第2章 核酸的结构与功能

1、 4q l分子生物学研究已经证实，分子生物学研究已经证实，DNA控制了生物的控制了生物的遗传性状。无论遗传性状。无论DNA或或RNA，都是由许许多多，都是由许许多多个核苷酸连接而成的生物大分子，而每个核苷个核苷酸连接而成的生物大分子，而每个核苷酸又由酸又由磷酸、核糖和碱基磷酸、核糖和碱基3部分组成。部分组成。 DNAl真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复重复序列序列，而且，而且功能功能DNA序列大多被不编码蛋白质的序列大多被不编码蛋白质的非功能非功能DNA所隔开所隔开。l所谓所谓C值值，通常是指一种生物，通常是指一种生物单倍体基因组单倍体基因组DNA

2、的总量。的总量。lC值反常现象（值反常现象（C-value paradox）l不断增加的生物体的复杂度导致相应基因不断增加的生物体的复杂度导致相应基因数量的增加？数量的增加？果蝇基因总数果蝇基因总数13500线虫线虫18500拟南芥拟南芥28000人人30000lRNA切割作用切割作用可以保证从单个基因产生多个可以保证从单个基因产生多个蛋白质产物蛋白质产物。l生物的复杂性生物的复杂性同其基因组的大小之间几乎没同其基因组的大小之间几乎没有相关性。有相关性。2.2 DNA的结构的结构l在在DNA分子中，嘌呤永远与嘧啶配对，而且分子中，嘌呤永远与嘧啶配对，而且腺嘌呤（腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（）只

3、能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟）配对，鸟嘌呤（嘌呤（G）只能与胞嘧啶（）只能与胞嘧啶（C）配对。）配对。l如一条链上某一碱基是如一条链上某一碱基是C，另一条链上与它配，另一条链上与它配对的碱基必定是对的碱基必定是G。碱基之间的这种一一对应。碱基之间的这种一一对应的关系叫的关系叫碱基互补配对原则碱基互补配对原则。真核细胞真核细胞DNA序列可被分为序列可被分为3类类l1、不重复序列、不重复序列 在单倍体基因组里，这些序列一般只有一在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占个或几个拷贝，它占DNA总量的总量的10%80%。不重复序列长约。不重复序列长约7502 000bp，相当于一，相当于一

4、个结构基因的长度。个结构基因的长度。 蛋清蛋白、蚕的丝心蛋白、血红蛋白和珠蛋清蛋白、蚕的丝心蛋白、血红蛋白和珠蛋白等都是蛋白等都是单拷贝基因单拷贝基因。l 2、中度重复序列、中度重复序列 这类序列的重复次数在这类序列的重复次数在101104之间，占之间，占总总DNA的的10%40%，如小鼠中占，如小鼠中占20%，果蝇，果蝇中占中占15%，各种，各种rRNA、tRNA以及某些结构基以及某些结构基因如因如组蛋白基因组蛋白基因等都属于这一类等都属于这一类。 组蛋白基因：l 组蛋白基因组蛋白基因在各种生物体内重复的次数不一样，在各种生物体内重复的次数不一样，但都在但都在中度重复中度重复的范围内。的范围

5、内。 l 基因组中存在大量重复序列用以编码组蛋白是基因组中存在大量重复序列用以编码组蛋白是有其重要意义的有其重要意义的。DNA复制时，组蛋白也要成倍复制时，组蛋白也要成倍增加，而且往往在增加，而且往往在DNA合成一小段后，组蛋白马合成一小段后，组蛋白马上就要与其相结合，这要求在较短的时间内合成上就要与其相结合，这要求在较短的时间内合成大量的组蛋白，因而需要有大量的组蛋白基因存大量的组蛋白，因而需要有大量的组蛋白基因存在。在。 3、高度重复序列、高度重复序列卫星卫星DNAl 只存在于真核生物中，占基因组的只存在于真核生物中，占基因组的10%60%，由，由6100个碱基组成，在个碱基组成，在DNA

6、链上串联重复高达数百万次。因为卫星链上串联重复高达数百万次。因为卫星DNA不转录，其功能不详。它们是异染色质的成不转录，其功能不详。它们是异染色质的成份，份，可能与染色体的稳定性有关可能与染色体的稳定性有关。 2. 3 DNA的二级结构 DNA的一级结构是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。 DNA不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的高级结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在。 在生物活体中，不论DNA的二级结构还是高级结构，都是时刻变化的。 DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。 通常情况下，DNA的二级结构分两大类：一类是右手螺旋右手螺旋

