细胞生物学教程

1、Information StoringThe revised central dogmaAccumulating mutationsReplication“Heavy” DNA“Hybrid” DNA“light” DNA “Hybrid” DNAOri(a) 枯草杆菌Ori(c) ColE 1Ori(b) R6K 质粒原核生物中特殊的复制类型原核生物中特殊的复制类型复制方式复制方式 Replication modesReplication eyes replication型复制Rolling circle replication滚环复制D-loop replicationD环复制Replic

2、ation eyesfor circular dsDNA原核生物的染色体和质粒，真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子Replication fork is the point atwhich strands of parental duplexDNA are separated so thatreplication can proceedRolling circle replication1968年年Gilbert提出滚环复制模型提出滚环复制模型:（1）共价延伸；共价延伸；（2）模板链和新合成的链分开）模板链和新合成的链分开;（3）不需）不需RNA引物，在正链引物，在正链3OH上延上延长长（

3、4）只有一个复制叉只有一个复制叉（5）形成多联体（）形成多联体（concatemer ）Rolling-Circle Replication滚环复制的电镜照片滚环复制的电镜照片A rolling circle appears as a circular moleculewith a linear tail by electron microscopy.哪些哪些DNA进行滚环复制进行滚环复制?噬菌体 X174 DNA噬菌体复制后期非洲爪蟾卵母细胞中rRNA基因的扩增F因子DNA的转移D-loop replicationDNA两条链的复制起点不在同一位置两条链的复制起点不在同一位置DNA两条链的复

4、制是高度不对称的，一条链两条链的复制是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代先复制，另一条链保持单链而被取代The D loop maintains anopening in mammalianmitochondrial DNA,which has separateorigins for the replicationof each strand.哪些哪些DNA进行进行D-环复制环复制?线粒体线粒体DNA叶绿体叶绿体DNA由于由于DNA的两的两条互补链方向相反，为使滞后链能条互补链方向相反，为使滞后链能与前导链被同一个与前导链被同一个DNA聚合酶聚合酶的不对称二聚体的不对称二聚体

5、所聚合，滞后链绕成了一个所聚合，滞后链绕成了一个突型环构象突型环构象。拓扑异构酶拓扑异构酶：使使DNA一条链发生断裂和再一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。性转录区，同转录有关。拓扑异构酶拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新该酶能暂时性地切断和重新连接双链连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。分子。同复制有关。UnwoundParentalDuplexOver-Woundregion第三节第三节 原核生物原核生物DNA复制复制 (DNA replication in Pr

6、okaryote) （1） OriC in E. coli chromosomal DNA 1、大肠杆菌的大肠杆菌的DNA复制复制 四个四个9bp的重复序列的重复序列 dnaA结合位点结合位点 三个三个13bp的重复序列的重复序列若干若干GATC位点位点复制起始区的结构特点：复制起始区的结构特点：富含富含AT，这可能，这可能和双链易于解开起始复制和双链易于解开起始复制有关；有关；含有多个回文结构（含有多个回文结构（9 14 个个GATC ），），8 个个GATC较保守较保守具有具有 4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；复制起点具有 3 个 13bp 和 4 个

7、 9bp 的重复顺序GATCTNTTNTTTT TTATNCANADnaA 单体结合在 9bp 的重复顺序上13bp 9bp2040 个 DnaA 单体形成一个大的复合物在 13bp 重复顺序上 DNA 解链DnaB/DnaC 结合成复合体，产生了复制叉DnaBDnaBDnaC图 11-28 前引发涉及到系列蛋白的连续装配并导致 DNA 的解链表 11-4 在 OriC 上前引发所需的六种蛋白蛋白 功能对蛋白质的要求DnaA 结合于 9bp 重复顺序20-40 单体DnaB 提供解旋酶1-2 六聚体DnaC 和 DnaB 形成复合体六个单体HU组蛋白样蛋白，激发复合体形成5 个双体Gyrase

8、 旋转酶，解除正超螺旋，引入负超螺旋催化ssB 稳定单链化学剂量，四聚体活性复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、Dna A蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,Dan A蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4 、Dna B借助于水解ATP产生的能量在Dna C的帮助下沿5 3方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（Dna G蛋白）开始合成RNA引物。链的延长（冈崎片段的合成）真核生物的冈崎片段为：100-200bp原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp3后滞链5引发酶合成引物5

9、3 5 3RNA 引物RNA 引物3后滞链5 DNA pol 在引5冈崎片断3 物 3OH 延伸，形成冈崎片断3后滞链553 DNA pol切除引物，填补缺口后滞链553连接酶封闭缺口连接酶图 11-53 后滞链的合成RNA primingThe first few nucleotides atthe 5-end of Okazakifragments areribonucleotides. Hence,DNA synthesis is primedby RNA that is thenremoved before fragmentsare joined.E.coli的复制终止的复制终止终止区

