第一章_植物工厂化育苗的工厂与设备

1、植物工厂化育苗的工厂与设备2第一节第一节 实验室实验室一一 、实验室、实验室 植物组织培养是在严格无菌的条件下进行植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。湿度等培养条件。 实验室设计原则：实验室设计原则：保证无菌操作，达到工保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。作方便，防止污染。准备室准备室培养室培养室温温 室室Text实验室实验室接种室接种室接种室接种室实验室组成：实验室组成：4基本实验室布局平面图基本实验室布局平面图实实

2、验验台台搁搁架架培养架培养架培养架培养架培培养养架架培培养养架架药药品品及及仪仪器器柜柜无菌台无菌台无菌台无菌台搁搁架架拉拉窗窗冰箱冰箱 搁搁 架架水槽水槽电电炉炉门门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室准备室缓冲室缓冲室无菌室无菌室培养室培养室准备实验室准备实验室5缓冲室缓冲室6无菌室无菌室7无菌室无菌室89 9无菌室无菌室10101111培养架培养架1212培养室培养室13温室温室1414第二节第二节 仪器与设备仪器与设备15冰箱冰箱酸度计酸度计电炉电炉1.基本设备基本设备17天平天平纯水器纯水器18搅拌器搅拌器19蒸汽压力灭菌锅蒸汽压力灭菌锅2.灭菌设备灭菌设备20212222过滤灭菌

3、装置过滤灭菌装置2323紫外灭菌灯管紫外灭菌灯管3、无菌操作设备、无菌操作设备 超净工作台超净工作台242525超净工作台超净工作台无菌接种箱无菌接种箱26恒温振荡培养箱恒温振荡培养箱 光照培养箱光照培养箱 4、培养设备、培养设备 27摇摇 床床285、细胞学鉴定设备、细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜29倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜光学显微镜301、玻璃器皿、玻璃器皿三、培养器皿及实验用具三、培养器皿及实验用具培养皿培养皿三角瓶三角瓶培养瓶培养瓶2、金属材质用具、金属材质用具镊子镊子 解剖刀解剖刀接种针接种针32接种盘接种盘3333

4、第二节第二节 培养基培养基 培养基是决定植物组织培养成败的关键因素培养基是决定植物组织培养成败的关键因素之一。之一。 培养基的构成要素通常可分为：培养基的构成要素通常可分为：水分；水分；无机盐类；有机营养成分；植物生长调节物无机盐类；有机营养成分；植物生长调节物质；天热物质；质；天热物质； pH；凝固剂；凝固剂等。等。 3434 构成培养基的绝大部分组分为水分。构成培养基的绝大部分组分为水分。 在研究上在研究上，常用蒸馏水来配制培养基，而最，常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该是纯水。为理想的水应该是纯水。（一）水分（一）水分大量营养元素大量营养元素：占干物质重量的：占干物质重量的0.1

5、%以上；以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等等9种种微量营养元素微量营养元素：占干物质重量的：占干物质重量的0.1%以下以下 有的只含有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等等7种种按照国际植物生理协会的建议：按照国际植物生理协会的建议： 所需浓度所需浓度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素为大量元素的元素为大量元素 所需浓度所需浓度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素为微量元素的元素为微量元素35（二）矿质元素（二）矿质元素1.大量元素大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱

6、等的组成成分，在植物生命活动中占有重生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。要的位置。P是磷脂的主要成分。培养基中常用是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。等。 K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。密切关系。36MgMg、S S、CaCa是叶绿素的组成成分，又是激酶的是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S S是含是含S S氨基酸的蛋白质的组成成分。氨基酸的蛋白质的组成成分。CaCa是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质是构成细胞壁的成分，

7、对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，膜结构有显著作用，此外，CaCa及钙调素在细胞及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。信号转导中起重要作用。2、微量元素、微量元素 在微量元素中，在微量元素中，铁铁的使用最大的使用最大 ： 一些氧化酶的组成成分一些氧化酶的组成成分 叶绿素形成的必要条件叶绿素形成的必要条件 使用乙二胺四乙酸铁（使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-FeEDTA-Fe）鳌合）鳌合物防止铁的沉淀物防止铁的沉淀38 硼硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系 铜铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长长 锰锰参与植

8、物的光合、呼吸代谢参与植物的光合、呼吸代谢 钼钼参与氮素的代谢参与氮素的代谢 氯氯是光合作用水光解的活化剂是光合作用水光解的活化剂 微量元素的主要作用是作为微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活酶的辅助因子或激活剂剂参与代谢的调节。参与代谢的调节。39（三）有机营养成分（三）有机营养成分 培养基中的有机营养成分包括培养基中的有机营养成分包括糖类物质糖类物质 、维生素类维生素类 和氨基酸类。和氨基酸类。1. 1.碳源碳源 碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以酸，以糖类糖类物质最重要。物质最重要。 糖类物质特点：糖类物质特点： 具有热易变的性质具有热易

