实验模式动物斑马鱼左正宏

1、实验模式动物实验模式动物斑马鱼斑马鱼左正宏左正宏 斑马鱼概况斑马鱼概况 斑马鱼作为模式生物的优点斑马鱼作为模式生物的优点 斑马鱼的研究现状斑马鱼的研究现状 本课题组利用斑马鱼开展的研究工作本课题组利用斑马鱼开展的研究工作概概 况况 上个世纪70年代早期，斑马鱼仅在一个研究中心被详细研究：在位于Eugene 的 俄勒冈大学， Charles Kimmel 及其同事开始将斑马鱼作为研究发育的动物模型，并探索其作用。第一部分斑马鱼信息：Charles Kimmel斑马鱼作为模式动物逐渐受到关注斑马鱼作为模式动物逐渐受到关注Turn Eyes to FishChri

2、stiane Nsslein-Volhard 1995 诺贝尔奖生理医学奖获得者（果蝇的发育研究）was able to identify and classify a small number of genes that are of key importance in determining the body plan and the formation of body segments, turned eyes to fish and find a wide range of mutationsWolfgang Driever国内发展概况国内发展概况国家斑马鱼资源中心 斑马鱼基本特性 产

3、于热带印度，孟加拉国。 成鱼体长46厘米。体呈纺锤形。雌雄易区分。 性情温和，对水温水质要求不高，易饲养。 属卵生鱼类 ，4月龄进入性成熟期。繁殖期约7天左右。产卵量高，繁殖力很强 。 体外受精，胚胎透明，在24小时内就可发育成形， 23天孵出仔鱼 。斑马鱼的繁殖斑马鱼的繁殖雄雄鱼体修长，鳍大，体色偏黄，臀鳍呈棕黄色，条纹显著鱼体修长，鳍大，体色偏黄，臀鳍呈棕黄色，条纹显著 斑马鱼胚胎早期发育图谱斑马鱼胚胎早期发育图谱Pascal Haffter et al. Development, 1996, 123, 1-36能发荧光的热能发荧光的热带斑马鱼带斑马鱼普通热带斑马鱼是不发荧普通热带斑马鱼是

4、不发荧光的光的 斑马鱼作为模式动物的优点斑马鱼作为模式动物的优点 Why Fish? 酵母菌 yeast 蠕虫 worm (Caenorhabditis elegans) 果蝇 fruit fly (Drosophila) 鱼-斑马鱼 zebrafish (Danio rerio) 爪蟾 frog ( xenopus laevis ) 鼠 mouse几种最常用的模式动物 (Model Organism)第二部分Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母真菌界的单细胞真核生物，有16个染色体它的全基因组已在1996年测定。细胞数目一定：成虫细胞数目只有959个，其中包括302个神经

5、元；有6条染色体，全基因组于1998年测定，长9.7Mb。Caenorhabditis elegans线虫Drosophila melanogaster果蝇繁殖很快、容易诱发变异的小昆虫。总长达1.8亿核苷酸。xenopus laevis爪蟾Mus musculus小鼠基因组大小与人类相近，约30亿个核苷酸对，有19条染色体。 “For more than a decade, vertebrate developmental biologists have watched with fascination as the mysteries of early embryonic developm

6、ent were unraveled in the fruit fly Drosophila,None of established vertebrate model share Drosophilas virtues of breeding prolifically and producing readily observable embryos” Science 264, 1994斑马鱼作为模式动物的优点斑马鱼作为模式动物的优点 Why Fish? The scientific value of the zebrafish lies in its position on the evolu

7、tionary ladder. As a vertebrate, the zebrafish is several rungs closer to humans than are fruit flies (Drosophila) or worms (Caenorhabditis elegans), yet the fish is also much more malleable than most mammalian animal models. hardiness, small size, and brief life span zebrafish eggs are transparent

8、allowing direct visualization of the embryo. A single fish lays hundreds of eggs at a time, providing ample resources for “forward genetic screens” Why Fish?青鳉 （Medaka）Current Research on Zebrafish 发育发育 Development 再生再生 Regeneration 疾病疾病 Disease 在体药物研究在体药物研究 In vivo drug discovery第三部分 chokh/rx3基因突变导

