病毒滴度的测定

1、病毒滴度的测定病毒滴度的测定原理原理( (重点重点) )：适当稀释的病毒悬液与长成单适当稀释的病毒悬液与长成单层的宿主细胞混合，在细胞上覆以营养琼脂培层的宿主细胞混合，在细胞上覆以营养琼脂培养基等固体或半固体介质，由于琼脂的限制，养基等固体或半固体介质，由于琼脂的限制，病毒只能感染并破坏临近的细胞，造成细胞溶病毒只能感染并破坏临近的细胞，造成细胞溶解而形成空斑，每个空斑由一个病毒颗粒造成，解而形成空斑，每个空斑由一个病毒颗粒造成，计算空斑数量再乘以稀释倍数即可得知原来的计算空斑数量再乘以稀释倍数即可得知原来的病毒感染单位的浓度。病毒感染单位的浓度。空斑形成单位空斑形成单位法测定病毒滴度法测定病

2、毒滴度 空斑形成单位空斑形成单位（Plaque Forming Units, Plaque Forming Units, PFUsPFUs) )空斑显现原理空斑显现原理(掌握掌握)：空斑形成空斑形成后，经中性红后，经中性红活细胞染色，活细胞显示红色，而空斑区细胞活细胞染色，活细胞显示红色，而空斑区细胞不着色，形成不染色区域。不着色，形成不染色区域。空斑形成单位空斑形成单位法测定病毒滴度法测定病毒滴度适用条件适用条件(熟悉熟悉)：凡是能在细胞中产生细胞病：凡是能在细胞中产生细胞病变效应变效应(CPE)的病毒都可以采用空斑形成法测的病毒都可以采用空斑形成法测定病毒滴度。定病毒滴度。空斑形成单位空斑

3、形成单位法测定病毒滴度法测定病毒滴度中性红中性红(掌握)(熟悉)(了解)(了解)空斑形成单位试验技术举例空斑形成单位试验技术举例 p51-52防止琼脂凝固；防止琼脂凝固；Hanks液？液？双抗？双抗？5% CO2空斑空斑形成单位的计算形成单位的计算 (重点重点)(掌握)(熟悉)CCID50ID50LD50(重点)(熟悉)5% CO2培养箱培养箱(熟悉)CCID50TCID50(熟悉)病毒液病毒液 CPE孔数孔数 无无CPE 累累 计计 出现出现CPE孔孔稀释度稀释度 孔数孔数 CPE孔数孔数 无无CPE孔数孔数 所占的所占的% 10-1 8 0 27 0 100（27/27） 10 -2 8

4、0 19 0 100（19/19） 10 -3 7 1 11 1 91.6 （11/12） 10 -4 3 5 4 6 40（4/10） 10 -5 1 7 1 13 0.7（1/14） 10 -6 0 8 0 21 0（0/21） Reed-Reed-MuenchMuench法计算法计算CCIDCCID5050CPE(阳性)孔累计数由下向上累积无CPE(阴性)孔累计数由上向下累积(难点、重点)CCID50(难点、重点) Use of Reed & Muench method (if 50 ul of virus dilution is added to each well)Karber法计算

5、法计算CCID50 病毒液稀释度病毒液稀释度 出现出现CPECPE孔的比率孔的比率10-1 8/8=1 10-2 8/8=110-3 7/8=0.87510-4 3/8=0.37510-5 1/8=0.125 10-6 0/8=0(难点、重点)lgCCIDlgCCID5050=L+d(s-0.5)=L+d(s-0.5)L: L: 病毒的最低稀释倍数的对数病毒的最低稀释倍数的对数 L=lg10L=lg10-1 -1 = -1= -1d d：稀释系数，即组距：稀释系数，即组距 d=lg10d=lg10-1 -1 = -1= -1S S：CPE(CPE(阳性阳性) )孔比率总和孔比率总和lgCCID

6、lgCCID5050=(-1) + (-1)=(-1) + (-1)(3.375-0.5)(3.375-0.5) =-3.875 =-3.875 CCID CCID5050=10=10-3.875-3.875/0.1ml /0.1ml IDID50 50 和和 LDLD50 50 的计算与的计算与CCIDCCID5050完全相同完全相同( (掌握掌握) )lgCCIDlgCCID5050=L+d(s-0.5)=L+d(s-0.5)uIDID50 50 计算，计算，S S：感染比率总和；：感染比率总和；uLDLD50 50 计算，计算，S S：死亡比率总和；：死亡比率总和；(掌握掌握)血凝试验的基本原理血凝试验的基本原理(掌握掌握)红细胞凝集现象红细胞凝集现象( (血凝现象血凝现象) )红细胞凝集抑制红细胞凝集抑制 (红细胞与抗体结合，失去血凝)血凝滴度血凝滴度/ /血凝单位血凝单位血凝试验测定病毒滴度血凝试验测定病毒滴度干扰滴定测定病毒滴度干扰滴定测定病毒滴度小结小结主要介绍空斑形成单位法、主要介绍空斑形成单位法、50%终点法、血凝试终点法、血凝试验和干扰滴定法测定病毒滴度的原理及其方法；验和干扰滴定法测定病毒滴度的原理及其方法；重点要掌握空斑形成单位法、重点要掌握空斑形成单位法、50%终点法测定病终点法