外源基因的表达

1、第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达基因工程技术的基因工程技术的核心核心是是基因表达技术基因表达技术。基因表达基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物产物蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用

2、下完成的。控序列的共同作用下完成的。基因重组的基因重组的主要目的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的的基因产物，得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。如蛋白质、多肽类生物药物。目前已构建出了多种基因表达系统，包括原核生物表达系目前已构建出了多种基因表达系统，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。统和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基

3、因与纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的相应的mRNA，与此同时，与此同时， mRNA立即与核糖体结合转译出相立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被也被水解掉。水解掉。在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5和和3末端后才形成末端后才形成mRNA。而。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转只能在细胞

4、浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。v基因表达在原核生物与真核生物中的差别？基因表达在原核生物与真核生物中的差别？6.1 基因表达的机制基因表达的机制6.1.1 外源基因的起始转录外源基因的起始转录 外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。原核生物启动子原核生物启

5、动子诱导型启动子：诱导型启动子：组成型启动子：组成型启动子：如如lac、trp、PR、 PL、 tac等的启动子等的启动子如如T7噬菌体的启动子噬菌体的启动子真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。6.1.2 mRNA的延伸与稳定的延伸与稳定外源基因起始转录后，保持外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止的有效延伸、终止及稳定存在是及稳定存在是外源基因有效表达的关键外源基因有效表达的关键。一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的发的mRNA转录提前终止的现象；转录提前终止的现象；

6、另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。而增加外源基因表达的稳定性。6.1.3 外源基因外源基因mRNA的有效翻译的有效翻译外源基因外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：有效翻译必须考虑的基本原则：AUG(ATG)是首选的起始密码子。是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序互补结合的位点，该序列至少含有列至少含有AGGAGG序列中的序列中的4个碱基。个碱基。S

7、D序列与翻译起始密码子之间的距离为序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基。个碱基。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。不同基因组使用密码子具有不同基因组使用密码子具有选择性选择性。主密码子主密码子（major codon）罕用密码子罕用密码子（rare codon）如果外源基因如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组的的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高；主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达效反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达效率就低。率

8、就低。6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性表达蛋白在细胞中的稳定性避免外源基因表达蛋白降解的对策：避免外源基因表达蛋白降解的对策：构建融合蛋白表达系统构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统6.1.5 目的基因沉默目的基因沉默基因沉默的基因沉默的作用机制作用机制位置效应的基因沉默：位置效应的基因沉默：转录水平的基因沉默：转录水平的基因沉默：转录后水平的基因沉默：转录后水平的基因沉默：是指基因在基因组中的是指基因在基因组中的位置对其表达的影响位置对其表达的影响是在是在DNA

9、水平上的基因水平上的基因调控调控是在是在RNA水平上的基因水平上的基因调控调控6.2 基因表达的调控元件基因表达的调控元件6.2.1 启动子启动子启动子（启动子（promoter）：）：是一段提供是一段提供RNA聚合酶识别和结合聚合酶识别和结合的的DNA序列，它位于基因的上游。序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶正是通过聚合酶正是通过与它的结合而启动基因的转录。原核基因启动子具有与它的结合而启动基因的转录。原核基因启动子具有10和和35序列等结构元件，而真核基因启动子则具有序列等结构元件，而真核基因启动子则具有TATA盒及上游元件等特征结构。盒及上游元件等特征结构。*启动子的特征启动子的特征序

10、列特异性序列特异性方向性方向性位置特性位置特性种属特异性种属特异性6.2.1.1 原核生物的启动子原核生物的启动子转录起始位点：转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序列为大多数细菌启动子转录起始区的序列为CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基（A/G）。）。Pribnow框：框： 10bp处的处的TATA区区，又称，又称10序列区序列区。Sextama框：框： 35bp处的处的TTGACA区区，又称，又称35区区。间隔区：间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启动子的功能不十分重要，但其长度却

11、是影响启动子功能的动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的重要因素。重要因素。TTGACATATAATTranscriptional start site53-35-1016-19 bp5-9 bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45The prokaryotic promoterThe sequence of DNA needed for RNA polymerase to bind to the template and accomplish the initiation reaction.6.2.1.1 真核生物的启动子真核生物的启动子型：型

