动物干细胞培养

1、 第十五章第十五章 动物干细胞技术动物干细胞技术 2011.5 主要内容主要内容 序言序言 干细胞的定义、分类、定位干细胞的定义、分类、定位 干细胞的生物学及形态学特征干细胞的生物学及形态学特征 干细胞的分离纯化和培养干细胞的分离纯化和培养 干细胞研究意义干细胞研究意义 干细胞的应用前景干细胞的应用前景 干细胞研究中存在的问题干细胞研究中存在的问题 序 言n干细胞(stem cells,SC)：是一类具有无限增殖和自我修复能力 (self-renewing)的多潜能细胞，也称为“万能细胞” 。 1999年，Science评价：世界十大科技进展魁首 2000年，Science评价：世界十大科技进

2、展之一 2002年，Science评价：值得关注的六大科技领域之一 2007年，Science评价：IPS(万能细胞)n动物干细胞技术 指通过各种方法获得干细胞，经体外培养建立细胞系，并对其进行定向分化诱导研究，以期获得需要的某一特定类型细胞。n干细胞研究历史 始于19世纪，至今已有1个世纪。1896年，Wilson在一篇论述细胞生物学的文献中，首次使用“干细胞”这一概念，专门用于描述寄生虫生殖系的祖细胞。1981年，Evans和Kaufman用延迟胚胎着床的方法分离胚胎内细胞团，首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞。2007年，科学家将成年小鼠体细胞诱导逆转成干细胞，更加为干细胞技术研究提供了新的

3、思路。 n干细胞研究意义(1)干细胞通过核移植或胚胎嵌合，能得到克隆动物，这对提高优良家畜的繁育效率及拯救濒危动物具有重要意义。(2)由于可以对干细胞进行体外遗传操作、选择和冻存而不失其多能性，所以在特定条件下可诱导分化为人们所需要的细胞、组织和器官等并用于临床治疗。(3)干细胞技术在生物学基础研究、农业以及移植医学上具有广阔的应用前景，其研究成果必将引起人类临床医学的一场革命。 1、干细胞的定义、分类、定位、干细胞的定义、分类、定位1.1 定义定义 干细胞干细胞(stem cells, SC)(stem cells, SC)：是一类具有无限增殖和自我修复能力 (self-renewing)的

4、多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，存在于个体的不同阶段以及成体的不同组织中。基本特征：基本特征：n自我修复自我修复n多向分化潜能多向分化潜能干细胞的分化及自我更新干细胞的分化及自我更新1.2 分类：分类：1.2.1 根据细胞分化潜能的大小分为根据细胞分化潜能的大小分为 全能干细胞全能干细胞 (totipotent stem cells) 三胚层多能干细胞三胚层多能干细胞 (pluripotent stem cells) 单胚层多能干细胞单胚层多能干细胞 (multipotent stem cells) 单能干细胞单能干细胞 (monopotent stem cells) n全

5、能干细胞：全能干细胞：单个细胞如能发育成一个单个细胞如能发育成一个完整的个体完整的个体，就称该细胞的这种，就称该细胞的这种潜能为全能性。潜能为全能性。n三胚层多能干细胞三胚层多能干细胞 ：指细胞失去了发育成完整个体的能力，但仍具有分：指细胞失去了发育成完整个体的能力，但仍具有分化成个体中化成个体中各种细胞各种细胞的潜能。的潜能。n单胚层多能干细胞单胚层多能干细胞：只能分化成：只能分化成几种特定类型的细胞几种特定类型的细胞，如间充质干细胞，如间充质干细胞通常只能分化成骨、肌肉、软骨、脂肪及其他结缔组织，而不能分化为通常只能分化成骨、肌肉、软骨、脂肪及其他结缔组织，而不能分化为除此之外的其他组织。

6、除此之外的其他组织。n单能干细胞单能干细胞：只能分化为：只能分化为一种细胞一种细胞，如成体干细胞中的神经干细胞，只，如成体干细胞中的神经干细胞，只能分化为神经元，而不能分化为显形胶原或少突胶原，这种细胞称为单能分化为神经元，而不能分化为显形胶原或少突胶原，这种细胞称为单能干细胞。能干细胞。 人受精卵着床前胚胎发育过程 小鼠精卵着床前胚胎发育过程桑葚胚（全能干细胞）桑葚胚（全能干细胞）1.2.2 根据细胞来源不同分为 胚胎性干细胞(embryonic stem cell，ES细胞) 成体干细胞(adult stem cells ) （1 1） 胚胎性干细胞胚胎性干细胞 ESES细胞：细胞：指指源

7、于囊胚内细胞团源于囊胚内细胞团(inner cell mass，ICM)的胚胎的胚胎干细胞干细胞(embryonic stem cells,ES) 。 ECEC细胞：细胞：从畸胎瘤中分离得到的多能性细胞从畸胎瘤中分离得到的多能性细胞(embryonic carcinorma cells，EC) 。 EGEG细胞：细胞：胚胎生殖细胞，从早期胎儿原始生殖细胞胚胎生殖细胞，从早期胎儿原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs )中分离到的细胞中分离到的细胞(embryonic germ cells,EG）。）。 均属三胚层干细胞。均属三胚层干细胞。 胚泡（三胚层多能干细胞）胚

8、泡（三胚层多能干细胞）从ICM分离和培养后得到典型的小鼠胚胎干细胞集落（箭头所示），周围分散有上皮样细胞。标尺长度 = 200 m,（引自Kursad TurksenEmbryonic Stem Cell Protocols（2nd）,2006）ES细胞Embryonic stem cell（2）成体干细胞）成体干细胞定义： 成体干细胞是指一些具有组织特异性的细胞，它们主要用于维持细胞功能的稳定，具有修复和再生能力，能够产生新的干细胞，或者能按一定的程序分化，形成新的功能细胞，使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 成体干细胞成体干细胞分类：分类：n造血干细胞：造血干细胞：存在于骨髓、外周血和

