简明微生物工程

1、 简明微生物工程微 生 物 工 程包括三个部分：微生物工程原理、微生物工程下游加工工程、微生物工程生产设备。第一章 微生物工程概论 1.第二代微生物发酵技术深层培养技术deep culture 又称沉没培养法。有时也称液体培养法。在深层的液体培养中进行的一种发酵培养方法。操作时将无菌空气通入容器中，不断搅拌，使微生物充分与氧气接触而迅速繁殖。占地面积小，劳动力省，产量高，适合于机械化和自动化生产。适用于需氧性微生物。 2.半合成抗生素：某些天然抗生素在去侧链后，可用化学合成法接上新的侧链而改变原有抗菌谱或其它特性，这样的抗生素就被称为半合成抗生素。 3.微生物工程的应用（在哪些领域的有应用并举

2、例）1） 微生物工程在食品工业中的应用： 含醇饮料：葡萄酒、果酒、黄酒、白酒、啤酒、白兰地、威士忌、伏特加、金酒、香槟酒、朗姆酒等。 传统调味品及发酵食品：酱、酱油、醋、豆鼓、豆腐乳、饴糖等 发酵乳制品：奶酒、干酪、酸奶等；用近代发酵或酶反应技术生产的食品原料：葡萄糖、麦芽糖、果葡糖浆、甘露糖醇、脂肪等。 食品添加剂：面包酵母、味精、赖氨酸、柠檬酸、红曲(色素)、甜味肽、肌苷酸和鸟苷酸、右旋糖酐葡聚糖和茁霉多糖、葡萄糖氧化酶和异维生素C、乳链菌肽（食用防腐刘)、匹马霉素(食品保护剂)。 新型发酵饮料：活性乳酸饮料2）微生物工程在医药卫生中的应用 （1）抗生素：6000多种，绝大多数是微生物产生

3、的。抗细菌抗生素：青霉素、金霉素、红霉素等等。抗真菌抗生素：制霉菌素、两性霉素、灰黄霉素等等。抗原虫抗生素：烟古霉素、古曲霉素等。抗肿瘤抗生素：放线菌素、丝裂霉素、内瘤霉素 （2）氨基酸：氨基酸在医药中主要用于生产氨基酸大输液。可经发酵获得的氨基酸有谷氨酸、赖氨酸等。可用酶法获得的氨基酸有天门冬氨酸、丙氨酸等。（3）维生素：目前可用生物技术生产的维生素或其中间产物有维生素B2、维生素B12、维生素c的前体、类胡萝卜素、维生素D2的前体等。（4）甾体激素：可的松、氢化可的松、泼尼松、强的松龙、肤氢松、地塞米松、确安舒松等甾体激素化学合成过程中，有若干步是用微生物的生物转化来完成的。 （5）生物制

4、品：生物制品是指含抗原的制品，被用于预防、诊断或治疗传染病。由减毒或死的病毒或立克次氏体制造的疫苗，如牛痘和斑疹伤寒疫苗；（6）治疗用酶： 如蛋白酶和核酸酶可用于加速去除坏死组织、脓汁、分泌液、血肿；胃蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶可帮助消化等等。（7）酶抑制剂淀粉酶抑制剂可治糖尿病；抑肽素(蛋白质抑制剂)可用于治疗胃溃疡；多巴丁有降血压作用。3.微生物工程在轻工业中的应用主要是用于轻工业及其食品工业中的酶：糖酶：蛋白酶：加入洗涤剂等果胶酶：果汁或果酒的澄清等脂肪酶：降解脂肪为甘油和有机酸凝乳酶：奶酪过氧化氢酶：将双氧水分解4.微生物工程在化工能源产品中的应用利用发酵、生物转化或酶法生产下列产品：烷烃