12、：rRNA基因启动子基因启动子型：型：mRNA基因启动子基因启动子型：型：tRNA基因启动子基因启动子型启动子型启动子所属基因编码的产物为所属基因编码的产物为rRNA前体，经剪切加工后成为各前体，经剪切加工后成为各种成熟的种成熟的rRNA分子。分子。人体细胞人体细胞 型启动子型启动子核心启动子核心启动子：上游控制元件（上游控制元件（UCE）：紧邻转录起始位点，可以启动紧邻转录起始位点，可以启动基因的转录。基因的转录。位于起始位点上游位于起始位点上游 180190bp处，处，它可以大幅度增强它可以大幅度增强转录效率。转录效率。型启动子型启动子型启动子所属基因绝大多数编码蛋白质。型启动子所属基因绝

13、大多数编码蛋白质。TATA框（框（Hogness框）：框）：富含富含AT的保守序列区，的保守序列区，它它与与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。其中心点位于转录起始点上游其中心点位于转录起始点上游2030bp的位置。的位置。CAAT框：框：位于转录起始位点上游位于转录起始位点上游75bp处，处，与与RNA聚合酶的结合有关。聚合酶的结合有关。GC框：框：位于转录起始位点上游位于转录起始位点上游100300bp处，处，与转录因子的结合有关。与转录因子的结合有关。启动子启动子基本区基本区转录起始位点转录起始位点辅助区辅助区型启动子型启动子内启动子内启动

14、子：外启动子外启动子：位于转录起始位点的位于转录起始位点的下游下游，如，如tRNA和和5SRNA的启动子。的启动子。位于转录起始位点的位于转录起始位点的上游上游，缺乏相应的内部，缺乏相应的内部序列，如脊椎动物序列，如脊椎动物U6核小核小RNA和和7SKRNA启启动子，结构类似于真核生物动子，结构类似于真核生物型启动子。型启动子。6.2.1.3 启动子与转录启动启动子与转录启动大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶的亚基成分聚合酶的亚基成分 亚基 基因 氨基酸含量 数量 分子量（kD） 主要功能 rpoA 329 2 37 与调节序列结合 rpoB 1342 1 151 形成磷酸二酯键 rpoC 1407

15、 1 155 与 DNA模板结合 70 rpoD 613 1 70 识别一般启动子，并启动合成 RNA聚合酶：聚合酶： 核心酶核心酶(2)亚基全酶亚基全酶( 2 )s s factor:6.2.1.4 启动子的分离启动子的分离随机克隆法随机克隆法聚合酶保护法聚合酶保护法过滤膜结合法过滤膜结合法PCR扩增法扩增法6.2.2 增强子增强子增强子（增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的：是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，又称顺式作用序列，又称强化子强化子。v增强子的特性：增强子的特性：双向性。双向性。重复序列。重复序列。增强子行使功能与所处的位置无关。增强子行使功能与所处

16、的位置无关。特异性。特异性。增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能。基因相连时也有功能。6.2.3 终止子终止子本征终止子：本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构区内实现终止作用。结构区内实现终止作用。依赖终止信号的终止子：依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅助因子。要依赖专一的蛋白质辅助因子。本征终止子本征终止子两大特征两大特征发夹结构发夹结构(茎环结构茎环结构)：延缓延缓RNA聚合酶的运动，聚合酶的运动，不终止不终止RNA的合成，但为转录终止创造条件。的合成，但为转

17、录终止创造条件。寡聚寡聚U组成的尾部：组成的尾部：转录的终止信号。转录的终止信号。依赖型终止子依赖型终止子终止位点上游终止位点上游5090bp区域，是区域，是因子的识别位点。因子的识别位点。 因子依赖型终止子也能形成茎环结构，但茎环的因子依赖型终止子也能形成茎环结构，但茎环的GC含量较含量较低，因此低，因此RNA聚合酶在此移动的速度减慢，但停留时间较聚合酶在此移动的速度减慢，但停留时间较短，并且茎环结构的下游没有寡聚短，并且茎环结构的下游没有寡聚U结构，结构，RNA聚合酶只能聚合酶只能在在因子的协助下才能有效终止转录。因子的协助下才能有效终止转录。因子因子是一个相对分子量为是一个相对分子量为2