9、脐带血中，存在于骨髓、外周血和脐带血中， 用于治疗血液系统疾病以及用于治疗血液系统疾病以及多种实体肿瘤。多种实体肿瘤。n神经干细胞：神经干细胞：存在于中枢神经系统，进一步分化成中枢神经系统的某些细胞类存在于中枢神经系统，进一步分化成中枢神经系统的某些细胞类型。型。n间充质干细胞：间充质干细胞：存在于全身结缔组织和器官间质中，由于它具有向骨、软骨、存在于全身结缔组织和器官间质中，由于它具有向骨、软骨、脂肪、肌肉及肌腱等组织分化的潜能，因而利用它进行组织工程学研究。脂肪、肌肉及肌腱等组织分化的潜能，因而利用它进行组织工程学研究。n表皮干细胞：表皮干细胞：位于表皮基底层，具强大的增殖分化潜能，在体外

10、可以分化成表位于表皮基底层，具强大的增殖分化潜能，在体外可以分化成表皮全层细胞。表皮干细胞作为组织工程皮肤的种子细胞，已经在治疗烧伤方面皮全层细胞。表皮干细胞作为组织工程皮肤的种子细胞，已经在治疗烧伤方面发挥作用。发挥作用。n外周血外周血（peripheral bloodperipheral blood）是除）是除骨髓骨髓之外的血液。之外的血液。n临床上常用一些方法，把骨髓中的临床上常用一些方法，把骨髓中的造血干细胞造血干细胞释放到血液释放到血液中，再从血液中提取分离得到造血干细胞，我们把这样得中，再从血液中提取分离得到造血干细胞，我们把这样得到的干细胞称为外周血干细胞到的干细胞称为外周血干细

11、胞 。n正常人外周血中只存在有极少量（正常人外周血中只存在有极少量（0.01%0.01%）的造血干细胞。）的造血干细胞。可利用细胞分离技术可利用细胞分离技术( (血细胞血细胞自动分离机自动分离机) )，将外周血中含，将外周血中含有造血干细胞的单个核细胞进行分离保存，重复数次达一有造血干细胞的单个核细胞进行分离保存，重复数次达一定细胞数量后，回输给患者，以之代替骨髓而进行干细胞定细胞数量后，回输给患者，以之代替骨髓而进行干细胞移植，称为移植，称为外周血干细胞移植外周血干细胞移植。 外周血n祖细胞祖细胞（progenitor or precursor cell）前体细胞,发育中通过一系列分裂，能产

12、生不同细胞谱系的细胞。n祖细胞的分化更具明确性，只能分化为一些目标细胞。n干细胞可以无限增值，而祖细胞分裂的次数是有限的，它只能分裂并产生某种类型的细胞。祖细胞与干细胞的特点祖细胞与干细胞的特点干细胞的分类干细胞的分类根据细胞分化潜能根据细胞分化潜能根据细胞来源根据细胞来源全能干细胞全能干细胞三胚层多能干细胞三胚层多能干细胞单胚层多能干细胞单胚层多能干细胞单能干细胞单能干细胞胚胎性干细胞胚胎性干细胞成体干细胞成体干细胞生殖干细胞生殖干细胞n干细胞的横向分化干细胞的横向分化( (transdifferentiation） -可塑性：可塑性：n成体干细胞具有分化成其他细胞或组织的潜能，大部分都可以

13、分成体干细胞具有分化成其他细胞或组织的潜能，大部分都可以分化为至少化为至少23种以上其它的组织细胞。种以上其它的组织细胞。 例如：例如：n从骨髓间质中分离出的从骨髓间质中分离出的MAPC（多样成熟原始细胞）干细胞、从（多样成熟原始细胞）干细胞、从脐血中分离出的干细胞，可以在体内外分化出机体的脐血中分离出的干细胞，可以在体内外分化出机体的任一组织任一组织。这种现象被称为干细胞的横向分化。这种现象被称为干细胞的横向分化。n干细胞可塑性应用干细胞可塑性应用 该特性为干细胞的应用研究开创了更广泛的空间，有望利用病该特性为干细胞的应用研究开创了更广泛的空间，有望利用病人自身健康组织产生的干细胞，诱导分化

14、成可替代病变组织的功人自身健康组织产生的干细胞，诱导分化成可替代病变组织的功能细胞来治疗各种疾病。这样既克服了由于异体细胞移植而引起能细胞来治疗各种疾病。这样既克服了由于异体细胞移植而引起的免疫排斥，又避免了胚胎细胞来源不足以及其他社会伦理问题。的免疫排斥，又避免了胚胎细胞来源不足以及其他社会伦理问题。成体干细胞的可塑性成体干细胞的可塑性间充质干细胞间充质干细胞 主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，胎儿脐血中也可分离得到1.3 干细胞的定位干细胞的定位全能干细胞全能干细胞 存在于桑葚胚以前的早期胚胎中存在于桑葚胚以前的早期胚胎中胚胎干细胞胚胎干细胞 存在于囊胚的内细胞

15、团存在于囊胚的内细胞团成体干细胞成体干细胞 存在于组织器官中存在于组织器官中 造血干细胞造血干细胞 分布于骨髓腔、外周血、胸腺、脾、肝等上皮干细胞上皮干细胞 存在于皮肤表皮底层毛囊隆突部、内管腔上皮组织中神经干细胞神经干细胞 主要存在于侧脑室室管膜区、室下带、大脑皮层、小脑皮层等部位肌组织干细胞肌组织干细胞 其中的肌卫星细胞，主要分布于肌纤维膜与基底膜之间2. 干细胞的生物学特性及形态学特征干细胞的生物学特性及形态学特征 2.1 2.1 干细胞的生物学特性干细胞的生物学特性 终生保持未分化或低分化状态；终生保持未分化或低分化状态； 机体的数目、位置相对恒定；机体的数目、位置相对恒定； 具有自我

