生物化学研究技术SDSPAGE鉴定菠萝蛋白酶的纯实用教案

1、一、实验一、实验(shyn)目的目的1、学习和掌握电泳（SDS-PAGE）的基本原理及电泳技术。2、熟练配制SDS-PAGE相关(xinggun)各种试剂。第1页/共23页第一页，共23页。二、实验二、实验(shyn)原理原理 电泳电泳: :带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象(xinxing)(xinxing)称称为电泳。为电泳。第2页/共23页第二页，共23页。影响影响(yngxing)电泳的主要因素电泳的主要因素 （1）颗粒性质：一般说来，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就

2、快。反之，则越慢。（2）电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。（3）pH值（4）离子强度：溶液(rngy)的离子强度一般在0.020.2mol/kg之间电泳较合适。（5）溶液(rngy)粘度（6）电渗（7）焦耳热（8）筛孔第3页/共23页第三页，共23页。 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(din yn)(din yn)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳(din (din yn)yn)。 这种凝胶是由丙烯酰胺单体这种凝胶是由丙烯酰胺单体( (简称简称 Acr) Acr)和交联剂和交联剂 N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙

3、烯酰胺( (简称简称Bis)Bis)，在催化剂的作用下聚合而成的。在催化剂的作用下聚合而成的。第4页/共23页第四页，共23页。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的体系有两种，即化学聚合和光聚合。聚丙烯酰胺凝胶聚合的体系有两种，即化学聚合和光聚合。 化学聚合的引发剂是过硫酸铵化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3(NH4)2S2O3(简称简称Ap)Ap)，催化剂是，催化剂是N N，N N，NN，N-N-四甲四甲基乙二胺基乙二胺(TEMED)(TEMED)。在催化剂。在催化剂TEMEDTEMED的作用下，由过硫酸铵的作用下，由过硫酸铵(Ap)(Ap)形成形成(xngchng)(xngchng)氧的自氧

4、的自由基，后者又使单体形成由基，后者又使单体形成(xngchng)(xngchng)自由基，从而引起聚合作用。自由基，从而引起聚合作用。第5页/共23页第五页，共23页。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。定。 每每100mL凝胶溶液凝胶溶液(rngy)中含有的单体中含有的单体(Acr)和交和交联剂联剂(Bis)总克数称为凝胶浓度，用总克数称为凝胶浓度，用T表示。表示。 凝胶溶液凝胶溶液(rngy)中，交联剂中，交联剂(Bis)占单体占单体(Acr)和交和交联剂联剂(Bis)总量的百分数称为交联度，用总量的百分数称为交联度，用C表示。表

5、示。第6页/共23页第六页，共23页。 不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳，带电颗粒在电场中的泳动有电荷效应、分子筛效应还不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳，带电颗粒在电场中的泳动有电荷效应、分子筛效应还具有具有(jyu)(jyu)浓缩效应。浓缩效应。 (l) (l) 浓缩效应浓缩效应 (2)(2)电荷效应电荷效应 (3)(3)分子筛效应分子筛效应第7页/共23页第七页，共23页。Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200第8页/共23页第八页，共23页。实验试剂实验试剂(shj)(shj)配制配制 (1) 30%凝胶贮液：取凝胶贮液：取30g丙烯酰胺（丙烯酰胺（

6、Acr）、）、0.8g甲叉双丙甲叉双丙烯酰胺烯酰胺(Bis), （先用约（先用约50ml蒸馏水溶解，如溶解不了蒸馏水溶解，如溶解不了,可可加热加热3050溶解溶解,再用量筒定容至再用量筒定容至100ml，然后过滤，然后过滤，后置于棕色瓶后置于棕色瓶,4下保存备用）。下保存备用）。(2) 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作(cozu)时要戴手套时要戴手套(3) (2) 10%过硫酸铵过硫酸铵(AP)溶液：取溶液：取2g过硫酸铵溶解后，用过硫酸铵溶解后，用20ml dH2O溶解，现配现用。溶解，现配现用。(4) (3) 1 mol/L HCl 500ml：取浓：取浓HCl 4

