药物质量控制中现代分析方法进展PPT课件

1、第一节第一节 毛细管电泳分析法毛细管电泳分析法一、简介1、定义： 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳电泳。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳高效毛细管电泳。第1页/共36页 2、 HPCE的优点： (1) 毛细管中心与外界的距离很短，电泳产生的焦耳热很快被散去，有效防止电泳条带的扩散。 (2) 分析速度快、分离效率高 (3) 电极液用量少，不破坏生物

2、样品，检测灵敏度高，用激光诱导荧光检测器灵敏度可达10-19g (4) 结构简单，操作方便，自动化程度高。第2页/共36页二、毛细管电泳仪第3页/共36页三、主要分离模式1、毛细管区带电泳 主要用于离子状态存在的样品（1）分离原理 几个基本概念： 偶电层 (Electric Double Layer，简称EDL) 电渗流：在高电压下，由于液固界面的双电层的存在，组成扩散层的阳离子向负极移动，导致毛细管中的溶液整体向负极移动。这种现象称为电渗流，用EOF表示,其速度表示为 eo表示。 电泳淌度：溶质在给定缓冲溶液中，单位时间在单位电场下移动的距离。用ep表示，其速度用ep表示。 第4页/共36页

3、n表观淌度 ap：实际测得的电泳有效淌度和电渗流淌度的矢量和 apap= = efef+ + EOFEOFn表观迁移速度：离子在实际分离过程中的迁移速度 ap=ap E（2）各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： + =电渗流 + +ef 阳离子运动方向与电渗流一致； - =电渗流 - -ef 阴离子运动方向与电渗流相反； 0 =电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；第5页/共36页2、胶束电动毛细管色谱（MECC） 主要用于电中性物质的分离 分离原理：在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成胶束，被分离的物质的水和胶束两相分配，各溶质因分配系数差异而被分离第6页/共36页 3、毛细管凝胶电泳（

4、CGE） 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式 ，用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，按分子的大小分离。主要用于分析蛋白质、DNA等生物大分子。第7页/共36页4、毛细管等速电泳5、毛细管等点聚焦电泳6、毛细管电色谱（CEC) CE与HPLC的有机结合。CEC可看成是CZE的空毛细管被色谱固定相填充、涂布或键和的结果，在毛细管两端加高压直流电压，以电渗流代替高压泵推动流动相。第8页/共36页第二节第二节 质谱（质谱（M Mass Spectrum, MS, MS） 定义：质谱法是通过将样品转化为运动的气态离子并按质荷比(MZ)大小进行分离并记录其信息的分析方法。第9页/共36页

5、第二节第二节 超高效液相色谱及其应用超高效液相色谱及其应用一、超高效液相色谱（ ultra performance liquid chromatography, UPLC) 一种基于小颗粒填料的液相色谱技术。 n 要求：高效快速的分析n 对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行，或者说必须从理论高度对液相色谱重新认识。由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。 第10页/共36页二、理论基础n在高效液相色谱速率理论中， Van Deemter方程式的简化表达式：n如果仅考虑固定相的粒度 对 的影响，其简化方程式可表达为：第11页/共36页首

6、先颗粒度越小柱效越高；其次每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；最后，更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围。所以降低颗粒度不但提高柱效，同时也提高速度。使用更高的流速会受到色谱柱填料耐压及仪器耐压的限制。反之，如果不用到最佳流速，小颗粒度填料的高柱效就无法体现。另外，更高的柱效需要更小的系统体积（死体积）、更快的检测速度等一系列条件的支持，否则小颗粒度填料的高柱效同样无法充分体现。第12页/共36页 要真正创建一个全新的分离科学领域 UPLC，必须解决以下问题： 1）要解决小颗粒填料的耐压问题，第二要解决小颗粒填料的装填问题，包括颗粒度的分布以及色谱柱的