16、更新能力；具有自我更新能力； 能无限分裂增殖，干细胞可连续分裂几代，也可在较长能无限分裂增殖，干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；时间内处于静止状态；具有多向分化潜能，能分化为各种不同类型的组织细胞，具有多向分化潜能，能分化为各种不同类型的组织细胞，即具有分化发育的可塑性；即具有分化发育的可塑性；分裂周期慢，绝大多数细胞处于分裂周期慢，绝大多数细胞处于G0G0期；期；干细胞通过两种方式生长：干细胞通过两种方式生长： 对称分裂，对称分裂，形成两个相同的干细胞，形成两个相同的干细胞， 非对称式分裂，非对称式分裂，非对称式分裂中一个保持亲代的特性，仍非对称式分裂中一个保持亲代的特性，

17、仍作为干细胞保存下来，另外一个干细胞不可逆的走向分化作为干细胞保存下来，另外一个干细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞。的终端成为功能专一的分化细胞。 2.2 干细胞的形态学特征 (1)ES(1)ES细胞来自正常的胚胎，具有完整的二倍体核型。细胞来自正常的胚胎，具有完整的二倍体核型。(2)(2)胞体体积小、核大、胞浆少、有胞体体积小、核大、胞浆少、有12个核仁，细胞紧集于一起，界个核仁，细胞紧集于一起，界限不清，呈集落型生长，形似鸟巢，集落边缘清晰，折光性强。限不清，呈集落型生长，形似鸟巢，集落边缘清晰，折光性强。(3(3）可以表达早期胚胎细胞特异表达的基因，如碱性磷酸酶基因）可以

18、表达早期胚胎细胞特异表达的基因，如碱性磷酸酶基因( (AKPAKP) )、高端粒酶基因活性。从基因表达看，高端粒酶基因活性。从基因表达看，ESES细胞类似晚期细胞类似晚期ICM ICM 细胞。细胞。(4(4）具有无限增殖能力。在适宜条件下，如放在饲养层上或含有分化）具有无限增殖能力。在适宜条件下，如放在饲养层上或含有分化抑制因子的培养基中，细胞可稳定传代，长期培养。抑制因子的培养基中，细胞可稳定传代，长期培养。山羊EG细胞图A 原代培养的EG细胞集落； 图B EG集落AKP染色（引自Kursad TurksenEmbryonic Stem Cell Protocols（2nd），2006）AB

19、(5) 广泛的体外分化能力。当在培养环境中去除分化抑制因素或加入诱导分化物时，ES细胞可分化成来自三个胚层的细胞。(6) 广泛的体内分化能力。将ES细胞接种到同种动物或小鼠体内，可分化产生由多种不同组织组成的畸胎瘤，包括来源于三个胚层的细胞。(7) 具有种系传递功能。若把ES细胞注射到受体胚胎内，ES细胞可广泛参与胚胎各组织和器官、甚至胚胎生殖细胞的发育，形成种系嵌合体。 (8) 可在体外培养、克隆、冻存及进行遗传操作（如导入基因、标记基因或剔除基因），因此可以通过它制备转基因、基因缺失、突变、过表达的杂合或纯合动物，并可进行各种基因功能分析。3、干细胞培养建系技术干细胞培养建系技术 3.1

20、ES ES细胞的来源细胞的来源n早期胚胎；n从终止妊娠早期的胎儿组织中可分离出多能性干细胞；n体细胞核移植胚胎。（将去核的卵细胞与特定的单个体细胞用电融合法或化学融合法使两细胞相融合，细胞分裂发育并形成胚囊，然后分离内细胞群，获得胚胎干细胞）。 3.2 ES ES细胞的分离纯化细胞的分离纯化 3.2.1 概念n细胞分离细胞分离(cell isolation)：指将组织材料分散制成组织悬液：指将组织材料分散制成组织悬液后，从中获取目的细胞的过程。后，从中获取目的细胞的过程。n细胞纯化细胞纯化(cell purification)：更强调从原代培养前成分混：更强调从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬

21、液中，或者从培养物中获得单一类型细杂的异质性细胞悬液中，或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。胞的过程。3.2.2 ES的分离全胚培养法全胚培养法机械剥离培养法机械剥离培养法酶学解离培养法酶学解离培养法免疫外科法免疫外科法克隆法克隆法n全胚培养法全胚培养法 将桑椹胚或囊胚直接培养在饲养层上，让其自然脱去透明将桑椹胚或囊胚直接培养在饲养层上，让其自然脱去透明带，贴壁，与滋养层细胞一起增殖。当带，贴壁，与滋养层细胞一起增殖。当ICMICM增殖垂直向上生长一增殖垂直向上生长一定时间后，挑出定时间后，挑出ICMICM，并离散成小细胞团块，进行继代培养，克，并离散成小细胞团块，进行继代培养，克隆扩增。隆

22、扩增。 n 机械分离法机械分离法采用机械方法除去胚胎滋养层细胞来分离培养ICM。 用吸管或针头捶打;用组织研磨器或注射器研磨;用不锈钢或尼龙筛网搓洗等。 按照组织内部同细胞的大小差异以一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞起到对细胞进行初步分离纯化的作用。n酶学解离技术酶学解离技术 包括用胰蛋白酶及鳌合剂处理、用缓冲液浸泡等。此法主要包括用胰蛋白酶及鳌合剂处理、用缓冲液浸泡等。此法主要依据不同组织的细胞和间质的构成不同。依据不同组织的细胞和间质的构成不同。n免疫外科法免疫外科法n首先用链霉蛋白酶将胚胎的透明带除去，裸胚在抗体中处理一段时间后，再在补体中作用一段时间，使滋养层细胞发生溶解，然后直接对

23、ICM进行培养与扩增。n免疫外科法可选择性的杀死胚囊外层的滋养层细胞，而仅保留内细胞中的团细胞。 n克隆法克隆法 将成纤维细胞或转基因的成纤维细胞注入去核的哺乳动物卵母将成纤维细胞或转基因的成纤维细胞注入去核的哺乳动物卵母细胞中，电融合或化学融合并激活，重组胚分裂至桑椹胚或囊胚，细胞中，电融合或化学融合并激活，重组胚分裂至桑椹胚或囊胚，分离分离ESES细胞与全胚培养法相同。细胞与全胚培养法相同。 以小鼠ES细胞分离为例： （1 1）将胚泡与兔的抗小鼠的血清共同孵育一段时间；）将胚泡与兔的抗小鼠的血清共同孵育一段时间； （2 2）加入补体；）加入补体； （3 3）在补体作用下外层的滋养层细胞发生