18、.0105的六聚体蛋白质分的六聚体蛋白质分子，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种子，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶酶。由。由于它催化于它催化NTP的水解，的水解， 因子能促使新生的因子能促使新生的RNA链从三元链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。转录复合物中解离出来，从而终止转录。在在RNA合成起始以后，合成起始以后，因子即附着在新生的因子即附着在新生的RNA链上，靠链上，靠ATP水解产生的水解产生的能量，沿着能量，沿着53方向朝方向朝RNA聚合酶移动，到达聚合酶移动，到达RNA的的3OH端后取代了暂停端后取代了暂停在终止位点上的在终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶

19、上释放聚合酶，并从模板和酶上释放RNA，完成转录过程。终止过，完成转录过程。终止过程需要消耗能量，所以，程需要消耗能量，所以， 因子有终止转录和核苷三磷酸酶两种功能。因子有终止转录和核苷三磷酸酶两种功能。6.2.4 衰减子衰减子衰减子（衰减子（attenuator）：）：是位于是位于mRNA分子前导序列中的一段控分子前导序列中的一段控制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化作用的转录终制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化作用的转录终止信号序列，又称止信号序列，又称弱化子弱化子。衰减子最先发现于大肠杆菌色氨酸（衰减子最先发现于大肠杆菌色氨酸（trp）操纵子中。）操纵子中。trp前导区的前

20、导区的4个片段（个片段（1、2、3、4）能以两种不同的方式进行碱基配对，）能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以有时以1-2和和3-4配对，有时只以配对，有时只以2-3配对。配对。在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对tRNATrp的浓度很敏感。的浓度很敏感。当培养基中当培养基中trp浓度很低时，浓度很低时，负载有负载有trp的的tRNATrp也也就少，这样翻译通过两个相邻就少，这样翻译通过两个相邻trp密码子的速度就很慢，当密码子的速度就很慢，当4区被转录完成时，区被转录完成时，核糖体才进行到核糖体才进行到1区（或

21、停留在两个相邻的区（或停留在两个相邻的trp 密码子处），这时前导区结构密码子处），这时前导区结构是是2-3配对，不形成配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到trp操纵操纵子中的结构基因全部转录。而子中的结构基因全部转录。而当当trp浓度高时，浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻核糖体可顺利通过两个相邻的的trp密码子，在密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使区，这样使2-3不能配对，不能配对，3-4区可自由配对形成茎环状终止子结构，终止转录。所以，弱化子对区可自由配对形成茎环状终止子结构，终止转录

22、。所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。Low TrpHigh Trp6.2.5 绝缘子绝缘子绝缘子（绝缘子（insulator）：）：既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件；既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件；它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用；或抑制作用；绝缘子抑制增强子的功能是有极性的。它只能抑制处于绝绝缘子抑制增强子的功能是有极性的。它只能抑制处于绝缘子所在边界另一侧的增强子的作用，而对处于同一结构域缘子所在边界另一侧的增强子

23、的作用，而对处于同一结构域的增强子没有抑制作用；的增强子没有抑制作用；绝缘子对基因表达的调控是一个非常复杂的过程，它是通绝缘子对基因表达的调控是一个非常复杂的过程，它是通过细胞内特定的蛋白质因子相互作用而产生调控效应的。过细胞内特定的蛋白质因子相互作用而产生调控效应的。6.2.6 反义子反义子反义反义RNA（antisence RNA）：同某种天然：同某种天然mRNA反向互补的反向互补的RNA分子称为反义分子称为反义RNA，它是由双链，它是由双链DNA中的无意义链转录产中的无意义链转录产生的，可以用来阻止被其转化的细胞中存在的与之互补生的，可以用来阻止被其转化的细胞中存在的与之互补mRNA的转

24、译活性。现在编码反义的转译活性。现在编码反义RNA的基因已在基因工程中得到应的基因已在基因工程中得到应用，此项技术特称为反义技术学（用，此项技术特称为反义技术学（antisence techology）。）。反义子反义子：编码反义：编码反义RNA的的DNA称为反义子。称为反义子。反义子在反义子在DNA的的复制、转录和翻译复制、转录和翻译三个水平对基因的表达三个水平对基因的表达起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍。起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍。 复制水平的调节复制水平的调节直接抑制直接抑制反义反义RNA与引物与引物RNA前体互补，使得引物前体互补，使得引物RNA无法与无法

