生物化学课件34-DNA的复制和修复复习课程

1、生物化学课件34-DNA的复制和修复1964-1970 1964-1970 发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录 19531953年，年，WatsonWatson和和CrickCrick提出中心法则：遗传信息的单向流动。提出中心法则：遗传信息的单向流动。 中心法则：中心法则：病毒（复制）病毒（复制）复制复制转录转录DNA RNA 蛋白质蛋白质翻译逆转录逆转录RNARNA的复制存在于的复制存在于RNARNA病毒病毒 DNA DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在码的形式编

2、码在DNADNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过并通过DNADNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自中，遗传信息自DNADNA转录给转录给RNA,RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复Reverse transcription中心法则图示中心法则图示 复制：复制：以亲代以亲代DNADNA或或RNARNA为模板，根据

3、为模板，根据碱基配对碱基配对的原则的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代的子代DNADNA或或RNARNA的过程。的过程。几个基本概念：几个基本概念： 逆转录：逆转录：以以RNARNA为模板，在为模板，在逆转录酶逆转录酶的作用下，的作用下，生成生成DNADNA的过程。的过程。 翻译：翻译：亦叫转译，以亦叫转译，以mRNAmRNA为模板，将为模板，将mRNAmRNA的密的密码解读成蛋白质的码解读成蛋白质的氨基酸顺序氨基酸顺序的过程。的过程。 转录：转录：以以DNADNA为模板，按照碱基配对原则合成为模板，按照碱基配对原则合成RNARNA，即将，即将D

4、NADNA所含的遗传信息传给所含的遗传信息传给RNARNA，形成一，形成一条条与与DNADNA链互补的链互补的RNARNA的过程。的过程。第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复一、一、DNADNA的半保留复制的半保留复制2.2.半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据: :1.1.定义：定义： 1958 1958年年MeselsonMeselson和和StahlStahl用同位素用同位素1515N N标记标记大大肠杆菌肠杆菌DNADNA, ,首先证明了首先证明了DNADNA的半保留复制。的半保留复制。 以以亲代亲代DNADNA双链双链为模板以为模板以碱基互补碱基互补方式合成子方式合成子代

5、代DNADNA，这样新形成的子代，这样新形成的子代DNADNA中，一条链来自亲中，一条链来自亲代代DNADNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫式叫半保留复制半保留复制。第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复Testing Models for DNA replicationMatthew Meselson and Franklin Stahl (1958)DNADNA复复制的可制的可能方式能方式全保留与全保留与全新复制全新复制分散复制分散复制半保留半保留复制复制DNADNA半保留复制图示：半保留复制图示： 半保留复制的证明：半保留复制的证明：

6、Meselson Meselson 和和StahlStahl将同位素将同位素1515N N标记的标记的1515NHNH4 4ClCl加入大肠杆菌的培养基中培养加入大肠杆菌的培养基中培养1212代，代，使大肠杆菌的使大肠杆菌的DNADNA都带上都带上1515N N的标记，然后的标记，然后将该大肠杆菌转入将该大肠杆菌转入1414N N的普通培养基中培养的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四后，分离子一代、子二代、子三代、子四代代DNADNA，进行，进行氯化铯氯化铯密度梯度离心，实验密度梯度离心，实验证明了证明了DNADNA的半保留复制。的半保留复制。第第34章章 DNA的复制和修复

7、的复制和修复1515N-DNAN-DNA的密度大于的密度大于1414N-DNAN-DNA的密度的密度亲代亲代DNADNA（1515N N1515N N）子一代子一代DNADNA（1515N N1414N N）子二代子二代DNA (DNA (1515N N1414N N，1414N N1414N 1:1)N 1:1)子三代子三代DNA (DNA (1515N N1414N N，1414N N1414N 1:3)N 1:3)子四代子四代DNA (DNA (1515N N1414N N，1414N N1414N 1:7 )N 1:7 )亲代亲代DNADNA与子二代与子二代DNADNA的混合物的混合物