24、溶解（内细胞）在补体作用下外层的滋养层细胞发生溶解（内细胞团细胞不受影响）；团细胞不受影响）； （4 4）胚泡内细胞团在体外适宜的生长条件下形成多种细）胚泡内细胞团在体外适宜的生长条件下形成多种细胞集落；胞集落； （5 5）筛选出未分化的细胞集落，培养形成）筛选出未分化的细胞集落，培养形成ESES细胞系。细胞系。3.3 间充质间充质(messenchymal stem cell, MSC)干细胞的分离纯化干细胞的分离纯化n差速贴壁法：差速贴壁法：利用不同细胞贴壁时间不同进行分离的方法（基于不同黏附特利用不同细胞贴壁时间不同进行分离的方法（基于不同黏附特性的细胞分离方法），如利用成纤维细胞、星形

25、胶质细胞和成鞘细胞的贴壁性的细胞分离方法），如利用成纤维细胞、星形胶质细胞和成鞘细胞的贴壁时间不同而将它们分离。时间不同而将它们分离。 如：葡聚糖凝胶如：葡聚糖凝胶G-10G-10常用来分离细胞，其原理即利用细胞的黏附特性，常用来分离细胞，其原理即利用细胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝胶，从而将异质性细胞悬液中具有黏附能力的细胞去除。使之黏附于葡聚糖凝胶，从而将异质性细胞悬液中具有黏附能力的细胞去除。n密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用利用不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法

26、下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 n叶锦等叶锦等(2010),(2010),利用密度梯度离心法和差速贴壁法获得了高纯度的肌利用密度梯度离心法和差速贴壁法获得了高纯度的肌源性干细胞，并成功扩增。源性干细胞，并成功扩增。n范萍等范萍等(2010),(2010),证明贴壁筛选法是理想的体外分离扩增骨髓间充质干证明贴壁筛选法是理想的体外分离扩增骨髓间充质干细胞细胞(BMSCs(BMSCs) )的培养体系，所培养的的培养体系，所培养的BMSCsBMSCs纯度高、生物学性状稳定。纯度高、生物学性状稳定。n肖宏涛等肖宏涛等(2010),(2010),利用贴壁法分离了人脐带间充

27、质干细胞。利用贴壁法分离了人脐带间充质干细胞。n以以CO2窒息法处死大鼠，在无菌条件下取股骨和颈骨，除去骨表面窒息法处死大鼠，在无菌条件下取股骨和颈骨，除去骨表面附着组织，用附着组织，用PBS清洗干净；清洗干净；n用骨钳除去股骨近端和颈骨远端，暴露骨髓腔，然后除去骨骺，并用骨钳除去股骨近端和颈骨远端，暴露骨髓腔，然后除去骨骺，并用大号针头在骨端的生长面上开一个小孔；用大号针头在骨端的生长面上开一个小孔；n用注射器吸用注射器吸10mL 含血清的培养液，将针头从小孔插入骨髓腔中，含血清的培养液，将针头从小孔插入骨髓腔中，注射培养液，从骨的另一端收集冲洗出来的骨髓；注射培养液，从骨的另一端收集冲洗出

28、来的骨髓； 间充质干细胞分离纯化举例：间充质干细胞分离纯化举例：（1 1）鼠骨髓）鼠骨髓MSCMSC的分离的分离 n将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细胞悬液，收集细胞悬液、离心；胞悬液，收集细胞悬液、离心；n用含血清的培养液冲洗悬浮沉淀的细胞，取少量细胞悬液用含血清的培养液冲洗悬浮沉淀的细胞，取少量细胞悬液与等量与等量4%4%乙酸混合溶解红细胞；乙酸混合溶解红细胞；n计数有核的细胞，计算出细胞悬液中有核细胞的密度，并计数有核的细胞，计算出细胞悬液中有核细胞的密度，并用含血清的培养液调节细胞密度；用含血清的培养液调节细胞密度；n然

29、后将然后将5 510107 7个有核细胞接种到直径为个有核细胞接种到直径为10cm10cm的培养皿中，的培养皿中，于于3737、5% CO5% CO2 2、饱和湿度的、饱和湿度的COCO2 2培养箱中培养。培养箱中培养。（2 2）人骨髓）人骨髓MSCMSC的分离的分离n无菌抽取健康成人骨髓，加肝素抗凝。将肝素抗凝骨髓与等体积无菌抽取健康成人骨髓，加肝素抗凝。将肝素抗凝骨髓与等体积PBSPBS混合，混合，用吸管吹打分散细胞；用吸管吹打分散细胞；n室温离心弃上清，加入室温离心弃上清，加入PBSPBS悬浮细胞，调节密度为悬浮细胞，调节密度为4 410107 7 个个mLmL ；离心；离心管中加入管中

30、加入1.073 g/ mL1.073 g/ mL的溶液，再将的溶液，再将5mL5mL细胞悬液铺于其上，离心收集界细胞悬液铺于其上，离心收集界面上的细胞，加入培养液清洗；面上的细胞，加入培养液清洗；n离心收集细胞，用培养液重新悬浮细胞并计数，调节细胞密度，接种于离心收集细胞，用培养液重新悬浮细胞并计数，调节细胞密度，接种于培养瓶中，于培养瓶中，于3737、5% CO5% CO2 2、饱和湿度的、饱和湿度的COCO2 2培养箱中培养；培养箱中培养；n48h48h后换液，以后每后换液，以后每3-4d3-4d换液一次，当培养的细胞相互汇合达到换液一次，当培养的细胞相互汇合达到90%90%的生的生长表面

31、时，用长表面时，用0.25%0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶-0.1% EDTA-0.1% EDTA液消化分散细胞，进行继代培养。液消化分散细胞，进行继代培养。（3 3）人脐带血）人脐带血MSCMSC的分离的分离n取足月正常生长的胎儿脐带血，加肝素抗凝；取足月正常生长的胎儿脐带血，加肝素抗凝；n将肝素抗凝脐带血与等体积将肝素抗凝脐带血与等体积PBSPBS混合，然后按混合，然后按4 4：1 1与与0.5%0.5%甲基纤维素混合，室温沉降红细胞甲基纤维素混合，室温沉降红细胞30min30min；n小心吸取上层液体，离心、弃上清，用小心吸取上层液体，离心、弃上清，用PBSPBS重悬细胞；重悬细胞；n在离心