7、结构。 2）高压溶剂输送单元（超过15000psi）。 3）完善的系统整体性设计，降低整个系统的体积，特别是死体积。并解决超高压下的耐压及渗漏问题。 4） 快速自动进样器，降低进样的交叉污染。 5）高速检测器；优化流动池以解决高速检测及扩散问题。 6）系统控制及数据管理，解决高速数据的采集、仪器的控制问题。 第13页/共36页三、UPLC技术与特点（1）新型色谱填料及装填技术杂化颗粒技术（Hybrid Particle Technology HPT）Waters公司的ACQUITY UPLCTM使用了更严格的筛分技术使1.7祄填料的分布很窄，并且使用了全新筛板（专利申请中）及其他色谱柱硬件（柱

8、管及其连接件），在超过20000psi的压力下装填。第14页/共36页（2）超高压液相色谱泵（3）自动进样器为了降低死体积、减少交叉污染，自动进样器的设计使用了许多新技术，例如针内针样品探头、压力辅助进样等等。n减少死体积，降低谱带扩展n快速自动取样n低扩散、低交叉污染外针刺破密封，内针插入样品容器底部吸取样品可达到外针刺破密封，内针插入样品容器底部吸取样品可达到微量取样（微量取样（L取样）取样）第15页/共36页（4）高速检测器UPLC光导检测器流通池示意图光导检测器流通池示意图第16页/共36页四、UPLC的特点分析速度快灵敏度高分离度好超高效液相色谱的优点第17页/共36页0.000.0

9、40.080.120.160.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.001. Thiourea - 0.4302. toluene - 1.0343. propylbenzene - 1.7424. butylbenzene - 2.4135. hexylbenzene - 5.058 样品的组份数：样品的组份数：55m颗粒度颗粒度完全分离时间：完全分离时间：6.00分钟分钟0.200.241. Thiourea - 0.0462. toluene - 0.0883. propylbenzene - 0.1374. butylbenze

10、ne - 0.1825. hexylbenzene - 0.360UPLCAU0.000.100.20Minutes0.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.60UPLCHPLC样品的组份数：样品的组份数：51.7m颗粒度颗粒度完全分离的时间：完全分离的时间：0.60分钟分钟UPLC的速度提高了！增加了样品的通量0.00AU第18页/共36页使用使用1.7m1.7m颗粒度的填颗粒度的填料增加灵敏度料增加灵敏度可看到更多的样品信息AU0.0000.0040.0080.0120.0160.020Minutes1.701.801.902.002.10

11、2.202.302.402.502.601.7 mAU0.0000.0100.0200.0300.0400.050Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.00AU0.0000.0100.0200.0300.0400.0505.0 m0.024恒定柱长时；UPLC的灵敏度提高1.7倍（170%）！第19页/共36页 示例：第20页/共36页第三节第三节 手性手性HPLCHPLC技术与应用技术与应用一、手性药物拆分的高效液相色谱法分类 1. 间接法拆分对映异构体即衍生化试剂法（CDR） 2. 直接法拆分对映异构体 手性固定相法（手性固定相法（CSP） 手性

12、流动相添加剂法（手性流动相添加剂法（CMP） 采用非手性固定相采用非手性固定相第21页/共36页二、拆分原理及特点1. CDR(R) SE +(R) SA (R) SE (R) SA (S) SA (R) SE (S) SA n手性衍生化特点：1.需要高光学纯度的手性衍生化试剂；2.反应繁琐费时；3.衍生化反应速率重现性较差4.只需使用价格便宜、柱效较高的非手性柱5.衍生化过程可同时纯化样品第22页/共36页2. 手性流动相拆分法（CMP） 又称手性添加剂法，这种拆分法是在流动相中加入手性试剂，利用手性试剂与各对映体结合的稳定常数不同，以及药物与结合物在固定相上分配系数的不同来进行分离。此法不

13、需昂贵的手性柱，亦无须进行柱前衍生，手性添加剂可视要求而更换，使用比较方便。 其中主要应用的有：配体交换型手性添加剂、环糊精添加剂、手性离子对添加剂。 第23页/共36页3. 手性固定相拆分法（CSP） 利用手性固定相与对映体消旋物相互作用，其中一个与手性固定相生成不稳定的短暂的对映体复合物，使两种异构体在色谱柱上的保留时间不同，从而得到分离。 用于色谱分离的手性固定相已经被大量研究，已有100多种液相色谱固定相被商业化。目前所研究的高效液相色谱手性固定相有 7大类。 其中主要应用的有：Pirkle型CSP、环糊精CSP、手性聚合物CSP、蛋白质CSP 。 第24页/共36页CSPCSP种类种