8、亲代亲代DNADNA与子四代与子四代DNADNA的混合物的混合物复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Cairns实验实验) 将将3H-胸苷标记大肠杆菌胸苷标记大肠杆菌DNA，经过，经过近近两代两代的时间，的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌胸苷掺入大肠杆菌DNA 。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分占整个染色体的三分之

9、二，其中一条双和一股非放射性链构成。已复制部分占整个染色体的三分之二，其中一条双链（链（ B ）仅有一股链是标记的，另外一股双链（）仅有一股链是标记的，另外一股双链（ A ）的两股链都是标记的，）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。微米。ABC环状环状DNA的复制的复制 ABC复制中的大肠杆菌染色复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图体放射自显影图DNADNA的半保留复制的生物学意义：的半保留复制的生物学意义： DNA DNA在代谢上的稳定性并非指在代谢上的稳定性并非指DNADNA是一种惰性物质。是一种惰性物质。 DNA

10、DNA的半保留复制表明了的半保留复制表明了DNADNA在代谢在代谢上的上的稳定性稳定性，是，是保证亲代的遗传信息保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。稳定地传递给后代必要措施。第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复二、二、DNADNA复制的起点与方向复制的起点与方向双向复制双向复制单向复制单向复制复制中的DNA 复制原点复制原点复制叉复制叉第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复DNADNA复制的主要方式复制的主要方式 大肠杆菌双链大肠杆菌双链环状环状DNADNA的复制（的复制（一个一个复制起点，复制起点，双向复制）双向复制）3 不同位置不同位置D-D-环式环式复制方式（线粒体

11、双链环状复制方式（线粒体双链环状DNADNA：两条链的两条链的复制起点复制起点不同位置，且复制不同步）不同位置，且复制不同步） 真核细胞真核细胞线状染色体线状染色体DNADNA的复制方式（的复制方式（多个多个复制起复制起点，双向复制）点，双向复制） 单向单向滚环式滚环式复制（噬菌体复制（噬菌体 X174DNAX174DNA单链环状）单链环状）DNA的几种复制方式的几种复制方式 亲代双链（或单链）亲代双链（或单链）DNADNA的一条链在的一条链在DNADNA复制复制起点处被切开，其起点处被切开，其55端游离出来。端游离出来。DNADNA聚合酶聚合酶便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在便可以将脱氧核糖核苷

12、酸聚合在3-OH3-OH端。端。当复制向前进行时，亲代当复制向前进行时，亲代DNADNA上被切断的上被切断的55端端继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所结合。因为结合。因为55端从环上向下解链的同时伴有端从环上向下解链的同时伴有环状双链环状双链DNADNA环绕其轴不断的旋转，而且以环绕其轴不断的旋转，而且以3-OH3-OH端为引物的端为引物的DNADNA生长链则不断地以另一生长链则不断地以另一条环状条环状DNADNA链为模板向前延伸，因而称为滚环链为模板向前延伸，因而称为滚环(Rolling circle)复制。复制。 在这种复制方式中，在这种复制方式中

13、，DNA的延伸可以一直进行下的延伸可以一直进行下去，产生的去，产生的DNA链可以是亲代链可以是亲代DNA单位长度的许单位长度的许多倍。这么长的多倍。这么长的DNA链是如何转变为单位长度的链是如何转变为单位长度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由特异的内分子的，目前尚不清楚。可能是由特异的内切酶切开产生单位长度的子代切酶切开产生单位长度的子代DNA。这些。这些DNA可可自身环绕，或保持线性分子状态。自身环绕，或保持线性分子状态。 双链环在固定点解开进行复制，但两条链的双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，一条链先复制，另一合成是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而

14、被取代，在电镜下可以看到条链保持单链而被取代，在电镜下可以看到呈呈D D环形状。待一条链复制到一定程度，露出环形状。待一条链复制到一定程度，露出另一链的复制起点，另一条链才开始复制。另一链的复制起点，另一条链才开始复制。这表明复制起点是以一条链为摸板起始合成这表明复制起点是以一条链为摸板起始合成DNADNA的一段序列；两条链的起点并不总在同一的一段序列；两条链的起点并不总在同一点上，当两条链的起点分开一定距离时就产点上，当两条链的起点分开一定距离时就产生生D D环（环（D-loopD-loop）复制。）复制。F.F.多复制叉复制多复制叉复制 第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮第一轮复制尚