32、管中先加入在离心管中先加入1.077g/ mL1.077g/ mL 的溶液，再将的溶液，再将5mL5mL细胞悬液细胞悬液铺于其上；铺于其上；n离心，以下步骤同上。离心，以下步骤同上。 3.4 干细胞培养方法干细胞培养方法n饲养层细胞培养法饲养层细胞培养法n无饲养层培养法无饲养层培养法3.4.1 饲养层细胞培养法饲养层细胞培养法(1)(1)常用饲养层：小鼠胚胎成纤维细胞、常用饲养层：小鼠胚胎成纤维细胞、STOSTO细胞细胞n小鼠胚胎成纤维细胞小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEFs） MEFMEF作用作用: :能抑制胚胎干细胞自主分化、有效促进胚胎干细

33、能抑制胚胎干细胞自主分化、有效促进胚胎干细胞增殖，并维持其未分化的二倍体状态和全能性。胞增殖，并维持其未分化的二倍体状态和全能性。(2)MEF(2)MEF饲养层细胞的制备饲养层细胞的制备 MEFMEF的分离：的分离：n将性成熟雌小鼠(78周龄)与种雄鼠(8周龄以上)2:1合笼，每天早上观察雌小鼠生殖道口，有阴道栓形成即确定受孕，见栓当天为怀孕0.5d；n取妊娠12.514.5d的孕鼠,断颈处死,无菌取出胚胎,洗除残余血迹；n去除胚胎头、四肢、内脏，剪躯干成1mm3碎块，吸至离心管内，加入等体积胰蛋白酶-EDTA消化液，吹打30次；n细胞离散后,加入等体积MEF培养液，终止消化；8001000r

34、/min离心5min，弃上清液； n加入5mL左右MEF培养液重悬鼠胚组织，制成细胞悬液,记数。 MEFMEF的培养：的培养：n原代培养原代培养： 调整细胞浓度调整细胞浓度, ,接种于培养瓶中培养（一般接种于培养瓶中培养（一般5 5个鼠胚可使用个鼠胚可使用1 1个个100-150mL100-150mL培养瓶），让组织悬液能均匀覆盖培养瓶表面，培养瓶），让组织悬液能均匀覆盖培养瓶表面，于于3737、5%CO5%CO2 2、饱和湿度，孵箱培养。饱和湿度，孵箱培养。n传代培养：传代培养： 待成纤维细胞基本铺满培养皿底，用待成纤维细胞基本铺满培养皿底，用0.25%0.25%胰酶和胰酶和0.04% 0.

35、04% EDTAEDTA消化吹打，置离心管静置消化吹打，置离心管静置5min,5min,取上层液制成单细胞悬液，取上层液制成单细胞悬液，调整细胞浓度为调整细胞浓度为1 110106 62 210106 6个个/mL/mL（1:31:3比例），进行传代比例），进行传代培养，一般采用培养，一般采用3 35 5代作饲养细胞用。代作饲养细胞用。 MEFMEF饲养层的制备：饲养层的制备：丝裂霉素丝裂霉素C C处理法、处理法、线照射法。线照射法。n一定剂量的丝裂霉素一定剂量的丝裂霉素C C（有丝分裂抑制剂）和（有丝分裂抑制剂）和射线能够射线能够使细胞停止分裂，但又不立即死亡，在体外可维持一段使细胞停止分裂

36、，但又不立即死亡，在体外可维持一段存活时间。存活时间。n用这两种方法处理饲养层细胞，可使饲养层细胞不分裂，用这两种方法处理饲养层细胞，可使饲养层细胞不分裂，又能存活，并分泌抑制又能存活，并分泌抑制ESES细胞分化和促进细胞分化和促进ESES细胞增殖的细胞增殖的因子，保证因子，保证ESES细胞的生长。细胞的生长。 MEFMEF饲养层的制备：饲养层的制备：方法：丝裂霉素方法：丝裂霉素C C处理法处理法（有丝分裂抑制剂）、（有丝分裂抑制剂）、线照射法。线照射法。作用：使细胞停止分裂，但又不立即死亡，并分泌作用：使细胞停止分裂，但又不立即死亡，并分泌抑制抑制ESES细细胞分化胞分化和和促进促进ESES

37、细胞增殖的因子细胞增殖的因子，保证，保证ESES细胞的生长。细胞的生长。 丝裂霉素丝裂霉素C C法：法： a.a.选取选取MEFMEF细胞生长旺盛的培养皿细胞生长旺盛的培养皿, ,加入丝裂霉素加入丝裂霉素C 10C 10 g/mLg/mL（覆盖细胞覆盖细胞 单层即可单层即可），处理），处理2 23h3h； b.b.吸去处理液，用吸去处理液，用PBS标准培养液清洗标准培养液清洗2-32-3次次, ,除去残余丝裂霉素除去残余丝裂霉素C ； c.c.用用0.25%0.25%胰酶、胰酶、0.04%EDTA0.04%EDTA消化制成单细胞悬液消化制成单细胞悬液, ,计数、调整细胞浓度计数、调整细胞浓度

38、为为3.03.010105 5个个/mL/mL，接种到用，接种到用0.10.1明胶预处理过的培养瓶或培养皿中。明胶预处理过的培养瓶或培养皿中。 d. 37d. 37、5 5C0C02 2、100100湿度孵箱培养，细胞很快贴壁并铺展为单层。湿度孵箱培养，细胞很快贴壁并铺展为单层。 这样制成的饲养单层可使用这样制成的饲养单层可使用6 610d10d，使用前更换成，使用前更换成ESES培养液，其它培养液，其它细胞饲养层的制备方法基本同于细胞饲养层的制备方法基本同于MEFMEF的制备。的制备。 射线处理法射线处理法: : MEF或STO融合成单层后，用射线照射，剂量为30-100Gy，余下步骤同丝裂