5、：甲烷醇及溶剂： 乙醇、甘油(丙三解)等有机酸：醋酸、丙酸等多糖：右旋糖酐、黄原胶等。清洁能源：氢气等。5.微生物工程在农业中的应用（1）生物农药：微生物杀虫剂、防治病害如杀稻瘟菌素等。（2）生物除草剂：利用微生物产生的环己酰胺、谷氨酰胺合成酶等除草；（3）生物增产剂：赤霉素是一种能促种子萌芽、植株助长的植物生产素。还有固氮菌、钾细菌、磷细菌、抗生菌制剂作为辅助肥料及抗菌增产剂。（4）食用菌和药用真菌：主要品种有蘑菇、草菇、香菇、猴头菌、灵芝银耳、木耳、冬虫夏草等。6.微生物工程在环境保护中的应用自然界本身就存在着碳和氮的循环，而微生物在对生物物质的排泄物及尸体的分解起着重要的作用。厌气发酵法

6、：如沼气发酵；好气发酵法：如活性污泥对工业和生活污水处理；7.微生物工程在细菌冶金中的应用利用化能自养细菌如铁细菌、硫化细菌等把铁氧化为高铁，将合硫金属矿石(一般采用贫矿)中的金属离子形成硫酸盐而释放出来。此法浸取的金属有铜、钴、锌、铅、铀等8.微生物工程在高技术研究中的应用如基因工程中用的限制性内切酶、连结酶、DNA探针等；医学诊断或工业过程检测用的生物传感器(酶或微生物电极) 、生物芯片(blochip）等。第二章 生产菌种的来源微生物工程的工业生产三个要素：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备，其中优良的菌种是最重要的。1.富集培养：又称增殖培养，就是利用不同微生物生长对环境和培

7、养基的特殊要求，设计选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适环境中大量繁殖，由原来自然条件下的劣势种变为人工环境下的优势种，以利于分离。2.一般菌种分离纯化和筛选步骤如下： 标本采集 标本材料的预处理富集培养 菌种初筛菌种复筛性能鉴定 菌种保藏。3.菌种的分离1） 施加选择性压力分离法2） 随机分离方法：（1. 抗生素产生菌的分离、2. 抗肿瘤药物产生菌的分离、3. 酶抑制剂产生菌的分离、4. 生长因子产生菌的分离、5. 多糖产生菌的分离）第三章 优良菌种选育 自然选育：在生产程中，不经人工处理，利用微生物的自然突变而进行菌种筛的过程。 杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经吻合或

8、接合，使遗传物质重新组合，从中分离和筛选出具有新性状的菌株。 准性生殖：所谓准性生殖是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。准性生殖的整个过程包括三个相互联系的阶段，即异核体的形成，二倍体的形成，体细胞重组。 1.诱变选育诱变育种能有效提高菌种生产能力诱变育种的原理：诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染色体畸变和点突变二大类。（知道提高质粒稳定性的方法有哪些）第4章 菌种保藏的原理和方法 要创造适于微生物休眠的环境，主要是通过降低培养基营养成分（寡营养）、低温、干燥和缺氧四个阶段。 1.斜面低温保藏法：将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，待菌种充分生长后，便可放在4左右的冰箱内保藏。细

9、菌、酵母菌、放线菌和霉菌都可使用这.保藏方法。保存期为3-6个月。原理：低温下，微生物代谢. 2.砂土管保藏法：适合于产孢子或芽胞的微生物。一般保存期为2年左右，有的可达十几十年。原理：干燥，寡营养。 3.真空冷冻干燥保藏法：加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。原理：干燥，低温。 4.液氮保藏法：将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（ -196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。对一些不产孢子的菌丝体用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法。其保存期最长。原理：低温 5.悬液保藏法（寡营养保藏）：将微生物

10、悬浮在不含养分的溶液中，如水、缓冲液、生理盐水，室温保藏，一般为一年。适用于丝状状真菌、酵母及肠道细菌。原理：寡营养 6.低温保藏法：-20, -40, -80低温冰箱保藏。 7.石蜡油封存法：向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中此法可适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。原理：低温、缺氧 第5章 微生物的代谢调节和代谢工程 1.酶促调节的方式包括酶活性的调节和酶合成调节两大类。 酶活性调节包括：酶的激活作用和酶的抑制作用。酶活性调节的机制：有变构调节理论、化学修饰作用、缔合与解离、竞争性抑制等。酶合成调节