25、与DNA模板结合，进而抑制模板结合，进而抑制DNA复制的频率。复制的频率。间接抑制间接抑制反义反义RNA通过阻断复制激活蛋白因子的合成通过阻断复制激活蛋白因子的合成而间接抑制而间接抑制DNA的复制。的复制。 转录水平的调节转录水平的调节反义反义RNA通过与通过与mRNA的的5 端互补结合而阻止转录的延伸；端互补结合而阻止转录的延伸；作用于作用于mRNA的的poly(A)区域，抑制区域，抑制mRNA的成熟及其运输；的成熟及其运输；与真核生物与真核生物mRNA结合而影响其剪切加工。结合而影响其剪切加工。 翻译水平的调节翻译水平的调节通过与通过与mRNA的的5 端端SD序列结合，改变其空间构象，从而

26、序列结合，改变其空间构象，从而影响核糖体在影响核糖体在mRNA上的定位；上的定位；通过与通过与mRNA的的5端编码区（如起始密码）结合，直接抑端编码区（如起始密码）结合，直接抑制翻译的起始。制翻译的起始。SD序列（序列（SD sequence）：系：系Shine-Dalgarno序列的简称，序列的简称，此为纪念最早发现该序列的研究者而命名的。它此为纪念最早发现该序列的研究者而命名的。它是原核生物是原核生物中核糖体的结合位点中核糖体的结合位点，亦即存在于，亦即存在于mRNA分子分子AUG起始密码起始密码子之前的多聚嘌呤序列子之前的多聚嘌呤序列AGGAGGG的部分或全部，可与的部分或全部，可与16

27、S rRNA的的3 -末端序列互补。末端序列互补。SD序列在核糖体同序列在核糖体同mRNA的结合的结合过程中起重要作用。过程中起重要作用。6.3 外源基因表达系统外源基因表达系统外源基因表达系统：外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。（目的蛋白）。外源基因表达系统外源基因表达系统基因表达载体基因表达载体受体细胞受体细胞基因表达系统基因表达系统原核生物基因表达系统：原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达

28、系统、链霉菌表达系系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。统、蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：真核生物基因表达系统：如酵母表达系如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。系统、哺乳动物细胞表达系统等。v 原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：的特点：原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。基

29、因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构相。构相。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。6.3.1 大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌大肠杆菌是一种是一种革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目，其遗传背景清

30、楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。目前大多数外源基因都标基因表达的水平高，培养周期短。目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是目前应用最广泛的是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是目前应用最广泛的基因表达系统。基因表达系统。v与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统所具有的优越性：与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统所具有的优越性：经过长期研究，人们已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、经过长期研究，人们已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分

31、子机理有了深刻的了解；子机理有了深刻的了解；大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；寄主菌株和不同类型的载体系列；实验已经证明，许多克隆的真核基因，例如抑制生长素基因和胰岛素基实验已经证明，许多克隆的真核基因，例如抑制生长素基因和胰岛素基因等，都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；因等，都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。6.3.1.1

32、大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体可分为大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：个系统：DNA复制及重组载体的选择系统复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统蛋白质的翻译系统（1）DNA复制及重组载体的选择系统复制及重组载体的选择系统复制子复制子复制子复制子：是一段包含复制起始位点（：是一段包含复制起始位点（ori）和反式因子作用）和反式因子作用区在内的区在内的DNA片段。片段。大肠杆菌基因表达载体一般是大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表达载体质粒表达载体，含有能在，含有能在大肠杆菌中有效复制的复制子。大肠杆菌中有效复制的复制子。

33、常见的复制子常见的复制子pMB1、p15A、ColE1:松弛复制型松弛复制型，每细，每细胞质粒拷贝数胞质粒拷贝数1020个。个。pSC101:严谨复制型严谨复制型，每细胞质粒拷贝数，每细胞质粒拷贝数少于少于5个。个。在同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的不同质粒在同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的不同质粒载体不能共存，但含不同类型复制子的不同质粒载体则可以载体不能共存，但含不同类型复制子的不同质粒载体则可以共存于同一细胞中。共存于同一细胞中。选择标记选择标记目的目的：使转化体产生新的表型，将转化了的细胞从大量的菌：使转化体产生新的表型，将转化了的细胞从大量的菌群中分离出来。群中分离出来。