39、霉素C处理法。 （3 3）小鼠纤维母细胞）小鼠纤维母细胞（STOSTO细胞）细胞）培养培养nSTOSTO：SIMSIM小鼠纤维母细胞的一种耐硫代鸟嘌呤（小鼠纤维母细胞的一种耐硫代鸟嘌呤（T T）和耐鸟苯苷（）和耐鸟苯苷（O O）亚系细胞。亚系细胞。n分泌：干细胞生长因子分泌：干细胞生长因子（stem cell growth factor，SCGF） 白血病抑制因子白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF） 抑制干细胞分化。抑制干细胞分化。nSTOSTO代替代替MEFMEF的优点：细胞易于生长及不需要经常准备怀孕母鼠，但的优点：细胞易于生长及不需要经常准备怀孕

40、母鼠，但STOSTO细胞必须保持在最适生长条件下，否则易于变异。细胞必须保持在最适生长条件下，否则易于变异。n目前已有稳定转染了目前已有稳定转染了neoneor r基基因和因和UFUF基因的基因的STOSTO细胞株细胞株( (如如SNLSNL细胞细胞) )，可，可用于用于ESES细胞的转染和筛选。细胞的转染和筛选。n培养按一般细胞株，培养液同培养按一般细胞株，培养液同MEFMEF。 3.4.2 无饲养层培养无饲养层培养 (1)基本原理基本原理 在细胞培养液中添加在细胞培养液中添加ESES细胞抑制分化因子，使细胞抑制分化因子，使ESES细胞在体细胞在体外培养环境下保持未分化状态。外培养环境下保持

41、未分化状态。 (2)(2)培养基的组成培养基的组成 a.a.常用基础培养基：常用基础培养基：DMEMDMEM、TCM-199TCM-199、F-12F-12等。等。 b.b.常用三种常用三种ESES细胞培养液细胞培养液n重组的重组的LIFLIF-白血病抑制因子，具有抑制胚胎干细胞自主白血病抑制因子，具有抑制胚胎干细胞自主分化的能力。分化的能力。nBRLBRL（Buffalo大鼠肝细胞株）条件培养基大鼠肝细胞株）条件培养基-能分泌一种抑能分泌一种抑制畸胎瘤和胚胎干细胞自主分化的因子。制畸胎瘤和胚胎干细胞自主分化的因子。n大鼠心肌条件培养基大鼠心肌条件培养基-能显著促进胚胎干细胞的贴壁和能显著促进

42、胚胎干细胞的贴壁和生长。生长。(3) ES(3) ES细胞培养中常用添加物细胞培养中常用添加物 血清血清 巯基乙醇巯基乙醇 非必需氨基酸非必需氨基酸 核苷酸核苷酸 亚硒酸钠亚硒酸钠和其他各种因子和其他各种因子(4) ES(4) ES细胞培养中常用的外源生长因子细胞培养中常用的外源生长因子 表皮生长因子表皮生长因子(EGF)(EGF) 碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子(bFGF(bFGF) ) 干细胞生长因子干细胞生长因子(SCF)(SCF) 胰岛素样生长因子胰岛素样生长因子(IGF)(IGF)等。等。(5) (5) 培养方法培养方法 酶消化法：酶消化法：n待胚胎发育至囊胚或孵化胚后

43、，分离待胚胎发育至囊胚或孵化胚后，分离ICMICM细胞，实体显微镜下挑细胞，实体显微镜下挑取形态典型的取形态典型的ICMICM集落；集落；n用用0.25%0.25%胰酶和胰酶和0.04% EDTA0.04% EDTA消化消化3 35min5min，转入，转入ESES细胞培养液中进细胞培养液中进行剥离行剥离ICMICM细胞；细胞；n用孔径适当的吸胚管吹打，制成单细胞或小细胞团块，转入条件用孔径适当的吸胚管吹打，制成单细胞或小细胞团块，转入条件培养基中进行培养。培养基中进行培养。 3.5 ES3.5 ES细胞的原代培养和传代培养细胞的原代培养和传代培养 3.5.1 ES3.5.1 ES细胞的原代培

44、养细胞的原代培养n制备好制备好MEFMEF饲养层并添加相应的饲养层并添加相应的ESES细胞培养液，隔日将囊胚置入培养；细胞培养液，隔日将囊胚置入培养；n培养条件：培养条件：3737、5%CO5%CO2 2、饱和湿度。、饱和湿度。n挑取生长良好，没有分化迹象的挑取生长良好，没有分化迹象的ES/EGES/EG集落进行消化扩增。用胰蛋白酶集落进行消化扩增。用胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团消化巢状胚胎干细胞团, , 继续培养，一般间隔继续培养，一般间隔4 45d5d用胰蛋白酶消化成用胰蛋白酶消化成小细胞团块或单细胞，克隆和纯化小细胞团块或单细胞，克隆和纯化ESES细胞。细胞。3.5.2 ES3.5.2

45、ES细胞的传代培养细胞的传代培养n初次传代后初次传代后2 23d3d后将会出现小的后将会出现小的ESES细胞集落，待细胞集落，待ESES细胞集落充分细胞集落充分增殖而不出现分化时重新离散，转入新鲜饲养层上。增殖而不出现分化时重新离散，转入新鲜饲养层上。n经数次分离纯化后，经数次分离纯化后，ESES细胞逐渐扩增，每隔细胞逐渐扩增，每隔4 46d6d传代一次。传代一次。n对对ESESEGEG细胞进行消化传代总的原则是：尽量缩短酶消化作用时细胞进行消化传代总的原则是：尽量缩短酶消化作用时间，将细胞的损伤降到最低程度，且能将集落消化成小细胞团块。间，将细胞的损伤降到最低程度，且能将集落消化成小细胞团块