11、的类型：包括诱导和阻遏两种类型。阻遏：是在某种物质作用下导致某种酶合成停止或合成速率降低的现象。诱导：是指在某种化合物作用下，导致某种酶合成或合成速率提高的现象。酶合成的诱导作用 在微生物里，酶可以分成诱导酶与组成酶两大类。组成酶：是机体内一类不依赖于酶的底物或底物结构类似物的存在而合成的酶,如：EMP途径的一些酶。诱导酶(又称适应酶)：是一类依赖于底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：乳糖酶。2.酶量的调节与酶活调节的区别： 区别：酶活性调节:是对现有的酶在活性变化上进行调节，它不会涉及酶量的变化；酶量的调节:不涉及现有酶活性的变化，只是通过影响酶合成或酶合成速率以控制酶量变化，达到控制

12、代谢过程的目的。从调节作用的特点上看:酶活性调节的效果既及时又迅速，但由于酶量调节涉及到酶蛋白合成，它调节的效果相应地来得慢。葡萄糖效应：分解代谢产物阻遏是在研究混合碳源对微生物生长的影响时发现的。发现葡萄糖能够抑制其他糖的利用，只有在葡萄糖利用完以后，才开始利用其它的糖。在利用其它糖时，有一生长停滞期，是利用第二种糖的酶合成时期。这种酶诱导的阻遏现象最初以为只限于葡萄糖，因而被称为葡萄糖效应。组成突变株：通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，都可达到此目的。 这样的突变株称为组成型突变株。3.人工控制代谢的手段（代谢调控）：控制发

13、酵条件（生物化学方法）；改变微生物遗传特性(遗传学方法）；改变细胞膜透性； 4.前体：是指加入到发酵培养基中的某些化合物，能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具促进产物合成的作用。 诱导物：许多与蛋白质、糖类或其他物质降解有关的酶类都是诱导酶，在发酵过程中加入相应的底物作为诱导物。 前体与诱导物的区别：1. 有时难于区分促进作用是诱导物的作用还是前体的作用。2.一般，可把那些能在生长期内、生产期前促进产物合成的化合物看做诱导物，而前体往往只在生产期内起作用。3.另外，诱导物可以被非前体的结构类似物取代。 5.初级代谢与次级代谢的概念及代谢产物： 初级代谢：是为生物提供能

14、量、合成中间体及其关键大分子的各种相互关联的代谢网络（包括分解与合成） ，对菌的生长是必需的。初级代谢产物有单糖、核苷酸、脂肪酸、蛋白质、核酸、多糖、脂类等等。次级代谢：次级代谢主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢物对菌的生长不是必需的，对其生命活动可能具有某种意义，通常是在生长后期开始形成的。次级代谢产物主要有抗生素，青霉素、链霉素、生物碱、维生素、色素、毒素、生长刺激素等。第6章 培养基1. 按其他特殊用途划分 ：1.孢子培养基 、2.种子培养基 、3.发酵培养基2. 孢子培养基：是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是：能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这培养

15、基不易引起菌种发生变质。 种子培养基：种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。 发酵培养基：酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它即要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好菌体能迅速合成所需产物。3. 培养基设计的步骤： 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分； 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法如正交实验设计、响面分析法。4. 培养基成分：碳源、氮源、无机盐、微量元

16、素、特殊生长因子、促进剂、前体和水等几大类。5. 补料的作用：1）丰富培养基，避免了菌体过早衰老，使产物早衰老，使产物合成的旺盛期延长2）控制了pH值和代谢方向； 3）改善了通气效果，避免了菌体生长可能受到的抑制；4）补料还能补足发酵酵液的体积补料的物质：碳、氮、水及其他。 第七章 种子扩大培养斜第8章 发酵工艺控制表现在哪五个方面，影响这五个条件的因素有哪些，又如何去控制？ 影响供氧因素：（主要为前两个因素）搅拌、空气流量、发酵液性质、微生物生长、消泡剂、离子强度泡沫对发酵的危害：1) 降低了发酵罐的装料系数。 2)增加了菌群的非均一性 3)增加了污染杂菌的机会 4)导致产物的损失 5)消沫

