.8650.005.8618-3.3 爱玉ISSR-PCR遗传分析3.3.1 ISSR引物扩增结果多态性分析4条引物对全部爱玉24个品系进行扩增，共扩增出48条清晰且可重复的DNA条带，其中43条属于多态性条带，每个引物扩增出来的DNA条带数不等，在1015条之间，平均为12条，总多态率为89.6，其中引物UBC861扩增出的多态性条带的百分率最高，为92.3。4条引物所扩增的DNA片段的大小范围在1002000bp，符合分子标记对扩增条带的要求。所筛选的100条ISSR引物中，引物Tm值在40以下经扩增程序调整未

26、见扩增条带，Tm值大于65 扩增效率也较差，Tm值在5056扩增效率较高；共筛选出有多态性条带的引物17条，其中有10条引物的核心序列为AG、GA。核心序列为AT、TA、GT、TC的引物基本无扩增。说明爱玉的微卫星序列主要是AG和GA。而其中4条引物扩增的多态性条带较多、清晰且稳定重复性好，其中核心序列为ATG 的引物，864扩增效果最为清晰，多态性条带最多(图3-4)。bp选取有扩增效果较好的4条引物进行多态性条带统计分析，对条带进行赋值（把电泳谱带转化为数字化的DNA指纹，以引物811为例）如（表3-3）所示。4条引物的序列及扩增条带数统计见表3-4。2000100075050025010

27、0图(a):UBC864M C1 C2 C3 C4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 V15 V16 V17 V18 V19 V20 V21 V22 V23 V24图(b):UBC861图(c):UBC811图(d):UBC808注：C1-C4分别代表：斗1，斗2，斗3，斗4；V5-V24分别代表：太2，太6，太7，特选A1，石光文1，石光文2，石光文B1，乐野6，乐野8，里19，日野20，新25，台60，A，B，太谢3（），太和11（），红9（），W13（），台1（吴国政）图3-4 UBC808、811、861和864对爱玉24个品种ISSR-PCR扩增结

28、果3.3.2 爱玉品系遗传多样性分析以24个爱玉品系和48个位点的谱带数据为原始矩阵，利用NTSYS软件进行遗传相似性分析。并构建了24个爱玉品种的系统进化树和遗传距离图谱( 图2-5) 。结果表明: 4个ISSR标记引物可明显区分24个爱玉品种的遗传差异，由于检测方法的差异，所构建的聚类图也不相同。琼脂糖凝胶电泳检测数据所构建的遗传聚类图，其遗传相似系数范围在0.69-0.92之间，如果以0.74为最高遗传相似系数，可以将24个检测品种分成4个大类（1、2、3和4），以0.77为最低遗传相似系数，可以将24个检测品种分成7个亚类。其中薜荔单独划分为1类，按照1、2、3、4的顺序，24个爱玉品

29、系之间的遗传相似程度逐渐升高。表3-3 UBC811扩增条带赋值示例12345678910111213141516171819202122232400000000000000000100000011111111011111111001111000001000000010110011111101110111111101111101111111111111111111111111111010111000000000100100000111111100111111111111111000001100000000111100001111111111111111111111111111111111111

30、111111010101000111100000111111100101111111111111111111111110XIII111110110111100010101111XIV000100010000000000010000XV010000000000000010100000注：1、2、3、4表示24个爱玉品种，、表示显示的条带表3-4 ISSR引物及扩增条带数编号引物序列Tm/ 琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带数 多态性条带数 1UBC808(AG)8C53.015132UBC811(GA)8C51.11083UBC861(ACC)665.513124UBC864(ATG)649.7109注

31、：Tm表示退火温度。3.3.3 爱玉品系遗传分化的主坐标分析主坐标分析（Principal Coordinates Analysis）是以品种间相似系数矩阵为基础，建立新的坐标系，不同的品种在主坐标图中的位置能反应出它们之间的亲缘远近关系。品种间相对位置越接近，表明它们的遗传相似性越大，亲缘关系越近，反之则相反20 。本实验通过NTSYS软件对24个爱玉品种进行主坐标分析，分别建立24个爱玉品种的主坐标二维散点图（图3-6）和三维散点图（图3-7）。从主坐标二维散点图和三维散点图中可以清楚地看出，斗1、斗2、斗3、乐野6、石光文2、太和11、W13、太2、新25、台1、太谢3亲缘关系较近，可以