7、2 ml，加蒸馏水至，加蒸馏水至500 ml(在通风橱中操作在通风橱中操作(cozu)。(5) (4) 分离胶缓冲溶液（分离胶缓冲溶液（1.5mol/L Tris-HCl缓冲液，缓冲液，pH8.8）:取取18.15g Tris溶解后，加溶解后，加1mol/L HCl溶液约溶液约48ml，调，调pH至至8.8, 定容至定容至100ml。第9页/共23页第九页，共23页。(5) 浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl缓冲液缓冲液,pH6.8): 取取6g Tris溶解后，加溶解后，加1mol/L HCl溶液溶液(rngy)40ml，调调pH至至6.8，定容至，定容至100ml

8、 。(6) 10%SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)溶液溶液(rngy): 取取5g SDS加水定容至加水定容至50ml。（加热溶解）。（加热溶解）(7) 2电极缓冲液电极缓冲液(0.1%SDS0.05mol/L Tris0.384mol/L甘氨酸缓冲液，甘氨酸缓冲液，pH8.3):取取6gTris，28.8g甘氨酸和甘氨酸和1g SDS加水溶解后，定容至加水溶解后，定容至000ml（配好的溶液（配好的溶液(rngy)pH8.3）(12个组可配个组可配2升升,使用使用时再稀释时再稀释2倍倍)。 第10页/共23页第十页，共23页。(8) 样品溶解液：取样品溶解液：取SDS g，-巯基乙醇巯

9、基乙醇 ml，甘，甘油油10ml，溴酚蓝，溴酚蓝0.1g，0.5mol/L pH6.8 TrisHCl缓冲液缓冲液 (浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液)10ml，加蒸馏水，加蒸馏水25ml，(最最后后(zuhu)的总体积为的总体积为50 ml),装于棕色瓶。装于棕色瓶。(9)染色液（染色液（0.1%考马斯亮蓝考马斯亮蓝-45%甲醇甲醇-10%冰乙酸冰乙酸溶液）：溶液）：1g考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250，加入，加入450 ml 甲醇、甲醇、100ml冰乙酸，用水定容至冰乙酸，用水定容至1000 ml。(12个组可配个组可配2000 ml)(10)脱色液脱色液高甲醇高甲醇1000ml：甲醇：甲醇 454m

10、l，冰醋酸，冰醋酸75ml，dH2O 471 ml低甲醇低甲醇1000ml ：甲醇：甲醇 50ml，冰醋酸，冰醋酸75ml，dH2O 875 ml第11页/共23页第十一页，共23页。七实验步骤七实验步骤1.1.清洗并吹干玻璃板。清洗并吹干玻璃板。2.2.在塑料胶条的两面涂少量凡士林（注意不能涂多，在塑料胶条的两面涂少量凡士林（注意不能涂多，以防弄脏玻璃板）。以防弄脏玻璃板）。3.3.把玻璃板放入电泳槽中。把玻璃板放入电泳槽中。4.4.用小烧杯加用小烧杯加6ml6ml蒸馏水，蒸馏水，2ml 30%2ml 30%凝胶储液，凝胶储液，20 ul 20 ul TEMEDTEMED，100ul 101

11、00ul 10过硫酸铵，混匀，迅速过硫酸铵，混匀，迅速(xn s)(xn s)倒入封口槽处倒入封口槽处( (一定要快！一定要快！) )，静置约，静置约10min10min直到凝固。直到凝固。聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套5.5.加加dH2OdH2O于两层玻璃之间，检查玻璃底是否漏水；如于两层玻璃之间，检查玻璃底是否漏水；如果漏水，要重装。果漏水，要重装。第12页/共23页第十二页，共23页。6.按下表用小烧杯(shobi)配12%分离胶，混匀，灌胶，高度离梳子约11.5cm，然后覆盖一层水，凝胶时间为1530min，胶与水分层，倾倒去水。12%分离