34、微生物表型选择标记微生物表型选择标记显性标记显性标记营养缺陷型标记营养缺陷型标记在基因克隆中采用的质粒载体的选择标记记号，包括有在基因克隆中采用的质粒载体的选择标记记号，包括有新陈代谢特性新陈代谢特性、对大肠杆菌素对大肠杆菌素E1的免疫性的免疫性，以及，以及抗菌素抗性抗菌素抗性等多种。而绝大多数的质粒载体都是使用等多种。而绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号抗菌素抗性记号，并且主要集中在并且主要集中在氨苄青霉素抗性氨苄青霉素抗性、四环素抗性四环素抗性、链霉素抗性链霉素抗性、氯霉素抗性氯霉素抗性以及以及卡那霉素抗性卡那霉素抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。等少数几种抗菌素抗性记号上。其原因一方

35、面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因其原因一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药性的抗药性R因子；另一方面则是因为抗菌素抗性记号具有便因子；另一方面则是因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。于操作、易于选择等优点。大肠杆菌表达载体上一般都带有一个以上的抗生素抗性基因。表达载体上的大肠杆菌表达载体上一般都带有一个以上的抗生素抗性基因。表达载体上的抗药性基因赋予宿主特定的抗药性，使其能在抗生素的培养条件下正常生长。这抗药性基因赋予宿主特定的抗药性，使其能在抗生素的培养条件下正常生长。这样就可以筛除掉不含载体的宿主，同时保证载体在宿主中的稳定存在。在构建大样就可以筛除掉

36、不含载体的宿主，同时保证载体在宿主中的稳定存在。在构建大肠杆菌表达载体的过程中，选择何种抗生素抗性基因，还必须考虑到是否会对特肠杆菌表达载体的过程中，选择何种抗生素抗性基因，还必须考虑到是否会对特定宿主细胞的代谢活动产生影响。定宿主细胞的代谢活动产生影响。（2）外源目的基因的转录系统）外源目的基因的转录系统这一系统包括这一系统包括启动子、抑制物基因启动子、抑制物基因和和转录终止子转录终止子。启动子和终止子因宿主的不同而有差别，往往在不同启动子和终止子因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不

37、同，相互间不能通用。物宿主间完全不同，相互间不能通用。启动子启动子启动子（启动子（promotor）：）：是一段能被宿主是一段能被宿主RNA聚合酶特异性聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列，是基因表达序列，是基因表达调控的重要元件。调控的重要元件。外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。选择外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。选择可调控的强启动子是构建一个理想的表达系统首先要考虑的可调控的强启动子是构建一个理想的表达系统首先要考虑的问题。问题。启动子位于基因的上游，其序列的长度因生物的种类而启动子位于基因的上游，其序列的长度因生物的种类

38、而异。当异。当RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上时，便可启动聚合酶定位并结合到启动子序列上时，便可启动基因的转录。基因的转录。启动子具有启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用位点的特序列特异性、启动的方向性、作用位点的特异性异性和和种属特异性种属特异性等等特征特征。在大肠杆菌细胞中大多数基因的启动子与转录起始位点在大肠杆菌细胞中大多数基因的启动子与转录起始位点间的距离为间的距离为69bp，但对于要表达的外源基因来说，启动子，但对于要表达的外源基因来说，启动子与转录起始位点的最佳距离还有待实验来确定。与转录起始位点的最佳距离还有待实验来确定。外源基因在强启动子的控制下容易发生转录过头的现象，

39、外源基因在强启动子的控制下容易发生转录过头的现象，形成长短不一的形成长短不一的mRNA混合物，而过长的转录产物不仅会影混合物，而过长的转录产物不仅会影响到响到mRNA的翻译效率，同时也会使外源基因的转录速度大的翻译效率，同时也会使外源基因的转录速度大大降低。因此，大降低。因此，在构建表达载体的时候一般采用强的启动子在构建表达载体的时候一般采用强的启动子和强的终止子，以达到高效表达的目的。和强的终止子，以达到高效表达的目的。抑制物基因抑制物基因抑制物基因的产物是一种控制启动子功能的蛋白质，对抑制物基因的产物是一种控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。在适当的诱导条件下启动子