46、。CDB猴ES细胞A 贴壁培养的类ES细胞 ； B 酶消化处理后的ES细胞；C 吸管吹打后形成的细胞簇； D 传代培养后1 d形成的ES细胞集落（引自Kursad Turksen.Embryonic Stem Cell Protocols（2nd）,2006）人胚胎干细胞（人胚胎干细胞（ES细胞）系的建立细胞）系的建立3.6 ES 细胞的冷冻与解冻细胞的冷冻与解冻n在在ESES细胞传代过程中，需要不断对细胞进行冷存。因为细胞传代过程中，需要不断对细胞进行冷存。因为ESES细胞的耐细胞的耐受性差，应采用受性差，应采用“慢冻慢冻- -快溶快溶” ” 的方法，即冷冻时不宜过快，以保的方法，即冷冻时不

47、宜过快，以保持持ESES细胞解冻后最大的存活率。细胞解冻后最大的存活率。n取材处理：取材处理： 取对数生长期的取对数生长期的ESES单细胞悬浮液放入冷冻液中。单细胞悬浮液放入冷冻液中。n冷冻液：冷冻液： 75% DMEM+15%75% DMEM+15%新生牛血清新生牛血清(NCS)+10% DMSO(NCS)+10% DMSO（用时配制）（用时配制）n冷冻：冷冻： 冷冻开始温度下降速度保持在冷冻开始温度下降速度保持在1313minmin为宜，当温度下降到为宜，当温度下降到2020左右时，下降速度可调为左右时，下降速度可调为55minmin，到，到100100左右时，可迅速左右时，可迅速投入液氮

48、中。投入液氮中。n解冻：解冻： 从液氮中取出冷冻管，投入从液氮中取出冷冻管，投入3737水浴至全部溶解，水浴至全部溶解，7575的酒精的酒精消毒冷冻管外壁，立即加入消毒冷冻管外壁，立即加入ESES细胞培养液，离心细胞培养液，离心2 2次除去冷冻液，弃次除去冷冻液，弃去上清，以培养液重新悬浮细胞，放入去上清，以培养液重新悬浮细胞，放入COCO2 2培养箱培养。培养箱培养。3.7 ES和和EG细胞系的特性和鉴定细胞系的特性和鉴定 3.7.1 ES/EG3.7.1 ES/EG细胞系的特性细胞系的特性（1 1）无限增殖性）无限增殖性n在不分化前提下，在不分化前提下，ESES细胞体外培养增殖迅速，每细胞

49、体外培养增殖迅速，每181824h24h增殖一次，增殖一次，细胞随着增殖次数的增加而活力并不减弱，增殖过程中细胞大多细胞随着增殖次数的增加而活力并不减弱，增殖过程中细胞大多处于处于S S期，进行期，进行DNADNA合成。合成。（2）分化潜能性n高分化潜能：高分化潜能： 具有高度分化潜能，可分化形成包括三个胚层在内的各种具有高度分化潜能，可分化形成包括三个胚层在内的各种类型细胞（血细胞、内皮细胞、肌细胞和神经细胞等）。类型细胞（血细胞、内皮细胞、肌细胞和神经细胞等）。n定向分化：定向分化： ESES细胞在体外某些物质诱导下可以发生定向分化，如用细胞在体外某些物质诱导下可以发生定向分化，如用造血基

50、质细胞、不同造血生长因子对单层培养的造血基质细胞、不同造血生长因子对单层培养的ESES细胞进细胞进行诱导分化，可形成各阶段的造血细胞。行诱导分化，可形成各阶段的造血细胞。（3）种系传递性n将将ES细胞注入囊胚后发育，可获得嵌合体，并参与生殖细胞的形成。细胞注入囊胚后发育，可获得嵌合体，并参与生殖细胞的形成。n在嵌合体中一部分组织和细胞来源于受体囊胚细胞，而另一部分来源在嵌合体中一部分组织和细胞来源于受体囊胚细胞，而另一部分来源于于ES细胞。基于其种系传递特性，可在细胞。基于其种系传递特性，可在ES细胞水平进行基因打靶等细胞水平进行基因打靶等操作，研究基因在个体发育中的作用操作，研究基因在个体发

51、育中的作用。3.7.2 ES/EG细胞的鉴定细胞的鉴定 ES/EGES/EG细胞经分离培养，最终建立细胞系，需要根据其细胞经分离培养，最终建立细胞系，需要根据其细胞特性进行一系列鉴定，以了解是否分化变异、干细胞特性进行一系列鉴定，以了解是否分化变异、干细胞的特性或能力是否丧失。细胞的特性或能力是否丧失。n鉴定方法：鉴定方法： 形态学特征；形态学特征； 特异性标志分子的表达；特异性标志分子的表达； 分化潜能测定。分化潜能测定。1. 形态学特征形态学特征 ESES细胞形态结构、核型特征细胞形态结构、核型特征：nESES细胞的形态结构细胞的形态结构( (胞体体积小、核大、有一个或几个核仁胞体体积小、

52、核大、有一个或几个核仁) )和生长特和生长特性性( (呈克隆状生长呈克隆状生长, ,细胞紧密聚集细胞紧密聚集, ,形似鸟巢形似鸟巢, ,界限不清等界限不清等) )对对ESES细胞鉴细胞鉴定。定。n不同不同ESES细胞形态不同，鼠细胞形态不同，鼠ESES细胞集落一般呈紧密的球形，灵长类动物细胞集落一般呈紧密的球形，灵长类动物的的ESES细胞集落相对较为扁平。细胞集落相对较为扁平。2.细胞表面标志鉴定细胞表面标志鉴定(1)(1)碱性磷酸酶的表达碱性磷酸酶的表达检测（检测（alkaline phosphatasealkaline phosphatase ，AKPAKP）：）：nAKPAKP常用来作为

53、鉴定常用来作为鉴定ECEC细胞或细胞或ESES细胞分化与否的标志之一，细胞分化与否的标志之一，未分未分化化ESES细胞表面标记细胞表面标记AKPAKP呈强呈强阳性阳性，细胞一旦分化，则，细胞一旦分化，则AKPAKP呈呈阴性阴性。n可用可用AKPAKP染色的方法进行染色的方法进行AKPAKP检测。检测。2.2.细胞表面标志鉴定细胞表面标志鉴定(2)(2)胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达检测检测n早期胚胎细胞表面均表达早期胚胎细胞表面均表达“胚胎阶段特异性表面抗原胚胎阶段特异性表面抗原”（stage-specific embryonic antigen，SSEA）：