12、胶5%浓缩胶 30%凝胶贮液4000l810 l上层胶缓冲液pH6.81250 l下层胶缓冲液pH8.82500lTEMED（四甲基乙二胺)30 l20 l10%SDS100l50ldH2O3270l2820lAP（过硫酸氨）100l50 l第13页/共23页第十三页，共23页。7.凝好胶，垂直拔掉梳子（不要左右摇梳子）。8.上槽加入电泳缓冲液（电极(dinj)缓冲液稀释2倍），液面需没过低玻璃板；下槽电泳缓冲液没过玻璃板封胶处1cm。9.用1.5ml ep管取100l粗酶样品与100l样品溶解液混合均匀，与蛋白质分子量标准一起置于沸水浴5min）。第14页/共23页第十四页，共23页。10.

13、微量注射器按下表2点样，隔孔点样，注意不要交叉污染（每点一个样都要清洗(qngx)微量注射器）。表2 点样方式孔1234567891011加样粗酶标准蛋白过柱1过柱2过柱3体积L304030353535 *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高, 样品(yngpn)下沉时易发生扩散，溢出加样孔第15页/共23页第十五页，共23页。11.上槽接负极，下槽接正极。12.恒电流电泳：浓缩胶，1012 mA，待溴酚蓝迁移到浓缩胶与分离胶的界面(jimin)调整电流至20mA。13.待溴酚蓝迁移到距分离胶底部0.51cm处，结束电泳。14.染色（2030min），回收染色液。15.脱色：高甲醇60

14、80ml，25min；高甲醇4060ml 20min；低甲醇80100ml完全脱净剥胶时要小心剥胶时要小心, ,保持胶完好无损保持胶完好无损, ,染色染色(rns)(rns)要充分要充分第16页/共23页第十六页，共23页。16.拍照并画电泳图谱，计算标准蛋白、待测样品的相对迁移率（蛋白相对迁移率蛋白迁移距离/指示剂迁移距离）。17.用低分子量标准蛋白质所作的标准曲线(qxin)，求待测样品亚基的相对分子量。18.以标准蛋白质电泳的相对迁移率为横坐标(X)，标准蛋白质分子量的对数为纵坐标(Y)，绘标准蛋白质的标准曲线(qxin)，再根据样品相对迁移率在曲线(qxin)上求出其蛋白质的分子量。第

15、17页/共23页第十七页，共23页。蛋白名称 迁移距离 相对迁移率（Y） 蛋白分子量(D) 蛋白分子量对数(X) 兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白 牛碳酸酐酶 牛蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶 过柱的菠萝蛋白酶 指示剂 -第18页/共23页第十八页，共23页。低分子量标准低分子量标准(biozhn)(biozhn)蛋白质的组分：蛋白质的组分：1) 1) 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B B 分子量分子量 97,400 97,4002) 2) 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 分子量分子量66,20066,2003) 3) 兔肌动蛋白兔肌动蛋白 分子量分子量43,00043,0004) 4) 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 分子量分

16、子量31,00031,0005) 5) 牛蛋白酶抑制剂牛蛋白酶抑制剂 分子量分子量20,10020,1006) 6) 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 分子量分子量14,40014,400第19页/共23页第十九页，共23页。八实验注意事项八实验注意事项1.缓冲液的缓冲液的pH值、浓度要准确配置；值、浓度要准确配置；2.AP新鲜新鲜(xn xin)配置。配置。3.SDS在低温下析出，使用前水浴加在低温下析出，使用前水浴加热使之溶解。热使之溶解。第20页/共23页第二十页，共23页。九实验九实验(shyn)(shyn)结果分析结果分析 1. 各实验组分析讨论实验结果，再由老师进行归纳总结。2. 做好电泳图谱的绘制及数