40、的起始转录功能产生抑制作用。在适当的诱导条件下可使抑制物失活，启动子功能重新恢复。可使抑制物失活，启动子功能重新恢复。通过抑制物基因产物可使目的基因在宿主培养到最佳状态通过抑制物基因产物可使目的基因在宿主培养到最佳状态时进行转录，从而保证转录的有效进行，特别是表达产物对宿时进行转录，从而保证转录的有效进行，特别是表达产物对宿主有害时，控制转录的时机尤其重要。理想的可调控的启动子主有害时，控制转录的时机尤其重要。理想的可调控的启动子在细胞生长的初期往往不表达或低水平表达，而当细胞增殖到在细胞生长的初期往往不表达或低水平表达，而当细胞增殖到一定的密度后，在某种特定的诱导因子（如光、温度或化学药一定

41、的密度后，在某种特定的诱导因子（如光、温度或化学药物等）的诱导下，物等）的诱导下，RNA聚合酶才开始启动转录，合成聚合酶才开始启动转录，合成mRNA。转录终止子转录终止子转录终止子转录终止子（terminator）：是一段终止）：是一段终止RNA聚合酶转录的聚合酶转录的DNA序列。序列。转录终止子可分为转录终止子可分为本征终止子本征终止子和和依赖终止信号的终止子依赖终止信号的终止子两类。两类。转录终止子的功能不同于启动子，但它对基因的正常表转录终止子的功能不同于启动子，但它对基因的正常表达同样有着重要的意义。一方面，它使转录在目的基因之后达同样有着重要的意义。一方面，它使转录在目的基因之后立即

42、停止，避免多余的转录以节省宿主内立即停止，避免多余的转录以节省宿主内RNA的合成底物，的合成底物，提高目的基因的转录量；另一方面，正常转录终止子的存在提高目的基因的转录量；另一方面，正常转录终止子的存在能够防止产生不必要的转录产物，有效地控制目的基因能够防止产生不必要的转录产物，有效地控制目的基因mRNA的长度，提高的长度，提高mRNA的稳定性，避免质粒上其它基因的稳定性，避免质粒上其它基因的异常表达。的异常表达。（3）蛋白质的翻译系统）蛋白质的翻译系统在原核生物中影响翻译起始的因素有：在原核生物中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核起始密码子、核糖体结合位点（糖体结合位点（SD序列）、起始密

43、码子于序列）、起始密码子于SD序列之间的距序列之间的距离和碱基组成、离和碱基组成、mRNA的二级结构、的二级结构、mRNA上游的上游的5端非翻端非翻译序列和蛋白编码区的译序列和蛋白编码区的5端序列等。端序列等。蛋白质的翻译系统蛋白质的翻译系统核糖体结合位点（核糖体结合位点（SD序列）序列）翻译起始密码子翻译起始密码子翻译终止密码子翻译终止密码子核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点：核糖体结合位点：是指原核基因转录起始位点下游的一段是指原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列，即序列，即Shine-Dalgarno序列序列（简称（简称SD序列序列）。）。SD序列与核糖序列与核糖体体16S

44、rRNA特异配对而与宿主核糖体结合，它对特异配对而与宿主核糖体结合，它对mRNA的翻的翻译起着决定性的作用。译起着决定性的作用。核糖体与核糖体与mRNA的结合程度越强，翻译的起始效率越高，的结合程度越强，翻译的起始效率越高，而核糖体与而核糖体与mRNA 的结合程度主要取决于的结合程度主要取决于SD序列与核糖体序列与核糖体16S rRNA碱基的互补性，因此，在构建表达载体时，要尽可能使碱基的互补性，因此，在构建表达载体时，要尽可能使SD序列与序列与16S rRNA序列互补配对。序列互补配对。影响影响mRNA翻译效率的因素：翻译效率的因素：包括包括SD序列序列、翻译的起始翻译的起始密码子密码子和和

45、SD序列与翻译起始密码子之间的距离和碱基组成序列与翻译起始密码子之间的距离和碱基组成等。等。大肠杆菌大肠杆菌SD序列的碱基组成序列的碱基组成为为5 AGGAGG 3 ,其中以其中以GGAG四个碱基最为重要，这四个碱基中的任何一个发生突四个碱基最为重要，这四个碱基中的任何一个发生突变都会引起翻译效率的大幅度下降。变都会引起翻译效率的大幅度下降。SD序列与起始密码子之间的距离对保证准确和高效翻译序列与起始密码子之间的距离对保证准确和高效翻译也很重要。也很重要。SD序列与起始密码子之间的距离一般为序列与起始密码子之间的距离一般为68bp，多数情况下为多数情况下为7bp，此间的碱基多一个或少一个都会影