9、致的眼睛缺失基因突变导致的眼睛缺失发育发育 EMBO reports 4, 894899 (2003)chokh 基因突变的恢复基因突变的恢复 EMBO reports 4, 894899 (2003)斑马鱼眼部突变分类斑马鱼眼部突变分类SCIENCE VOL 295 18 JANUARY 2002突变导致的异常突变导致的异常SCIENCE VOL 295 18 JANUARY 2002心血管系统发育心血管系统发育Development of Zebrafish Vascular System Nature Medicine, 1995 Development of Zebrafish Vas

10、cular System28 hours 1.5 days 2 days 2.5 days 3 days 3.5 days 4.5 days 5 days 6 days 7 days 斑马鱼的骨骼发育斑马鱼的骨骼发育发育发育缺少缺少chordin表达的斑表达的斑马鱼的马鱼的BMP蛋白水平蛋白水平异常，鳍和尾部骨架异常，鳍和尾部骨架也异常也异常注射注射chordin mRNA后可恢复。因后可恢复。因此研究者使用斑马鱼此研究者使用斑马鱼的这项特性来进行基的这项特性来进行基因筛查，以确定脊椎因筛查，以确定脊椎动物骨骼形成的调节动物骨骼形成的调节机制。机制。 Rik DerynckNature Gen

11、etics ,1999Fin and skeletal defects of dintt250 homozygous mutantsnature genetics volume 23 december 1999器官发生器官发生: : 心脏和血液形成心脏和血液形成 大多数脊椎动物的器官形状相似，因此，斑马鱼器官形成的有关基因也有可能与人类相似。发育发育SCIENCE VOL 295 18 JANUARY 2002器官形成模式图解器官形成模式图解脊椎动物器官形成比较脊椎动物器官形成比较SCIENCE VOL 295 18 JANUARY 2002影响心脏各阶段发育的基因突变影响心脏各阶段发育的基因

12、突变影响血液各阶段发育的基因突变影响血液各阶段发育的基因突变SCIENCE VOL 295 18 JANUARY 2002突变对心脏发育的影响突变对心脏发育的影响The mutant miles apart affects the developing heart (mil, arrow).The cloche mutant has no blood or endothelium.突触形成的在体影像观察突触形成的在体影像观察 Synaptogenesis imaged in vivo突触发生的活体影像观察突触发生的活体影像观察 Synaptogenesis imaged in vivo miR

13、NA expression in zebrafishembryonic developmentScience, 2005斑马鱼的心脏再生斑马鱼的心脏再生 Heart Regeneration in Zebrafish 斑马鱼的Mps1 mitotic checkpoint kinase是 一个至关重要的细胞周期调节因子，如发生突变，则斑马鱼的心脏不能被修复而形成疤痕。因此，损伤诱导的斑马鱼心肌细胞增殖可以克服疤痕形成，使心肌再生。这个发现表明斑马鱼在分析心脏再生的分子机制方面起重要作用。再生再生13 DECEMBER 2002 VOL 298 SCIENCE 心脏切除后心室肌的再生心脏切除后心

14、室肌的再生 Regeneration of ventricular myocardium in the resected zebrafish heart 心脏修复伴随心肌细胞再生心脏修复伴随心肌细胞再生 Cardiomyocyte proliferation accompanies zebrafish heart regeneration 无疤痕修复需要心肌细胞增殖无疤痕修复需要心肌细胞增殖 Cardiomyocyte proliferation is required for scarless regeneration使用斑马鱼进行人类疾病的研究使用斑马鱼进行人类疾病的研究 大规模的基因筛查

15、已经取得了巨大的成就， 确定了早期发育中的五百多个突变表现型。许多基因筛查中确定的斑马鱼的突变表型，为人类相应的病理生理学过程的研究提供了有效的途径。人类疾病模型人类疾病模型 癌症癌症 Cancer 造血紊乱造血紊乱 Hematopoietic disorders 心血管疾病心血管疾病 Cardiovascular disorders 肾功能紊乱肾功能紊乱 Kidney disorders 其他器官疾病其他器官疾病 Other organs疾病模型疾病模型1：癌症：癌症 疾病疾病 鱼类的癌症发生很常见，这一现象可能与水源中的致癌物有关。而鱼类所有系统中均能发生各种良性和恶性肿瘤的特性，在组织学