10、域含有两对反向重复顺序（终止区域含有两对反向重复顺序（terE,D,A和和terC,B），位于相遇点的另一侧），位于相遇点的另一侧100Kb处。每一终止处。每一终止顺序对某一方向移动的复顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。制叉来说是特异的。ter顺序有一个顺序有一个23bp的区域，在体外可导致复制的的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性。终止，但其功能显示了一定的方向性。终止需要终止需要tus(terminus utilization substance)基因的基因的产物产物Tus(36kD) ，Tus 能识别能识别ter 保守顺序，保守顺序，具有抗具有抗解链活性解链活

11、性，阻止，阻止DnaB解链，使复制叉停止前进。解链，使复制叉停止前进。ter-Tus复合物可能通过抑制复合物可能通过抑制解旋酶解旋酶来实行终止。来实行终止。Tus蛋白与ter非对称地结合，并只在单向阻止复制Ter在在DNA上排列以创造出一种上排列以创造出一种“陷阱陷阱”,阻止阻止复制叉的移动。复制叉的移动。当任意一个复制叉碰到一个功能性当任意一个复制叉碰到一个功能性ter-Tus复合物时，就停止。而另一个复制叉碰到第复合物时，就停止。而另一个复制叉碰到第一个被阻止的复制叉时也停止前进。一个被阻止的复制叉时也停止前进。位于终止区内尚未复制的序列（位于终止区内尚未复制的序列（50-100 bp）以

12、修复合成的方式被填补。以修复合成的方式被填补。复制完成的复制完成的2个子代个子代DNA分子以连环体的形分子以连环体的形式锁在一起，去连环化需要拓扑异构酶式锁在一起，去连环化需要拓扑异构酶。复制的终止顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱大肠杆菌DNA复制的终止拓扑异构酶催化复制产物的解环23bp52bp 23bp61bp5 基因 11.1A1.1BA-T 丰富区基因 1.1 3TTATGCTGAGTGATATCTTATGCTGAGTGATATRnase 酶切位点图 11-40 T7 噬菌体复制起始区的结构T7噬菌体（双链线状双链线状DNA）的复制起始184 bp表 11-8 T7 DNA 合成所需的酶和

13、蛋白酶基因结构和功能RNA pol198.1KDa 单链，可能合成引物DNA pol584KDa，ssDNA35外切活性，有的聚合酶活性，组成 DNA po 亚基trxA宿主基因合成 12KDa，硫氧还蛋白(thioredoxin)，pol 亚基解旋酶458KDa 的产物三磷酸酯酶458KDa 的产物引发酶466KDa 的产物，识别 5GGGTC3或 5TGGTC3SSB2.5单链结合蛋白内切酶3降解宿主 DNA 用于合成5外切酶6同上连接酶1.3封闭缺口?二聚体二聚体3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHT7噬噬菌菌体体的的末末端端复复制制专一性核专一性核酸内切酶酸内切酶线状线状D

14、NA的末的末端复制问题端复制问题T7线状线状DNA复制终止复制终止的串联体模型的串联体模型IRIR长的发长的发夹结构夹结构 腺病毒腺病毒 DNA 复制起始复制起始G第四节第四节 真核生物真核生物DNA的复制的复制(DNA replication in Eukaryote) 1、 复制概况复制概况 a、多个复制元（、多个复制元（multiple replicon ），双向复制），双向复制 b、复制元相对较小、复制元相对较小(13-900kb), 复制速度较慢复制速度较慢,大大 约约 5005000bp/min （3000bp/min） 冈崎片段冈崎片段100200NTc、复制终止通过复制、复制终

15、止通过复制 叉的相遇而终止叉的相遇而终止 multiple replicon 例；果蝇例；果蝇 3500 replicons 平均平均 40Kb 酵母酵母 500 replicons 哺乳动物哺乳动物 平均平均100Kb 2、 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶 、五种五种 位置位置 核内核内 核内核内 核内核内 核内核内 线粒体线粒体 合成合成 与与引发引发 修复修复 合成合成 合成合成,修复修复 复制复制功能功能 酶酶结合结合 前导链前导链 后随链后随链35校校 NO NO Yes Yes Yes正活性正活性 4、 真核生物的复真核生物的复制起始受制起始受许可因子许可因子的控制的控制

16、5、 真核生物染色体真核生物染色体 DNA末端补齐模式末端补齐模式 (1) 端粒端粒DNA (Telomer) TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端序列高度重复的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (富含富含 G 链链) 3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (富含富含 C 链链) （2） 端粒酶（端粒酶（ Telomerase）1985. Carol Greider & Blackburn, 1986. Gottchling 四膜虫四膜虫 端粒酶端粒酶 （ telomerase ）将将T2G4 末端重复延伸末端重复延伸 游扑虫游扑虫 Telome