46、响翻译，此间的碱基多一个或少一个都会影响翻译的起始效率。的起始效率。SD序列与起始密码子之间的碱基组成也影响翻译的起始序列与起始密码子之间的碱基组成也影响翻译的起始效率。效率。研究表明，研究表明，SD序列后面的碱基为序列后面的碱基为AAAA或或UUUU时，时，翻译的起始效率最高，而当序列为翻译的起始效率最高，而当序列为CCCC或或GGGG时，翻译时，翻译的起始效率分别为最高值的的起始效率分别为最高值的50和和25。有的载体的启动子后接有有的载体的启动子后接有SD序列，而另一些载体的启动序列，而另一些载体的启动子后没有接子后没有接SD序列，那么则需要目的基因上游带进序列，那么则需要目的基因上游带

47、进SD序列。序列。若在大肠杆菌中表达真核基因或本身所含核糖体结合位若在大肠杆菌中表达真核基因或本身所含核糖体结合位点较弱的原核基因，则必须从外部同时提供启动子和有效的点较弱的原核基因，则必须从外部同时提供启动子和有效的核糖体结位点。核糖体结位点。翻译起始密码子翻译起始密码子起始密码子是翻译的起始位点，通常为起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（ATG），编），编码甲硫氨酸（码甲硫氨酸（MET），），是首选的起始密码子是首选的起始密码子。也有极少数生。也有极少数生物利用其它密码子作为翻译的起始位点，如物利用其它密码子作为翻译的起始位点，如GUG、UUG等。等。翻译终止密码子翻译终止密码子翻译

48、终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从翻译终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。在大肠杆菌中，合成多肽链的释放由在大肠杆菌中，合成多肽链的释放由RF1和和RF2两个释放因两个释放因子所调控，子所调控， RF1识别终止密码识别终止密码UAA和和UAG， 而而RF2识别终止密识别终止密码码UAA和和UGA，由于，由于UAA同时为两个释放因子所识别，一般同时为两个释放因子所识别，一般被选作翻译的终止密码。被选作翻译的终止密码。在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常

49、将几个终止密码串连在一起。具报道，在大肠杆菌中以四个核苷酸组成止密码串连在一起。具报道，在大肠杆菌中以四个核苷酸组成的顺式序列的顺式序列UAAU作为作为终止密码终止密码，可有效地终止多肽链的合成。，可有效地终止多肽链的合成。不同生物基因组甚至是同种生物不同蛋白质的基因，所用不同生物基因组甚至是同种生物不同蛋白质的基因，所用的密码子都具有一定的的密码子都具有一定的选择性选择性。有的密码子在一种基因组中使。有的密码子在一种基因组中使用的频率高，被称为用的频率高，被称为主密码子主密码子，而在另一种基因组中使用的频，而在另一种基因组中使用的频率较低，被称为率较低，被称为罕用密码子罕用密码子。如果外源目

50、的基因如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之，若外主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达水平就低。因此，在构源基因含有较多的罕用密码子，其表达水平就低。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表达基因的种类和性质，或建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表达基因的种类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整。进行适当的调整。6.3.1.2 宿主菌宿主菌重组异源蛋白在大肠杆菌

51、中不稳定的原因：重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因：大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统；大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统；大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子；定因子；大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。境，导致蛋白质分子之间的作用增强。常见的大肠杆菌基因表达受体菌株常见的大肠杆菌基因表达受体菌株菌株 基因型 启动子 BL21 hsd S gal T7 噬菌体 HMS174 recA1 hsdR rif

52、r T7 噬菌体 lacZ trpA rpsL 噬菌体 PL M5219 RB791 W3110 lacIq L8 lac, tac 6.3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统常见的大肠杆菌表达系统Lac和和Tac表达系统表达系统：是以：是以lac操纵子调控机制为基础操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。设计和构建的表达系统。PL和和PR表达系统表达系统：是以：是以噬菌体早期转录启动子噬菌体早期转录启动子PL和和PR构建的。构建的。T7表达系统表达系统：是利用大肠杆菌：是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统噬菌体转录系统元件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。元件构建的表达系统，它具有很高的表达能