32、聚为一类；斗4、特选A1、石光文1、石光文B1、台60、红9、A、乐野8、里19、日野20亲缘关系较近，聚为一类。太6、太7两个品种的亲缘关系相对还是较远的。品种B为薜荔是和其他23个品种相比亲缘关系相差很远，单独聚为一类，这也恰恰证实了爱玉和薜荔分别属于不同的藤本植物。4231图3-5 24个爱玉品系相似性聚类图注：C1-C4分别代表：斗1，斗2，斗3，斗4；V5-V24分别代表：太2，太6，太7，特选A1，石光文1，石光文2，石光文B1，乐野6，乐野8，里19，日野20，新25，台60，A，B，太谢3（），太和11（），红9（），W13（），台1（吴国政）图3-6 24份爱玉种质资源主坐标

33、分析二维散点图注：C1-C4分别代表：斗1，斗2，斗3，斗4；V5-V24分别代表：太2，太6，太7，特选A1，石光文1，石光文2，石光文B1，乐野6，乐野8，里19，日野20，新25，台60，A，B，太谢3（），太和11（），红9（），W13（），台1（吴国政）图3-7 24份爱玉种质资源主坐标分析三维散点图4 讨 论本实验首次采用ISSR技术对爱玉的遗传多样性展开研究，结果显示出了较大的可行性和优越性，而且筛选出的引物都可以扩增出条带，这说明ISSR引物具有物种通用性。我们常规实验引物退火温度都是在引物合成报告单最适退火温度基础上再降低5，这只是经验心得，并没有定论。对于每个引物的最适退火

34、温度不仅和引物本身具有相关性，还与要扩增的模板相关联。引物退火温度对于PCR扩增结果具有重大影响：温度过高时引物与模板结合不牢固，引物容易从模板上掉下来，减少有效的扩增谱带；但退火温度过低，又会使一些不完全配对的引物在低温下比较稳定的与模板结合，增加了非特异性扩增。本实验中，高的退火温度明显减少扩增的谱带数量。大片段（500bp）明显减少，而小片段（250-500bp）不仅未受影响，反而扩增效果更好，这是因为大片段需要较长的扩增时间，温度过高，引物容易掉下来；而小片段的扩增只需要很短的时间就可以完成，由于没有大片段与小片段竞争引物和底物，所以小片段得到较好的扩增。因此引物退火温度的优化在ISS

35、R分子标记中具有重要意义。本试验结果中，ISSR扩增结果稳定性和重复性好，条带多而且清晰。选取4条ISSR引物，对24份爱玉种质进行遗传多样性分析，共扩增出多态性谱带43条，占总条带的89.6%，平均每个引物扩增出10.75条多态性谱带，表现出丰富的多态性。引物扩增谱带的数目与模板上出现的引物同源序列的频率有关；引物扩增谱带的清晰度与模板和引物的同源程度（互补配对）有关。大多数引物没有扩增，是因为与爱玉基因组DNA没有同源序列，不能配对。一些引物扩增谱带模糊，是因为与爱玉基因组DNA同源性低，配对不牢固，在扩增过程中容易脱落，导致扩增效率低。24份爱玉种质进行遗传多样性较为丰富，这可能是由于长

36、期的无性繁殖，基因没有融合，依然保留着各自独立的遗传信息，为育种提供丰富的遗传资源。其结果说明采用不同类型之间种质杂交可以获得较强的杂种优势，可避免近亲杂交，选配遗传相似系数低即亲缘关系较远的优异爱玉种质作为杂交亲本，有利于育成综合远亲优异性状的新品种。前人在形态性状等指标研究的基础上，认为薜荔是爱玉的变种，属于种间差异21。但也有研究认为爱玉和薜荔归为同一物种，属于种内差异。我们试验结果表明薜荔和爱玉差异较大，遗传相似系数为0.69，经聚类分析和主坐标分析把薜荔单独划分为1类，试验结果支持薜荔是爱玉的变种。利用主坐标分析法对爱玉遗传分化进行分析，通过以品种间的相似系数为举证，建立二维和三维坐