15、未完成，复制起点就开始第二轮的复制。的复制。 三、三、DNADNA复制的半不连续性复制的半不连续性前导链前导链滞后链滞后链冈崎片段冈崎片段前导链：前导链：以以3 5 方向的亲方向的亲代链为模板连续合成的子代链。代链为模板连续合成的子代链。滞后链：滞后链：以以5 3方向的亲方向的亲代链为模板的子代链先逆复制代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。连接成滞后链。半不连续复制的发现半不连续复制的发现 同位素实验，用含同位素实验，用含3 3H H的的dTdT标记用标记用T T4 4噬菌体感染的大肠噬菌体感染的大肠杆菌杆菌 短时间内分离的短时间内分离的

16、DNADNA均为均为DNADNA小片段小片段一段时间一段时间后后检测到检测到 DNADNA大片段。当用大片段。当用DNADNA连接酶的缺失的变异连接酶的缺失的变异株时，检测到大量株时，检测到大量DNADNA片段的积累。片段的积累。证明证明DNADNA复制中有复制中有小片段合成。小片段合成。 测定测定DNADNA小片段，远远大于合成小片段，远远大于合成DNADNA的一半。似乎两条的一半。似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于链都是不连续合成的，后发现是由于U U替代替代dTdT渗入渗入DNADNA中，中，而被尿嘧啶而被尿嘧啶-N-N-糖基酶切除所致。糖基酶切除所致。 在缺少尿嘧啶在缺少尿嘧啶-

17、N-N-糖基酶的突变植株中，糖基酶的突变植株中，DNADNA的的U U不再不再被切除，则被切除，则检测到一半检测到一半3 3H H标记出现在小片段（冈崎片段）标记出现在小片段（冈崎片段）中。中。 1968 1968日本学者冈崎：日本学者冈崎：Arthur Kornberg Arthur Kornberg 1918 Stanford University Stanford University Stanford, CA, USAStanford, CA, USA The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959for their discovery o

18、f the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid四、与四、与DNADNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质n原料：原料：四种脱氧核苷三磷酸四种脱氧核苷三磷酸 （dATPdATP、dGTP dCTP dTTP)dGTP dCTP dTTP)n需要模板：需要模板：以以DNADNA为模板链，合成子代为模板链，合成子代DNADNA，模板可以，模板可以是双链，也可以是单链是双链，也可以是单链DNADNA。合成产物与模板互补。合成产物与模板互补。n 需要引物：需要引物：

19、一小段一小段RNA(RNA(或或DNADNA）为引物，在大肠杆）为引物，在大肠杆 菌中，菌中，DNADNA的合成需要一段的合成需要一段RNARNA链作为引物，引物含链作为引物，引物含3 -OH. 3 -OH. n合成方向：合成方向：5 5 3 3 ( (一一) ) DNADNA聚合酶：聚合酶：19561956年年KornbergKornberg等在大肠杆菌中等在大肠杆菌中首先发现首先发现DNADNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。泛存在。该酶的催化性质如下：该酶的催化性质如下：第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复（二）大肠杆菌（二）大肠杆菌D

20、NADNA聚合酶聚合酶（1 1）5 5 3 3 聚合酶聚合酶功能（但持续合成功能（但持续合成DNADNA的能力差）；的能力差）； （2 2）3 3 5 5外切酶外切酶活性（对双链无作用，在正常聚合活性（对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）；对的单链，校对功能。）；（3 3）还具有）还具有5 5 33外切酶外切酶活性（双链有效）；活性（双链有效）；1 1、DNADNA聚合酶聚合酶:19561956年年KornbergKornberg首先从首先从大肠杆菌大肠杆菌中分中分离。该酶为单体酶离。