14、类作用机理作用机理应用应用Pirkle型型CSP 主要有主要有 -碱型（带推电子取代基）碱型（带推电子取代基）手性固定相、手性固定相、-酸型（带吸电子取代酸型（带吸电子取代基）手性固定相，以及氨基酸类手性基）手性固定相，以及氨基酸类手性固定相固定相氨基酸、氨基酸、 乙内酰脲、乙内酰脲、 内酰脲、内酰脲、 胺类、胺类、 醇类及硫醇类药物对映醇类及硫醇类药物对映体体拆分拆分环糊精环糊精CSP 环糊精的手性识别主要来自环内腔环糊精的手性识别主要来自环内腔对芳烃或脂对芳烃或脂 肪烃类侧链的包容作肪烃类侧链的包容作用，用， 以及环外壳上的羟基与药物对以及环外壳上的羟基与药物对映体分子发生氢键作用映体分子

15、发生氢键作用一环糊精：适用于大多数药物一环糊精：适用于大多数药物一环糊精：适用于相对分子质一环糊精：适用于相对分子质 量小于量小于200的药物的药物一环糊精：适用于较大相对分一环糊精：适用于较大相对分 子质量药物子质量药物手性聚合物手性聚合物CSP一类：天然的多糖衍生物一类：天然的多糖衍生物纤维素和纤维素和直链淀粉直链淀粉另一类：高分子化合物另一类：高分子化合物 对醇、酸、酮、酯、含对醇、酸、酮、酯、含P或或S的的药物有良好的手性识别能力。药物有良好的手性识别能力。蛋白质蛋白质CSP 可识别药物对映体在蛋白质的结合可识别药物对映体在蛋白质的结合位点而达到手性分离位点而达到手性分离 可直接分离许

16、多药物，如硫喷可直接分离许多药物，如硫喷妥因、妥因、 心得怡及阻滞剂等心得怡及阻滞剂等第25页/共36页CSP的特点1.适用范围广2.制备分离方便3.定量分析的可靠性高4.价格昂贵第26页/共36页第四节第四节 色谱色谱- -质谱联用技术质谱联用技术主要问题有两大方面：1、如何实现接口，降低压力使色谱柱的出口与质谱的进样系统连接，达到两部分速度的匹配；2、除去色谱中大量的流动相分子。第27页/共36页 分子分离器连接 （主要用于填充柱）从气相色谱来的载气和样品离子经一小孔加速喷射入喷射腔中，小分子的载气由于扩散速度较快，被真空泵抽除，而被测物分子量大将在惯性作用下继续直线运动而进入捕捉器。 直

17、接连接法（主要用于毛细管柱）在色谱柱和离子源之间用长约50cm，内径0.5mm的不锈钢毛细管连接，色谱流出物经过毛细管全部进入离子源，这种接口技术样品利用率高。 开口分流连接该接口是放空一部分色谱流出物，让另一部分进入质谱仪，通过不断流入清洗氦气，将多余流出物带走。此法样品利用率低。一、气相一、气相- -质谱联用（质谱联用（GC-MSGC-MS）第28页/共36页二、液相色谱二、液相色谱- -质谱联用质谱联用(LC-MS)(LC-MS)n关键是LC 和MS 之间的接口装置。n目前广泛使用的是大气压电离(Atmosphere pressure Ionization，API)源包括: A. 电喷雾

18、电离(Electrospray Ionization，ESI)源 B.大气压化学电离(Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI)第29页/共36页电喷雾电离源（电喷雾电离源（ESI)ESI)电喷雾离子化分为三个过程:形成带电液滴溶剂蒸发和液滴碎裂形成气相离子毛细管2-4kV离子从液滴表面蒸发出来-+-+-含各种离子的液滴-+-+-+-+-随着液滴的挥发,电荷密度增大, 离子集中到液滴表面+-+-+-+-+-+-第30页/共36页第31页/共36页大气压化学电离源大气压化学电离源(APCI)(APCI)第32页/共36页APCI和ESI的不同点n离子产生的方式离子