9、变的性质 利于吸收和利用利于吸收和利用 使用浓度一般在使用浓度一般在2%2%5%5% 提供能源和调节渗透压提供能源和调节渗透压412. 2.维生素类维生素类 以各种以各种辅酶辅酶的形式存在的形式存在 参与多种代谢活动参与多种代谢活动 对生长，分化等有很好的促进作用对生长，分化等有很好的促进作用 主要分为主要分为脂溶性维生素脂溶性维生素和和水溶性维生素水溶性维生素 常用维生素有常用维生素有V VB1B1和和V VB6B6 42 蛋白质的组成成分蛋白质的组成成分 有机氮源有机氮源 可直接被细胞吸收利用可直接被细胞吸收利用 培养基中常用的是培养基中常用的是甘氨酸甘氨酸 3. 3.氨基酸氨基酸434.

10、 4.肌醇肌醇 环己六醇环己六醇 细胞壁的构建材料细胞壁的构建材料 参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动生理活动 促进活性物质发挥作用促进活性物质发挥作用44（四）植物生长调节剂（四）植物生长调节剂 植物生长调节剂不仅可以植物生长调节剂不仅可以促进植物组织的促进植物组织的脱分化和形成愈伤组织，还可以诱导不定芽、不脱分化和形成愈伤组织，还可以诱导不定芽、不定胚的形成。定胚的形成。 最常用的有最常用的有生长素和细胞分裂素生长素和细胞分裂素，有时也，有时也会用到会用到赤霉素和脱落酸赤霉素和脱落酸。 1. 1.生长素类生长素类 促进细胞伸长和分裂促进细胞伸长

11、和分裂 促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实长休眠、顶端优势、单性结实 诱导愈伤组织形成诱导愈伤组织形成 溶于溶于95%95%酒精或酒精或0.1mol/L0.1mol/L的的NaOHNaOH中，后者的中，后者的溶解效果更好溶解效果更好 常用的生长素：常用的生长素： IAA(IAA(吲哆乙酸吲哆乙酸) ) NAA ( NAA (萘乙酸萘乙酸) ) 2,4-D(2,4 2,4-D(2,4，二氯苯氧乙酸，二氯苯氧乙酸) ) IBA( IBA(吲哆丁酸吲哆丁酸) )462. 2.细胞分裂素类细胞分裂素类 促进细胞分裂和分化促进细胞分裂和分化

12、 诱导胚状体和不定芽的形成诱导胚状体和不定芽的形成 延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成 用于离体成花的调控用于离体成花的调控 溶于溶于0.50.5-1.0mol/L1.0mol/L的盐酸或稀薄的的盐酸或稀薄的NaOHNaOH中中 常用的细胞分裂素：常用的细胞分裂素： KT (KT (激动素激动素) ) BA(6- BA(6-卞基腺嘌呤卞基腺嘌呤) ) 2-ip( 2-ip(异戊烯氨基嘌呤异戊烯氨基嘌呤) ) ZT ZT（玉米素）（玉米素）473.赤霉素类和脱落酸赤霉素类和脱落酸A、赤霉素类、赤霉素类 组织培养中不常使用组织培养中不常使用 加速细胞的伸长生长加速细胞

13、的伸长生长 促进细胞的分裂促进细胞的分裂 主要是主要是GA3 B、脱落酸、脱落酸 抑制细胞分裂和伸长抑制细胞分裂和伸长 促进脱落和衰老促进脱落和衰老 促进休眠和提高抗逆能力促进休眠和提高抗逆能力GA3脱落酸脱落酸48 促进某些愈伤组织和器官的生长促进某些愈伤组织和器官的生长 化学成分不明、复杂化学成分不明、复杂 天然营养混合物天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物（五）天然复合物（五）天然复合物49 50（六）（六）pH 在灭菌前，培养基的在灭菌前，培养基的pH一般被调节一般被调节到到5.06.0 之间，最常用的之间，最常用的pH为为5.75.8

14、。 pH过高时，培养基会变硬；过高时，培养基会变硬；pH过过低时，则影响培养基的凝固低时，则影响培养基的凝固。50（七）凝固剂（七）凝固剂琼脂是使用最普遍的凝固剂琼脂是使用最普遍的凝固剂用量一般在用量一般在6-10g/L之间之间颜色以浅、透明度高好，洁颜色以浅、透明度高好，洁净为上品净为上品 除了琼脂外，在组织培养除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。等。51（八）其他添加物（八）其他添加物521. 1.活性炭活性炭 吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质 抑制外植体褐变抑制外植体褐变 防止玻璃苗的产生防止玻璃苗的产生