53、力。6.3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌表达的形式表达形式表达形式：不溶性蛋白不溶性蛋白和和可溶性蛋白可溶性蛋白两种。两种。包涵体蛋白包涵体蛋白包涵体包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。为包涵体。包涵体存在部位包涵体存在部位：细胞质、细胞周质：细胞质、细胞周质包涵体包涵体的组成的组成蛋白质蛋白质非蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物外源基因的表达产物：占大部分，具有正占大部分，具有正确的氨基酸序列，

54、但空间构相错误，因而包涵确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般体蛋白一般没有生物学活性没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物受体细胞本身的表达产物：如如RNA聚合聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。的蛋白等。：包括包括DNA、RNA和脂多糖等和脂多糖等。包涵体形成的本质包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面：三个方面：折叠状态的蛋白质的聚集作用；折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；蛋白质折叠中间体的作用。蛋白质折叠中间体

55、的作用。融合蛋白融合蛋白融合蛋白融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。称为融合蛋白。*融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点：融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点：稳定性好；稳定性好；表达效率高；表达效率高；较易于分离纯化。较易于分离纯化。寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋串

56、连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为白称为寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白。外源基因多分子线性重组的方式通常有三种：外源基因多分子线性重组的方式通常有三种：多表达单元的重组：多表达单元的重组：每个表达单元都含独立的启动子、终止子、每个表达单元都含独立的启动子、终止子、SD序序列、起始密码和终止密码，形成独立转录与串连翻译的表达单元。表达的列、起始密码和终止密码，形成独立转录与串连翻译的表达单元。表达的外源蛋白不需经过裂解处理。该方式适合表达外源蛋白不需经过裂解处理。该方式适合表达相对分子质量较大相对分子质量较大的蛋白。的蛋白。多顺反子重组多顺反子重组：多拷贝外源基因有各自的多拷

57、贝外源基因有各自的SD序列、翻译起始和终止信序列、翻译起始和终止信号，但转录是在共同的转录启动子和终止子控制下进行的，表达的外源蛋号，但转录是在共同的转录启动子和终止子控制下进行的，表达的外源蛋白分子是相互独立的。该方式适合表达白分子是相互独立的。该方式适合表达中等大小分子量中等大小分子量的外源蛋白。的外源蛋白。多编码序列重组多编码序列重组：将多个外源基因串连在一起，利用同一套转录调控将多个外源基因串连在一起，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，在各编码序列的接口引入蛋白酶酶切位点元件、翻译起始与终止密码子，在各编码序列的接口引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。该方式特别适合表达

58、外源或可被化学断裂的位点。该方式特别适合表达外源小分子小分子蛋白或多肽。蛋白或多肽。整合型外源蛋白整合型外源蛋白将要表达的外源基因整合到染色体的将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区非必需编码区上，上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为达的外源蛋白即为整合型外源蛋白整合型外源蛋白。实现外源基因与宿主染色体整合是根据实现外源基因与宿主染色体整合是根据DNA同源交换同源交换的原理的原理，因此在待整合的外源基因两侧必须分别组合一段与，因此在待整合的外源基因两侧必须分别组合一段与染色体染色体DNA完全同源的序列

59、。此外，还必须将可控的表达完全同源的序列。此外，还必须将可控的表达元件和选择标记基因连接在一起。元件和选择标记基因连接在一起。为获得含整合基因的重组体，被选择的载体一般是那些在为获得含整合基因的重组体，被选择的载体一般是那些在受体细胞内不能自主复制或温度敏感型质粒。那么当外源基因受体细胞内不能自主复制或温度敏感型质粒。那么当外源基因被交换到染色体上后，由于宿主菌的不断分裂和增殖，细胞内被交换到染色体上后，由于宿主菌的不断分裂和增殖，细胞内的质粒逐渐被稀释直至消失。外源基因整合到染色体上后虽只的质粒逐渐被稀释直至消失。外源基因整合到染色体上后虽只含有单拷贝，但在合适的条件下仍能高效表达外源蛋白。

60、含有单拷贝，但在合适的条件下仍能高效表达外源蛋白。分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入端加入1530个个氨基酸组成的氨基酸组成的信号肽（信号肽（signal peptides）序列。信号肽序列。信号肽N端的端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质