54、）： SSEASSEA是一种糖蛋白，在未分化多能干细胞中是一种糖蛋白，在未分化多能干细胞中SSEASSEA为为阳性阳性，反之，反之呈呈阴性阴性。(3)Oct-4转录子表达产物转录子表达产物n转录因子转录因子Oct-4Oct-4在多能胚胎干细胞和原始生殖细胞中得到在多能胚胎干细胞和原始生殖细胞中得到表达。表达。n当全能细胞分化形成体细胞或胚外组织时，该基因则不再当全能细胞分化形成体细胞或胚外组织时，该基因则不再表达。表达。nOct-4Oct-4基因在维持基因在维持ESES细胞和原肠胚阶段原始生殖细胞全能细胞和原肠胚阶段原始生殖细胞全能性表型起着非常重要的作用。性表型起着非常重要的作用。n可以可以

55、Oct-4Oct-4基因的存在与否作为基因的存在与否作为ESES细胞鉴定的指标之一。细胞鉴定的指标之一。(4)ES(4)ES细胞的端粒酶活性细胞的端粒酶活性n生殖细胞、胚胎细胞、干细胞和肿瘤细胞具有较高的端粒生殖细胞、胚胎细胞、干细胞和肿瘤细胞具有较高的端粒酶活性。随着机体组织、细胞的分化，端粒酶活性逐渐降酶活性。随着机体组织、细胞的分化，端粒酶活性逐渐降低，所以正常体细胞一般无端粒酶活性。低，所以正常体细胞一般无端粒酶活性。举例：举例：胚胎阶段特异性细胞表面抗原（胚胎阶段特异性细胞表面抗原（SSEASSEA）的检测）的检测 鼠、人鼠、人ESCESC表达的表面抗原具有种属差异性。表达的表面抗原

56、具有种属差异性。n小鼠：表达早期胚胎特异性抗原小鼠：表达早期胚胎特异性抗原SSEA-1,SSEA-1,不表达不表达SSEA-3SSEA-3、 SSEA-4SSEA-4。 n人：表达人：表达SSEA-SSEA-、SSEA-4SSEA-4、TRA-1-60TRA-1-60、TRA-1-81,TRA-1-81,不表达不表达SSEA-1SSEA-1。其中其中SSEA-4SSEA-4一直呈强阳性，一直呈强阳性，SSEA-3SSEA-3为弱阳性为弱阳性, ,已已分化的分化的ESCESC的的SSEA-1SSEA-1表达呈强阳性。表达呈强阳性。 体外诱导分化14 d的cripto ES细胞 用anti -tu

57、bulin抗体免疫荧光染色分析显示ES细胞分化成神经细胞（引自Kursad Turksen.Embryonic Stem Cell Protocols（2nd），2006）n人原始生殖嵴细胞（人原始生殖嵴细胞（PGC）分离的）分离的EGC的的SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81均表现为阳性。均表现为阳性。n家兔家兔SSEA-1的表达与小鼠的基本相似，桑椹胚卵裂球和早期囊的表达与小鼠的基本相似，桑椹胚卵裂球和早期囊胚细胞呈阳性，晚期囊胚中部分呈阳性，部分呈弱阳性，少部胚细胞呈阳性，晚期囊胚中部分呈阳性，部分呈弱阳性，少部分呈阴性。因此，常用分呈阴性。因此，

58、常用SSEA-1单克隆抗体来检测单克隆抗体来检测ESC。马ES细胞的分子标记表达（引自Kursad Turksen.Embryonic Stem Cell Protocols（2nd），2006）图A：ES细胞AKP染色阳性 B：大部分ES细胞STAT3特异性抗体免疫组化染色阳性 小鼠小鼠ES细胞检测细胞检测核型的检测核型的检测n使胚胎干细胞保证正常的核型非常重要，只有具有正常核型的使胚胎干细胞保证正常的核型非常重要，只有具有正常核型的胚胎干细胞才能嵌合到宿主着床前胚胎内，共同分化发育成嵌胚胎干细胞才能嵌合到宿主着床前胚胎内，共同分化发育成嵌合体动物；合体动物；n为了进一步鉴定，还可以染色体带

59、型分析。为了进一步鉴定，还可以染色体带型分析。染色体联会复合体的分析（3）分化能力检测）分化能力检测n体外分化实验体外分化实验n将所得细胞制成悬液培养在培养皿中，如所得细胞为将所得细胞制成悬液培养在培养皿中，如所得细胞为ESC，则在培，则在培养过程中部分细胞聚集贴壁养过程中部分细胞聚集贴壁;n培养一段时间后将会分化为神经、肌肉、软骨等不同组织细胞，同培养一段时间后将会分化为神经、肌肉、软骨等不同组织细胞，同时还有部分细胞悬浮生长，先形成简单类胚体，进一步形成囊状胚时还有部分细胞悬浮生长，先形成简单类胚体，进一步形成囊状胚体。根据体。根据ES细胞分化程度不同，可初步了解其分化能力的强弱。细胞分化

60、程度不同，可初步了解其分化能力的强弱。n体内分化实验体内分化实验 以一定量所得细胞以一定量所得细胞腹股沟接种或腹腔注射腹股沟接种或腹腔注射到同源动物或免到同源动物或免疫缺陷小鼠体内，若为疫缺陷小鼠体内，若为ESC，经过一段时间后，动物注射，经过一段时间后，动物注射处可见有组织瘤生成。手术取瘤，常规制作切片观察，可处可见有组织瘤生成。手术取瘤，常规制作切片观察，可见代表内胚层、中胚层和外胚层个胚层的不同组织细胞。见代表内胚层、中胚层和外胚层个胚层的不同组织细胞。体体外外分分化化实实验验体内分化实验（4 4）嵌合体的形成）嵌合体的形成n利用囊胚注射法，应用显微注射仪将利用囊胚注射法，应用显微注射仪