17、rase = RNA CAAAACCCC 链链 + 末端结合蛋白末端结合蛋白 （TBP） 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶a、核蛋白（、核蛋白（ ribonucleoprotein RNP）b、含约长、含约长150NT的的RNA，其中含，其中含 15 拷贝的拷贝的CxAy重复序列，重复序列， 是合成端粒是合成端粒T2G4的模板的模板c、延长的、延长的3-T2G4端端（一段（一段cDNA）作为）作为5-端端DNA合成的模板合成的模板（3） 补齐过程补齐过程 通过通过TG链的回折形成链的回折形成 发夹结构（发夹结构（GG氢键）氢键） 尺蠖模型尺蠖模型 实现端粒酶位置的实现端粒酶位置的 调整调整 G G

18、 hoogsteen 氢键氢键 三螺旋三螺旋DNA G链链 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C链链-A2C4- G链链 T2G4-TTGGGG t t g g g g t t gC链链-A2C4- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polorG链链 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C链链-A2C4- 实验表明人体细胞通过监测失去的端粒的重复数实验表明人体细胞通过监测失去的端粒的重复数而计数细胞分裂次数，当端粒长度下降到而

19、计数细胞分裂次数，当端粒长度下降到某一临界值某一临界值时，细胞终止分裂衰老、死亡时，细胞终止分裂衰老、死亡“多莉多莉”的衰老的衰老 研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命 XX XY why?研究推测端粒酶与肿瘤的关系研究推测端粒酶与肿瘤的关系 6、 真核生物复制过程中的核小体结构真核生物复制过程中的核小体结构 （1） 组蛋白的合成在细胞核中与组蛋白的合成在细胞核中与DNA复制同步进行复制同步进行 （2） 且组蛋白八聚体在且组蛋白八聚体在DNA复制时并不离开亲本复制时并不离开亲本 DNA链链 蛋白质合成抑制剂实验蛋白质合成抑制剂实验 所证实所证实 放线菌酮放线菌酮

20、cycloheximide （3） 组蛋白八聚体以全保留方式传给子代组蛋白八聚体以全保留方式传给子代 （4） 组蛋白八聚体与先导链结合组蛋白八聚体与先导链结合新老八聚体在子代链上的分布新老八聚体在子代链上的分布复制原点复制原点老老新新先导链先导链后随链后随链a、复制子的大小（、复制子的大小（Sizes of replicon）:Yeast or fly平均平均 40 kbMammals 平均平均 100 kbProkaryotic DNA: 1000 kbb、冈崎片段、冈崎片段(Okazaki fragments):Prokaryotic DNA:1000-2000 ntEukaryotic

21、DNA:100-200 ntc、复制速度（、复制速度（Rate of replication）:Eukaryotic DNA:ca. 3,000bp/min (50/sec)Prokaryotic DNA:50,000bp/min (900/sec)原核生物和真核生物原核生物和真核生物DNADNA复制的比较复制的比较 1. Semi-conservative replication2. Semi-discontinuous repliction3. DNA helicase, Ssb4. RNA priming5. 校正阅读（校正阅读（Proofreading）1. 复制起点（单、多）2. 复

22、制子（大小、多少）3. 复制起始的许可因子的控制 （复制周期的重叠与否）4. 复制叉移动的速度 (900/50 nt/S)5. 冈崎片段的大小6. 端粒和端粒酶7. DNA聚合酶Polymerases相同点：不同点：本章结束，本章结束， 谢谢！谢谢！名词解释复制 复制体 半保留复制 岗崎片段 复制单位 复制 先导链 后随链 DNA复制的转录激活 DNA复制的半不连续性简答题1、图示说明DNA半保留复制的机制证明。2、DNA复制方向为53，请说明复制为什么不能从35。3、为什么岗崎证明DNA半不连续性复制的实验中出现两条链都是 不连续的假象。4、DNA复制为何选择RNA作为引物？5、复制叉诞生的

23、过程如何，后随链上都包含哪些事件（涉及的酶 的情况）6、E.coli的DNA复制终止机制7、原核生物线性DNA复制5末端短缩的解决办法有哪几种。8、真核生物端粒末端及端粒酶在DNA末端复制过程中的作用 机制9、真核生物DNA复制过程中核小体复制和保留机制。10、保证复制忠实性的主要机制11、真核与原核复制起始调控的差别12、真核与原核复制的比较内容回顾内容回顾1：1、基本概念、基本概念 DNA复制复制 复制子复制子 复制体复制体 复制时期复制时期2、半保留复制、半保留复制 3、复制起点、复制起点 结构特征结构特征 复制方向：复制叉复制方向：复制叉 复制眼复制眼 单双向复制的决定条件单双向复制的决定条件 复制的多模式复制的多模式 复制方式：复制叉式（从头起始）复制方式：复制叉式（从头起始） D环复制（置换式）环复制（置换式） 复制（滚环复制）复制（滚环复制）4、复制酶学、复制酶学 三种三种DNApol DNApol 内容回顾内容回顾 2：1、DNApol和和的主要活性和功能的主要活性和功能 聚合活性聚合活性 外切活性（两种）外切活性（两种） 延伸方向延伸方向2、DNA连接酶连接酶3、和、和DN