37、标我们可以一目了然的看出斗1、斗2、斗3、乐野6、石光文2、太和11、W13、太2、新、25、台1、太谢3亲缘关系较近，可以聚为一类；斗4、特选A1、石光文1、石光文B1、台60、红、A乐野、里19、日野20、亲缘关系较近，聚为一类。而太6、太7虽为统一命名系统的品种，但是可能由于其进化过程中基因发生大量交流，所以如今其差异性较大，相似系数仅为0.75。此外这个品种也于其他21个品系存在明显的差异，相似系数仅0.70，这与爱玉同薜荔的相似系数相近，这充分证明其在进化过程中发生了大量的基因突变的可能性。目前，爱玉种质资源分子鉴定以及遗传多样性的研究仍处在初步探索阶段，基于ISSR分子标记技术探索

38、爱玉种质资源遗传多样性目前尚未见报道。本研究表明用ISSR标记进行爱玉种质遗传多样性分析是可行的。SSR和AFLP是精确度高重复性较好的分子标记，但是本研究中没有选用该类标记，主要是由于SSR分子标记需要获得研究物种基因组序列，然而目前对爱玉基因组序列我们还一无所知，引物开发成本高、效率低和工作量大。AFLP操作复杂有一定难度，实验步骤繁琐，每一步条件都需要大量精密优化，实验成本高。RAPD标记虽然实验操作简单方便但重复性差。比较其他几种标记方法，ISSR分子标记不仅结合了RAPD和SSR的优点，具有操作简便、稳定性和多态性强，而且产物多态性也相对丰富。然而，实验中发现 ISSR 分子标记技术

39、也存在一些问题，当条件不适宜时很可能造成部分非特异性扩增、拖带严重等现象22-23 。此外部分条带较弱，在进行遗传多样性分析时，由于没有一定的标准，对于弱带的统计主观性较强，造成在进行遗传多样性分析、遗传图谱建立和品种鉴定时结果往往出现不稳定性， 这些弱带的原因可能是由于存在其他一些较亮的条带，从而抑制了这些弱带的扩增或引物在此结合位点的结合效率较低等24。因此，针对这些问题，我们还需要在以后的试验中继续探讨，以促进 ISSR 分子标记技术的成熟。致 谢历时将近1年多的时间终于将完成这篇毕业论文，在论文前期的实验操作以及后期的论文写作过程中遇到了无数的困难和障碍，都在同学们和老师们的帮助下顺利

40、克服了。在此尤其要特别感谢我的论文指导老师史辉老师，他对我进行了细心地指导和帮助，不厌其烦的帮助进行论文的修改和改进。另外，在做实验过程中，我们生物系的许多老师也给我提供了很多方面的支持与帮助。在此向帮助和指导过我的各位老师表示最衷心的感谢！感谢这篇论文所涉及到的各位学者。本文引用了数位学者的研究文献，如果没有各位学者的研究成果的帮助和启发，我将很难完成本篇论文的写作。 感谢我的同学和朋友，在我写论文的过程中给予我了很多份素材，还在论文的撰写和排版过程中提供热情的帮助。由于我的学术水平有限，所写论文难免有不足之处，恳请各位老师和学友批评和指正！参 考 文 献1 徐俊森,许信玲,罗美娟.台湾爱玉

41、研究与开发及福建引种栽培的现况J. 防护林科技, 2004, 6: 52-54.2 Ziet K E, Rafal S A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplificationJ. Genomes,1994, 20(2): 176-183.3 温文婷,贾定洪,郭勇,等.中国主栽银耳配对香灰菌的系统发育和遗传多样性J.中国农业科学,2010,43(3): 552-558. 4 李晓玲,李宁,杨进,等.湖北中华蚊母ISSR遗传

42、多样性分析及保护策略J.西北植物学报,2011,31(1): 0038-0044. 5 白成科,俞君如,于凤,等.山茱萸种质资源的ISSR遗传多样性分析与初级核心种质库的构建J.西北植物学报,2009, 29(12):2401-2407 6 杨生超,文国松,刘雪玲,等.灯盏花种质资源遗传关系的ISSR分析J.中草药,2010, 41(9): 1523-1527. 7 陈圣林,王会娜,孙颖,等.人参种源遗传关系的ISSR分析J.中草药,2010, 41(7): 1164-1167.8 吴子龙,方连玉,王军,等.三峡库区14个李品种遗传多样性的ISSR分析J.中南林业科技大学学报,2012,32: 130-134.9 施维属,潘腾飞,钟凤林,等.柑橘基因组DNA快速提取ISSR-PCR扩增体系优化J.生物技术通报,2009,2009(1