16、特性上和人类肿瘤很相似。 人类基因组序列与即将完成的斑马鱼的基因序列的差异可用来证明细胞周期基因、肿瘤抑制基因及致癌基因的保守性。人类和斑马鱼胆管癌的组织学相似性人类和斑马鱼胆管癌的组织学相似性CANCER CELL : APRIL 2002人类和斑马鱼腺癌的组织学相似性人类和斑马鱼腺癌的组织学相似性NATURE REVIEWS Cancer 2003, 3:1-7斑马鱼体系复制癌症模型的优点斑马鱼体系复制癌症模型的优点 快速基因筛查可针对这些高度保守的癌症通路 一旦发现癌症有关变异，可通过增强/抑制性筛查确定相互影响的基因 斑马鱼系统易于进行化学遗传性筛查影响癌症生物学研究的斑马鱼体系影响癌

17、症生物学研究的斑马鱼体系的特性的特性 Forward Genetics: making a mutation and then find the gene; including ENU mutagenesis, insertional mutagenesis Reverse Genetics: including target lesion detection; transgenesis; lineage tracing with fluorescent proteins.疾病模型疾病模型2：肾功能紊乱：肾功能紊乱 斑马鱼肾脏发育和功能的许多方面与高级脊椎动物类似，因此提供了简单易理解的研究体

18、系。已确定十八个隐性突变影响了斑马鱼原肾的发育，主要是肾小球和管囊的形成。 已证明几种突变与人类常染色体显性多囊肾疾病(ADPKD)有关。疾病模型疾病模型3: 贫血贫血Sir mutant erythrocytes have a defect in haemoglobin productionGrx5 is responsible for the sir phenotype斑马鱼模型的特殊应用斑马鱼模型的特殊应用Studies of Musculoskeletal and Skin Developmental Diseases Zebrafish and Cancer Research Eye

19、 Development and Disease Kidney Development and Disease Cardiovascular and Other Organogenesis in Zebrafish Research on Aging Child Health and Human Development Hematopoiesis Research on Ear Morphogenesis and Hearing Disorders Developmental Toxicology in Zebrafish Genome Research Neurogenesis and Ne

20、urological Disorders Early Developmental Programs in the Zebrafish Research on Allergies and Infectious Diseases Mutants that Affect Mental Behavior Craniofacial and Dental Research /science/models/zebrafish/reports/genomic-genetic.html小分子筛查小分子筛查 细胞株水平分析向整体水平分析转化。 斑马鱼在药物进行正式临床实验前可进行

21、“高质量”（疾病导向 disease-driven)药物作用靶位的鉴定和药物作用靶标的活体内定位。这些高通量研究可在机器人平台进行，其成本比使用小鼠研究低。活体药物研究活体药物研究小分子筛查小分子筛查活体药物研究活体药物研究小分子筛查小分子筛查 能够选择在完整模式动物个体以及细胞中均具有生物活性的化合物，而这些细胞正经历正常的细胞与细胞间或细胞与matrix间的相互反应。例如，胚胎学分析可用来筛选减少细胞增殖、促进基因组稳定、增加凋亡或避免血管形成的药物。 检查发育缺陷(一种称为耳石的混合物可抑制内耳结构的形成，但不会引起其他缺陷；另一种混合物在有效中位剂量2 nM时可导致心肌缺陷)。本课题组

22、利用斑马鱼开展的工作本课题组利用斑马鱼开展的工作 研究方向研究方向 发育毒性：发育毒性：神经发育和神经发育和心血管发育心血管发育 第四部分Huang, L., Wang, C., Zhang, Y., Wu, M., and Zuo, Z. (2013) Phenanthrene causes ocular developmental toxicity in zebrafish embryos and the possible mechanisms involved. J. Hazard. Mater. 261C: 172-180. Wu, M., Zuo, Z., Li, B., Huang

23、, L., Chen, M., and Wang, C. (2013) Effects of low-level hexabromocyclododecane (HBCD) exposure on cardiac development in zebrafish embryos. Ecotoxicology Epub ahead of print. Zhang, Y., Huang, L., Wang, C., Gao, D., and Zuo, Z. (2013) Phenanthrene exposure produces cardiac defects during embryo dev

24、elopment of zebrafish (Danio rerio) through activation of MMP-9. Chemosphere. Epub ahead of print. Zhang, Y., Huang, L., Zuo, Z., Chen, Y., and Wang, C. (2013) Phenanthrene exposure causes cardiac arrhythmia in embryonic zebrafish via perturbing calcium handling. Aquat. Toxicol. 142-143C: 26-32. Epu

