自然科学高效液相色谱PPT课件

1、第1页/共42页（二）固定相（stationary phase)和 流动相（mobile phase）(1)化学键合相硅胶化学官能团键合到硅胶表面 OH OH | |硅胶（SiO2 nH2O） Si O Si | |第2页/共42页键合相反应键合相反应 R1 | | | | Si OH + XSiR Si OSiR + HX | | | | R2 硅胶 有机硅烷 键合相X: Cl、CH3O、C2H5O等R: 烷C8(C8H17) 、C10(C10H21) 、C18(C18H37)等R1 R2: Z、CH3等第3页/共42页(2)十八烷基硅烷键合硅胶填充料（octadecylsilyl,ODS）

2、万能柱 即C18柱或ODS柱 主要用于反相HPLC中，适用于各种类型的生物分子第4页/共42页 (3) 短链烷基键合物 短链烷基（c3、 c4等）大孔硅胶 键合物 适用于氨基酸、小肽等生物小分子第5页/共42页(4)键合到基质上的官能团性质 反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，如 C18 、C8 、C4等 正相柱：填料是非极性的，官能团为CN、NH2等 离子交换键合相：阳离子官能团：SO3H、第6页/共42页2、流动相 （mobilephase）流动相选择原则： 1.样品易污，且溶解度尽可能大2.化学性质稳定，不损坏柱3.不妨碍检测器检测分析4.粘度低，流动性好5.易于从中回收样品6.无毒或

3、低毒，易于操作7.易于制成高纯度，即色谱纯8.废液易处理，不污染环境第7页/共42页第8页/共42页二、分离模式正相HPLC反相HPLC离子交换HPLC凝胶HPLC亲和HPLC第9页/共42页（一）正相HPLC（normal phase HPLC ,NP- HPLC ） 固定相：极性吸附剂（或极性键合相），如硅胶、Al3O2 流动相：非极性或弱极性溶剂，如己烷、庚烷等 洗脱顺序：非极性、弱极性、极性 应用：石油化工产品、染料、农药、医药、有机酸、有机碱等第10页/共42页（二）反相HPLC（reverse phase HPLC ,RP- HPLC ） 固定相：非极性物质，如C18(ODS)、

4、C10、C8 、C6 、C4 、C2 流动相：极性溶剂，如甲醇/H2O、乙腈/H2O等 洗脱顺序：极性、弱极性、非极性 应用：蛋白质、多肽等第11页/共42页（三）离子交换HPLC（ion-exchange HPLC ,IE- HPLC ） 原理：用离子交换剂作固定相，根据不同组分在一定pH下，组分电荷性质和数量不同而分离的技术 分类：阳离子交换树脂：合酸性基团： 第12页/共42页（四）凝胶HPLC（gel HPLC ,G- HPLC ） 原理：基于分子大小和形状的差异进行分析的技术 固定相：交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶 流动相：水、乙醇、丙酮等 应用：核酸、蛋白质、酶、多糖等第13页/共42

5、页（五）亲和HPLC（affinity HPLC ,AF- HPLC ） 原理：利用生物大分子间专一的亲和力进行分离的技术 固定相：基质（琼脂糖凝胶等）交联配基（亲和性） 应用：酶、抗体、抗原、受体等第14页/共42页三、 HPLC仪器 HPLC仪 一般由输液系统、进样系统、色谱柱、检测器、输液系统、进样系统、色谱柱、检测器、记录和数据处理系统及计算机记录和数据处理系统及计算机等几部分组成第15页/共42页第16页/共42页第17页/共42页（一）输液系统：贮液及脱气装置梯度洗脱装置高压输液泵第18页/共42页梯度洗脱装置第19页/共42页第20页/共42页高压输液泵第21页/共42页第22页

6、/共42页（二）进样系统：第23页/共42页（三）柱系统：第24页/共42页（四）检测器：与泵、柱组成与泵、柱组成HPLC的三的三大关键部件大关键部件第25页/共42页1.紫外吸收检测器第26页/共42页第27页/共42页第28页/共42页2.荧光检测器第29页/共42页4.示差折光检测器第30页/共42页第31页/共42页第32页/共42页 表.HLPC常用检测器检测器 原理 检测下限（g/ml） 检测范围 紫外检测器 具有紫外吸收性质 10-7荧光检测器 具有荧光物质 10-14电化学检测器 具有电解活性物质 10-12示差折光检测器 与流动相折光率不同 10-7 糖类等第33页/共42页

7、（五）不同HPLC产品介绍：高效液相色谱仪器（）第34页/共42页高效液相色谱仪器（2）第35页/共42页高效液相色谱仪器（3）第36页/共42页高效液相色谱仪器（4）第37页/共42页四、定性和定量定性分析保留值定性：比较未知峰与标准物的保留值收集未知峰洗脱液定性：物理分析，化学分析，生物学分析联机定性：液质联用（）液红联用（）第38页/共42页定量分析 分析检测物质的量（或浓度）与检测器的响应值（峰面积或峰高）呈正比1.标准曲线法：也称外标法或直接比较法。用标准品等体积直接进样，得标准曲线，再用待测样品的峰面积（或峰高）与其对照2.内标法：选择适宜的物质作为欲测组分的内标物加入到样品中，内