15、促进培养物生长和分化促进培养物生长和分化 促进生根促进生根 2.抗生素抗生素 防止外植体内生菌造成的污染防止外植体内生菌造成的污染活性炭活性炭5353二、培养基的基本类型二、培养基的基本类型培养基形态不同：培养基形态不同：固体培养基、液体培养基固体培养基、液体培养基培养过程不同：培养过程不同：初代培养基、继代培养基初代培养基、继代培养基其作用不同：其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基诱导培养基、增殖培养基、生根培养基 营养水平不同：营养水平不同：基本培养基、完全培养基基本培养基、完全培养基（一）培养基的种类（一）培养基的种类成分和浓度不同：成分和浓度不同：含盐量较高的培养基、硝酸钾含

16、量含盐量较高的培养基、硝酸钾含量较高的培养基、中等无机盐含量的培养基、低无机盐含较高的培养基、中等无机盐含量的培养基、低无机盐含量的培养基量的培养基54541、MS培养基培养基 无机盐浓度高无机盐浓度高 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐 含有一定数量的铵盐含有一定数量的铵盐 营养丰富营养丰富 不需要添加更多的有机附加物不需要添加更多的有机附加物（二）几种常见培养基的特点（二）几种常见培养基的特点2、White培养基培养基 1943年由年由White为培养番茄根尖而设计为培养番茄根尖而设计 1963年作了改良，提高年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素的浓度和增加硼

17、元素 无机盐浓度较低无机盐浓度较低 使用广泛使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果在生根培养、胚胎培养中有良好的效果大量元素大量元素含量含量微量元素微量元素含含量量铁盐铁盐含量含量有机物有机物含含量量其他其他含量含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇肌醇100蔗糖蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0烟酸烟酸0.3琼脂琼脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0盐酸硫胺盐酸硫胺素素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001盐酸吡哆盐酸吡哆辛辛0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸甘氨

18、酸3Na2SO4200附表：附表：White培养基培养基563、B5培养基培养基 1968年由年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素较高的硝酸盐和盐酸硫胺素组成成分组成成分 数量数量(mg/l）组成成分组成成分 数量数量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇肌醇100 H3BO4 3.0 烟酸烟酸 1.0 MnSO44H2O 1

19、0 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激动素激动素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 盐酸硫铵盐酸硫铵 10 Na2-EDTA37.3 B5培养基的组成和配方培养基的组成和配方574、N6培养基培养基 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KNO3和和(NH4)2SO4含量高，不含钼含量高，不含钼组成成分组成成分 数量数量(mg/l) 组成成分组成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27

20、.8 MgSO47H2O 185蔗糖蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 烟酸烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 盐酸硫铵盐酸硫铵 1.0 ZnSO47H2O 1.5N6培养基组成及配方培养基组成及配方58第三章第三章 培养基和培养条件培养基和培养条件 为了减少工作量，减小误差，最方便为了减少工作量，减小误差，最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母的方法是预先配制好不同组分的培养基母液。液。 601.配制母液原则配制母液原则 相同类型的试剂混合；相同类型的试剂混

21、合； 易形成沉淀的药品分开；易形成沉淀的药品分开； 母液浓度要适宜；母液浓度要适宜； 用量要认真计算和核对；用量要认真计算和核对； 药品要准确称量。药品要准确称量。 61 2.MS培养基母液的配制培养基母液的配制 62 MS培养基母液根据试剂特性通常配成培养基母液根据试剂特性通常配成五种母五种母液液，即大量元素母液（即大量元素母液（10或或20倍）、微量元素母液倍）、微量元素母液（100或或1000倍）、倍）、Fe盐（盐（100倍）、倍）、Ca盐（盐（50倍）、倍）、有机物（有机物（100倍）倍）。 633.激素母液的配制激素母液的配制 64生长素类、赤霉素类及脱落酸等用生长素类、赤霉素类及脱

22、落酸等用95乙醇溶解；乙醇溶解；细胞分裂素类用细胞分裂素类用1N HCl或或1N NaOH溶解。溶解。 通常激素母液浓度生长素类为通常激素母液浓度生长素类为0.10.5 mg/ml, 细胞分裂素母液浓度为细胞分裂素母液浓度为0.21.0 mg/ml.二、培养基的配制二、培养基的配制 水水药品药品糖糖琼脂琼脂混合混合加热加热溶解溶解调整调整pH玻璃器皿玻璃器皿水洗水洗干燥干燥分装分装灭菌灭菌封口封口冷却冷却接种接种1、取出母液并按顺序放好。将洁净的各种玻璃、取出母液并按顺序放好。将洁净的各种玻璃器皿如量筒、容量瓶、移液管、移液枪和玻璃器皿如量筒、容量瓶、移液管、移液枪和玻璃棒等放在指定位置；棒等