7、，如A-DNA和B-DNA；另一类是左手螺旋左手螺旋，即Z-DNA。29分子生物学 第二章 核酸的结构与功能 30大沟大沟(major groove) 宽宽(2.2nm) 小沟小沟(minor groove) ,宽宽(1.2nm)。由于空间位阻较小，由于空间位阻较小，大沟比小沟能携带更大沟比小沟能携带更多的与蛋白识别并结多的与蛋白识别并结合的信息，即大沟中合的信息，即大沟中的碱基种类差异易于的碱基种类差异易于识别，对蛋白质识别识别，对蛋白质识别并结合于双螺旋结构并结合于双螺旋结构上的特异序列区域非上的特异序列区域非常重要。常重要。分子生物学 第二章 核酸的结构与功能 大多数大多数DNA都以都以

8、B型存在型存在 细胞内双螺旋结构细胞内双螺旋结构的，的，这种这种q q Z-HelixDNA二级结构中左手螺旋 Z-DNA的研究 B-DNA是最常见的是最常见的DNA构象，构象，A-DNA和和Z-DNA可能具有不同的生物活性可能具有不同的生物活性。 Z-DNA调控基因转录的两个模式调控基因转录的两个模式在邻近调控系统中，与调节区相邻的转录区被在邻近调控系统中，与调节区相邻的转录区被Z-DNA抑制，抑制，只有当只有当Z-DNA转变为转变为B-DNA后，转录才得以活化。后，转录才得以活化。 指双链指双链DNA中有些区段，含有两个结构相同，但方向相中有些区段，含有两个结构相同，但方向相反的序列（按确

9、定方向阅读双链中每条链序列都相同）。反的序列（按确定方向阅读双链中每条链序列都相同）。反向重复序列大多是限制性核酸内切酶的识别序列。反向重复序列大多是限制性核酸内切酶的识别序列。EcoR I 含两个相同亚基二聚体，结合在含两个相同亚基二聚体，结合在DNA识别位点上：识别位点上： T C G C G A A T T C G C G G C G C T T A A G C G C T当有当有Mg2+在时，在时，EcoR I 在在特定位点切割特定位点切割DNA。S1核酸酶能特异切断核酸酶能特异切断DNA分子局部单链分子局部单链区。可用来鉴定这类区。可用来鉴定这类结构。结构。o科学家把端粒称为“生命之

10、钟”，因为所有的细胞每分裂一次，端粒就缩短一点。当端粒短到不能再缩时，细胞就无法继续分裂而死亡。“如果端粒缩短了，细胞就会老化。相反，如果端粒酶的活动显著，端粒的长度也就能得以保持，并且细胞衰老也将延后。癌细胞就是一个例子，癌细胞被认为是具有永久生命力的。相反，某些特定的遗传疾病会出现，一些有缺陷的端粒酶这样的特征，导致细胞受到损害。这一发现有助于新的治疗措施的发展。 端粒被称作“生命时钟控制器”，如果未来人类找到了它的控制开关，人类或能实现“青春常驻”。 2. 4 DNA的高级结构 DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结超螺旋结构构是DNA高级结构的主要

11、形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类，它们在特殊情况下可以相互转变，如负超螺旋负超螺旋拓扑异构酶拓扑异构酶 溴乙锭溴乙锭拓扑异构酶拓扑异构酶 溴乙锭溴乙锭松驰DNA正超螺旋正超螺旋The structure of supercoils DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺超螺旋结构旋结构是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类。 研究细菌质粒DNA时发现，天然状态下该DNA以负超螺旋为主，稍被破坏即出现开环结构，两条链均断开则呈线性结构。 在电场作用下，相同分子质量的超螺旋相同分子质量的超螺旋DNA比线性比线性DNA迁移率大迁移率大，线性D

12、NA又比开环的DNA迁移率大，以此可判断质粒结构是否被破坏。 o质粒的质粒的3种构型：种构型：o超螺旋的共价闭合环状超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称，简称cccDNA)o开环开环DNA，即共价闭合环状质粒，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断有一条链断裂，裂，(open circular DNA，简称，简称ocDNA)o线状质粒线状质粒DNA，即质粒，即质粒DNA 在同一处两条链都在同一处两条链都发生断裂发生断裂(linear DNA，简称，简称lDNA)。由于这。由于这3种种构型的质粒构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，分

13、子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其条带，其中中超螺旋质粒超螺旋质粒DNA泳动最快泳动最快，其次为，其次为线状线状DNA，最慢的为最慢的为开环质粒开环质粒DNA。 2022-7-3分子生物学 第二章 核酸的结构与功能 72 2022-7-3分子生物学 第二章 核酸的结构与功能 73 2022-7-3分子生物学 第二章 核酸的结构与功能 74 1997年，普鲁西纳朊病毒priono朊病毒是蛋白质病毒，只有蛋白质而没有核朊病毒是蛋白质病毒，只有蛋白质而没有核酸的病毒。酸的病毒。 o合成朊病毒所需的信息，有可能是存在于寄合成朊病毒