25、b ahead of print. Zhang, Y., Wang, C., Huang, L., Chen, R., Chen, Y., and Zuo, Z. (2012) Low-level pyrene exposure causes cardiac toxicity in zebrafish (Danio rerio) embryos. Aquat. Toxicol. 114-115C: 119-124. Huang, L., Wang, C., Zhang, Y., Li, J., Zhong, Y., Zhou, Y., Chen, Y., and Zuo, Z. (2011)

26、Benzoapyrene exposure influences the cardiac development and the expression of cardiovascular relative genes in zebrafish (Danio rerio) embryos. Chemosphere. 87(4): 369-375. 多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs) 主要来源于煤、石油、木材、烟草的不完全燃烧。 PAHs的发育毒性在最近才引起重视。 人类的出生缺陷比例在增加，这与多环芳烃污染不断加剧有关？其他毒性其他毒性免疫毒性

27、免疫毒性发育毒性发育毒性PAHs致癌、致畸、致癌、致畸、致突变性致突变性急性毒性急性毒性光毒性光毒性研究背景和目的骨骼畸形骨骼畸形心脏发育和功能受损心脏发育和功能受损视觉器官发育抑制视觉器官发育抑制神经系统发育延迟神经系统发育延迟多环芳烃多环芳烃菲（菲（Phe）暴露对心脏形态形成的影响）暴露对心脏形态形成的影响 Phe 暴露暴露 72h 对斑马鱼胚胎心脏总畸形率的影响对斑马鱼胚胎心脏总畸形率的影响Control Phe PheVVAAVAPhe暴露对斑马鱼心脏形态的影响暴露对斑马鱼心脏形态的影响侧面观，侧面观，A： 心房，心房，V： 心室，心室，Bar = 50m菲（菲（Phe）暴露对心脏形态

28、形成的影响）暴露对心脏形态形成的影响 Phe对心室壁厚度的影响对心室壁厚度的影响原位杂交分析原位杂交分析 Vmhc、Myl7 基因在斑马鱼基因在斑马鱼胚胎心脏的分布胚胎心脏的分布小结小结环境浓度的环境浓度的Phe暴露能引发斑马鱼胚胎心脏发育畸形，其可能的作用机制为：暴露能引发斑马鱼胚胎心脏发育畸形，其可能的作用机制为：Phe暴暴露诱导露诱导MMP-9表达、增加表达、增加MMP-9活性，促进心肌细胞间质活性，促进心肌细胞间质ECM降解、导致腔室壁降解、导致腔室壁变薄；变薄；Phe暴露同时诱发暴露同时诱发TGF-1调节的胶原合成的增加，并最终导致心脏畸形。调节的胶原合成的增加，并最终导致心脏畸形。

29、Chemosphere， 2013 菲（菲（Phe）暴露对心脏功能的影响 Phe 暴露暴露 72h 导致斑马鱼胚胎心律不齐导致斑马鱼胚胎心律不齐Phe 暴露暴露72h 对斑马鱼胚胎心率的影响对斑马鱼胚胎心率的影响Phe暴露对大鼠心肌细胞钙离子平衡的影响暴露对大鼠心肌细胞钙离子平衡的影响 a 胞浆内游离胞浆内游离Ca2+的蓄积，的蓄积，b 肌浆网内肌浆网内Ca2+的变化的变化 Phe暴露后，细胞胞浆中暴露后，细胞胞浆中Ca2+严重滞留，游离严重滞留，游离Ca2+浓浓度显著性上升，肌浆网内度显著性上升，肌浆网内Ca2+明显减少。提示：明显减少。提示：Phe暴露后肌浆网暴露后肌浆网Ca2+摄取能力摄取能力受到明显的影响受到明显的影响心肌细胞胞浆内游离钙浓度的变化心肌细胞胞浆内游离钙浓度的变化小结小结环境浓度的环境浓度的Phe暴露同时也能导致心脏机能障碍。其可能分子机制为：暴露同时也能导致心脏机能障碍。其可能分子机制为：Phe暴露暴露通过直接或间接的方式抑制通过直接或间接的方式抑制Tbx5表达，从而导致其调控的表达，从而导致其调控的SERCA2a表达降低，表达降低，使得心肌细胞肌浆网对胞浆中使得心肌细胞肌浆网对胞浆中Ca