23、放在指定位置；2、取一只容量瓶，放入配制培养基总量的、取一只容量瓶，放入配制培养基总量的1/3左左右纯水，将母液按顺序加入，并不断搅拌；右纯水，将母液按顺序加入，并不断搅拌；3、加入植物生长调节剂后定容；、加入植物生长调节剂后定容；培养基的配制的培养基的配制的具体步骤具体步骤：4、将定容的培养基倒入容器中，加入蔗糖和琼脂，、将定容的培养基倒入容器中，加入蔗糖和琼脂，并加热使其完全溶解；并加热使其完全溶解；5、调整、调整pH；6、将培养基分装倒培养器皿中，封好瓶口；、将培养基分装倒培养器皿中，封好瓶口；7、灭菌，用高压锅灭菌（、灭菌，用高压锅灭菌（121，1520min）或过）或过滤除菌；滤除菌

24、；8、灭菌后待高压锅温度下降到、灭菌后待高压锅温度下降到50以下时，便可以以下时，便可以取出、冷却凝固后待用。取出、冷却凝固后待用。 6869三、培养基的保存三、培养基的保存 配制好的培养基一般要在室温、黑暗且清洁的地方配制好的培养基一般要在室温、黑暗且清洁的地方放置放置35天再使用天再使用。 保存时间太久，培养基可能会保存时间太久，培养基可能会污染、脱水、易分解的污染、脱水、易分解的成分会发生分解，培养基成分会发生较大的变化。成分会发生分解，培养基成分会发生较大的变化。 每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。显标签。 四、培养条件

25、四、培养条件71温度温度光照光照湿度湿度气体气体培养基的渗透压培养基的渗透压pH值值植物材料一般最适温度在植物材料一般最适温度在252之间之间环境条件环境条件光强：光强： 10006000 lx一般情况下，培养器内相对湿度应达一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在培养室内环境的相对湿度在70%80% 氧气是愈伤组织生长所必需的氧气是愈伤组织生长所必需的 调节渗透压常常从糖入手调节渗透压常常从糖入手 植物组织培养时培养基的植物组织培养时培养基的pH值大多在值大多在5.06.5光质：光质：影响细胞分裂和器官分化影响细胞分裂和器官分化光周期：光周期：光照光照16h，黑暗，

26、黑暗8h 第三节第三节 基本操作基本操作一、洗涤一、洗涤1、玻璃器皿洗涤、玻璃器皿洗涤新购置玻新购置玻璃器皿璃器皿1%稀稀HCl浸渍浸渍12h洗衣粉洗衣粉洗涤洗涤清水清水冲洗冲洗晾干晾干备用备用已用过的已用过的玻璃器皿玻璃器皿2、塑料用品洗涤、塑料用品洗涤塑料器皿塑料器皿2%NaOH浸泡浸泡12h清水清水冲洗冲洗2%5%盐盐酸浸泡酸浸泡30min清水清水冲洗冲洗蒸馏水蒸馏水冲洗冲洗晾干备用晾干备用733、金属用品洗涤、金属用品洗涤热洗衣粉水热洗衣粉水洗净洗净冲洗冲洗擦干擦干74751. 1.灭菌方法：灭菌方法：（1 1）物理方法：）物理方法： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过物理灭菌

27、干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等滤、离心、沉淀等（2 2）化学方法：）化学方法： 消毒剂、抗菌素灭菌消毒剂、抗菌素灭菌 75二、消毒灭菌二、消毒灭菌2、灭菌、灭菌（1）培养基灭菌：）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法高温高压湿热灭菌法 压力在压力在9.810410.8104Pa 温度在温度在121 灭菌灭菌2030min（2）玻璃器皿灭菌：）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌干热消毒灭菌76饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力温度（）饱和蒸汽压力温度（）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.

28、4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0001.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.677（3）塑料器皿灭菌：塑料器皿灭菌： 多采用多采用高压蒸汽消毒灭菌高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭菌：）金属用具灭菌：灼烧灭菌灼烧灭菌 浸入浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用（5）过滤灭菌：）过滤灭菌： 一些一些生长调节

29、剂生长调节剂，如，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素生素。 78（6）接种室灭菌）接种室灭菌空气消空气消毒灭菌毒灭菌接种室接种室超净工超净工作台作台紫外灯紫外灯照射照射70%75%的酒精擦洗的酒精擦洗培养材料培养材料的接种的接种紫外灯紫外灯照射照射79（7）外植体灭菌）外植体灭菌流水冲洗流水冲洗1020min或更长时间或更长时间70%75%酒精中浸泡酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞氯化汞液中浸泡液中浸泡10min左右左右蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗45次次在在10%的次氯酸钠、的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡饱和漂白粉浸泡30min左右左右备用备用80常用消毒剂消毒灭菌比较表常用消毒剂消毒灭菌比较表消毒剂使用浓度（%）去除难易消毒时间（min）效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗生素硝酸银9102饱和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易最易较难易中较难530530