14、所需的信息，有可能是存在于寄主细胞之中的主细胞之中的;o蛋白质指导下的蛋白质合成蛋白质指导下的蛋白质合成; o朊病毒致病的朊病毒致病的“蛋白质构象致病假说蛋白质构象致病假说”. 朊病毒朊病毒 (prion)） 2.1 染色体染色体o2.1.1 染色体遗传物质的主要载体 染色体在遗传上起着主要作用,因为亲代能够将自己的遗传物质以染色体（chromosome）的形式传给子代，保持了物种的稳定性和连续性。lThe nucleus of a nondividing cell (interphase) is filled with a diffuse material called Chromatin,

15、 so called because early microscopists found that it stained brightly with certain dyes.l摘自:Lehninger, 3rd, p35lChromatin consists of DNA and proteins bound tightly together and is the substance of the chromosomes, which do not condense and become individually visible until the cell is ready to divi

16、de.染色体包括染色体包括DNA和蛋白质和蛋白质两大部分。两大部分。同一物种内每条染色体所带同一物种内每条染色体所带DNA的量的量是一定的，但不同染色体或不同物种之是一定的，但不同染色体或不同物种之间变化很大，人间变化很大，人X染色体有染色体有1.28亿个核亿个核苷酸对，而苷酸对，而Y染色体只有染色体只有0.19亿个核苷亿个核苷酸对。酸对。2. 2 真核细胞染色体的组成作为遗传物质作为遗传物质，染色体具有如下特征染色体具有如下特征：分子结构相对稳定；分子结构相对稳定；能够自我复制，使亲子代之间保持连续性；能够自我复制，使亲子代之间保持连续性；能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命能够指导蛋白质

17、的合成，从而控制整个生命 过程；过程；能够产生可遗传的变异。能够产生可遗传的变异。2. 3. 蛋白质 染色体蛋白主要分为组蛋白组蛋白和非组蛋白非组蛋白两类。 真核细胞的染色体中，真核细胞的染色体中，DNA与组蛋白的质与组蛋白的质量比约为量比约为1：1。DNA、组蛋白和非组蛋白及部分RNA组成了染色体。l 组蛋白具有如下特性：l1、进化上的极端保守性进化上的极端保守性 不同种生物组蛋白的氨基酸组成十分相不同种生物组蛋白的氨基酸组成十分相似。牛、猪、大鼠的似。牛、猪、大鼠的H4氨基酸序列完全相同氨基酸序列完全相同，与豌豆序列相比也只有两个氨基酸的差异。，与豌豆序列相比也只有两个氨基酸的差异。l2、

18、无无组织特异性组织特异性 只有鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色只有鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含体不含H1而带有而带有H5，精细胞染色体的组，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白。蛋白是鱼精蛋白。l3、肽链上氨基酸分布的不对称性肽链上氨基酸分布的不对称性 碱性氨基酸集中分布在碱性氨基酸集中分布在N端的半端的半条链上，而大部分疏水基团都分布在条链上，而大部分疏水基团都分布在C端。碱性的半条链易与端。碱性的半条链易与DNA的负电的负电荷区结合，而另外半条链与其他组蛋荷区结合，而另外半条链与其他组蛋白、非组蛋白结合。白、非组蛋白结合。l4、存在较普遍的修饰作用，如甲基化、乙存在较普遍的修饰作用，如甲基化、

19、乙基化、磷酸化及基化、磷酸化及ADP核糖基化等核糖基化等 修饰作用只发生在细胞周期的特定时间修饰作用只发生在细胞周期的特定时间和组蛋白的特定位点上。和组蛋白的特定位点上。2. 1. 2. 染色质和核小体l由DNA和组蛋白组成的染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 双链双链DNA中配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态中，稳定中配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态中，稳定 性较低的富含性较低的富含A-T的区段更明显。的区段更明显。 双螺旋双螺旋DNA熔解成单链的现象称熔解成单链的现象称DNA变性。变性。隐藏在双螺旋内部的发色团，变性后成为单链露出，使隐藏在双螺旋内部的发色团，变性后成为单链

20、露出，使DNA物物化性质变化，包括：化性质变化，包括： 1. 4.【维持维持DNA双螺旋结构的主要是双螺旋结构的主要是氢键氢键和和碱基堆积力碱基堆积力,凡破坏这两种力的因素凡破坏这两种力的因素都可使螺旋解链变性都可使螺旋解链变性】 2022-7-3106 2022-7-3分子生物学 第二章 核酸的结构与功能 1072022-7-3分子生物学 第二章 核酸的结构与功能 108 2022-7-3分子生物学 第二章 核酸的结构与功能 1102022-7-3分子生物学 第二章 核酸的结构与功能 111 Southern blot标记物标记物l标记物应具备的条件：标记物应具备的条件： （1）标记后的探针