17、剂的加入将给提取工序带来困难。泡沫的产生与通气、搅拌的剧烈程度有关。泡沫的消除与防止：泡沫控制的方法可归纳为机械消沫和消沫剂消沫两大类。也有从微生物本身的特性着手，防止泡沫的形成，如选育或混养。 第八章 微生物反应动力学 反应动力学：研究反应速度变化规律的学科。即研究各种环境因素与微生物代谢活动之间相互作用随时间而而变化的规律。 发酵动力学：研究各种发酵过程变量在活细胞的作用下变化的规律，以及各种发酵条件对这些变量变化速度的影响。并以数学、工程学的原理，定量描述。 发酵过程按进行过程有三种方式：分批发酵（与生长相关型、与生长部分相关型、与生长不相关型)、补料分批发酵、连续发酵 稀释率D：流量与

18、培养液体积之比，其含义是是指单位时间内加入的培养基体积占发酵罐内培养基体积的分率。dX/dt ( -D ) X 单级连续培养中进入稳定状态后，细胞的与D相等。 对数生长期：在这一阶段中，由于培养基营养物质丰富，有毒代谢物少，细胞生长不受限制，因此细胞浓度随培养时间呈指数增长，细胞浓度的变化率与细胞浓度成正比：dX/dt ( -D ) X 比生长速率与微生物种类、培养温度、pH、培养基成分及限制性基质浓度等因素有关。 连续发酵：培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒

19、定的比生长速率）下生长的发酵方式。 补料分批发酵：补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。 分批发酵：分批培养指的是一次投料，一次接种，一次收获的间歇培养方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖 微生物下游加工工程概论 1.微生物工程下游加工工程的特点：.培养液中所含欲提取的生物物质浓度很低，杂质含量却很高。.下游加工过程的代价昂贵，回收率不高；.欲提取的生物物质通常很不稳定。遇热、极端pH、有机溶剂会引起失活或分解。发酵或培养都是分批操作、生物变异性大

20、，各批发酵液不尽相同，这就要求下游加工有一定的弹性，特别是对染菌的批号，也要能处理。 2.般说来下游加工过程可分为4个阶段：1)培养液(发酵液)的预处理和固液分离；2)初步纯化(提取)；3)高度纯化(精制)；4)成品加工。 第12章 发酵液的预处理和过虑1. 发酵液处理的目的：1）改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；2）尽可能使产物转入便于以后处理的相中（多数是液相）；3）能够除去部分杂质。2.高价无机离子的去除方法：Ca2：草酸 Mg2：Na5P3O10三聚磷酸钠 Fe3：黄血盐3. 可溶性杂蛋白的去除方法：等电点、变性、利用吸附作用除去蛋白质4. 凝聚：是在中性盐作用下，由

21、于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。这种方法形成的颗粒较小，不能有效分离。 絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。5. 改善过滤性能的方法：等电点、变性、吸附、凝聚和絮凝、加入助滤剂、直接在发酵液中形成填充-凝固剂、酶解作用6. 细胞破碎的阻力与方法：1） 细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。2） 机械方法：球磨机、高压匀浆器（常用机器）、X-press法、超声波破碎 非机械方法：酶解、渗透压冲击

22、、冻结和融化、干燥法、化学法破碎方法的选择：选择合适的破碎方法需要考虑下列因素：1）细胞的数量； 2）所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性；3）要达到的破碎程度及破碎所必要的速度，尽可能采用最温和的方法； 4）具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。第19章 培养基灭菌及其灭菌 1.湿热灭菌 即利用饱和蒸汽进行灭菌。优点：1）蒸汽来源容易，操作费用低，本身无 毒；2）蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；3）蒸汽有很大的潜热；4）操作方便，易管理。2. 培养基灭菌温度的选择：达到要求的无菌程度 (取N=10-3)。（必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基的破坏降至最低的工艺条件。一般情况下，培养基灭菌采用高温短时间的方法，以减少营养成分的破坏。）3.培养基的分批灭菌：将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进