21、的分子结构要尽可能与原来）标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。性。 （2）标记探针的检测方法简便、省时、准确可）标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。靠、重复性好、灵敏度高。 （3）稳定性好、环境污染少、价廉。）稳定性好、环境污染少、价廉。杂交杂交l 预杂交预杂交 (加入杂交液，放入加入杂交液，放入42杂交炉中，杂交炉中，鲑鱼精鲑鱼精DNA 100加热变性加热变性5min，迅速加到杂，迅速加到杂交瓶中，

22、使其浓度达到交瓶中，使其浓度达到100g/ml。继续杂交。继续杂交4hr )。l 杂交杂交 (倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至升温至42的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针。将探针100加热加热5min，使其变性，迅速，使其变性，迅速加到杂交瓶中。加到杂交瓶中。42杂交过夜。杂交过夜。lWestern Blot 原理：经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应

23、的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检察电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。实验步骤：实验步骤：l蛋白样品的制备；蛋白样品的制备；l经过经过SDS-PAGE分离样品；分离样品；l分离的蛋白转移到膜载体上，转移后首先将膜上分离的蛋白转移到膜载体上，转移后首先将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附；附；l用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与对应的非标用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与对应的非标记（一抗）结合；记（一抗）结合；l洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性同位素洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性

24、同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。中的蛋白成分。（1 1）RNARNA的完整性。的完整性。（2 2）转膜完全。）转膜完全。（3 3）探针标记的效率、变性。）探针标记的效率、变性。（4 4）防同位素污染。）防同位素污染。（5 5）压片曝光时间。）压片曝光时间。Northern Blot 遗传图谱遗传图谱转录图谱转录图谱0.7 cM 或或 kb 序列图谱序列图谱物理图谱物理图谱HGP的主要任务的主要任务l又称连锁图（Linkage Map），是指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离，通常以基因或基因或DNA片段在染色体

25、交换过程片段在染色体交换过程中的分离频率厘摩（中的分离频率厘摩（cM）来表示。）来表示。cM值越值越大，两者之间距离越远大，两者之间距离越远。1. 遗传图（遗传图（Genetic Map）l产生配子的减数分裂过程中，亲代同产生配子的减数分裂过程中，亲代同“号号”的父的父源或母源染色体既能源或母源染色体既能相互配对相互配对也可能发生也可能发生片段互片段互换换，而父母源染色体等位基因互换导致子代出现，而父母源染色体等位基因互换导致子代出现DNA“重组重组”的频率与这两个位点之间的距离呈的频率与这两个位点之间的距离呈正相关，所以，用两个位点之间的交换或重组频正相关，所以，用两个位点之间的交换或重组频

26、率来表示其率来表示其“遗传学距离遗传学距离”。l遗传标记遗传标记l第一代第一代DNA遗传标记多态性遗传标记多态性是是RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态，限制性片段长度多态性）性）。DNA序列上的微小变化，甚至序列上的微小变化，甚至1个核苷酸的变化，也能引起限制性内个核苷酸的变化，也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化。段长度的变化。：人的DNA序列上平均每几百个碱基会出现一些变异（variation），并按照孟德尔遗传规律由亲代传给子代，从而在不同个体间表现出不同，

27、因而被称为多态性（多态性（Polymorphism）。 限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）原理）原理l第二代第二代DNA遗传标记遗传标记利用了存在于人类基利用了存在于人类基因组中的大量重复序列：因组中的大量重复序列：l重复单位长度在重复单位长度在15-65个核苷酸左右的个核苷酸左右的小卫星小卫星DNA（minisatellite DNA）；）；l重复单位长度在重复单位长度在2-6个核苷酸之间的个核苷酸之间的微卫星微卫星DNA（microsatellite DNA），后者又称为），后者又称为简短串联简短串联重复重复（STR、STRP or SSLP，short tandem

28、repeat polymorphism或者或者simple sequence length polymorphism)。第三代第三代DNA遗传标记遗传标记可能也是最好的遗传标记，是分散于基因组可能也是最好的遗传标记，是分散于基因组中的单个碱基的差异，即中的单个碱基的差异，即单核苷酸的多态性单核苷酸的多态性（ single nucleotide polymorphism，SNP），是由于单个核苷酸改变而导致的核），是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态，包括单个碱基的酸序列多态，包括单个碱基的缺失缺失、插入插入和和替换替换。SNP中大多数为中大多数为转换转换，即由一种嘧啶碱基替，即由一种嘧啶碱基替换另一种嘧啶碱基，或由一种嘌呤碱基替换换另一