21、该酶为单体酶, ,含一个锌原子。为多功能酶，具有含一个锌原子。为多功能酶，具有: : 该酶缺失时大肠杆菌仍具有该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNADNA合成酶活性，只是对合成酶活性，只是对DNADNA损伤的修复能力损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对酶主要是对DNADNA损伤的修复，以及在损伤的修复，以及在DNADNA复制时复制时RNARNA引物切引物切除及其缺口的填补。除及其缺口的填补。第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复DNADNA聚合酶催化的反应：聚合酶催化的反应：DNADNA聚合酶聚合酶的功能的功能1聚合作用在引物RNA3-OH末端

22、，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐个将核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3-OH与5-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3-5外切酶活性位点所识别并切除之。 235外切酶活性校对作用这种酶活性的主要功能是从35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。 353外切酶活性切除修复作用从53方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分

23、(双链)磷酸二酯键有切割活力作用。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激53外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。 4焦磷酸解作用DNApol的这种活性可以催化3末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi (dNMP)n-x+X(dNPPP)DNA 5焦磷酸交换作用催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+

24、PPiDNA （4、5两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。 ）2 2、DNADNA聚合酶聚合酶： 多亚基酶，聚合作用，聚合活力比多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNADNA聚聚合酶合酶高；持续合成高；持续合成DNADNA的能力差。该酶缺的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有失时大肠杆菌仍具有DNADNA合成能力，推测该合成能力，推测该酶仍然不是真正的酶仍然不是真正的DNADNA聚合酶。该酶聚合酶。该酶具有具有33 5 5外切酶活性外切酶活性。其功能可能在。其功能可能在修复修复紫外光引起的紫外光引起的DNADNA损伤损伤中起作用。中起作用。第第34章章

25、DNA的复制和修复的复制和修复3 3、DNADNA聚合酶聚合酶 多亚基酶，含多亚基酶，含十种亚基十种亚基: :（），其中（，其中（）称）称为为核心酶核心酶，2 2称为夹子，（称为夹子，（2 2）组成）组成复合物复合物，其主要功能是帮助，其主要功能是帮助亚基夹住亚基夹住DNADNA，故，故称为称为夹子装配器夹子装配器，该酶，该酶DNADNA合成的合成的持续能力强持续能力强，主，主要与该结构有关。另外，该酶合成要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因缺失时大肠杆菌因DNADNA复制抑制而致死。因此认为复制抑制而致死。因此认为该酶该酶DNADNA的真正复制酶的真

26、正复制酶。第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复DNADNA聚合酶聚合酶全酶的亚基组成全酶的亚基组成亚基亚基 相对分相对分子量子量亚基亚基数目数目基因基因亚基功能亚基功能1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadXholAholBholCholDdnaN聚合作用聚合作用3 5外切酶的校对功能外切酶的校对功能组建核心酶组建核心酶使核心酶二聚化使核心酶二聚化依赖依赖DNADNA的的ATPATP酶，形成酶，形成复合物复合物与与亚基结合，形成亚基结合，形成复合物复合物形成形成复合

27、物复合物形成形成复合物复合物形成形成复合物复合物两个两个亚基形成滑动夹子，以提高酶亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力。的持续合成能力。DNA聚合酶聚合酶的异二聚体的异二聚体前导链的合成前导链的合成滞后链的合成滞后链的合成 DNA DNA聚合酶聚合酶的的- -钳子钳子俯视图俯视图DNA双螺旋双螺旋DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶结构基因结构基因不同种类的亚基不同种类的亚基数目数目相对分子质量相对分子质量35外切酶外切酶53外切酶外切酶聚合速度（核苷聚合速度（核苷酸酸/分）分）持续合成能力持续合成能力功能功能Pol A1103,0001,000-1,2003-200切除

28、引物，修复Pol B788,0002,4001,500修复Pol C10830,00015,000-60,000500,000复制大肠杆菌三种大肠杆菌三种DNA聚合酶比较聚合酶比较( (三）三）DNADNA连接酶：连接连接酶：连接DNADNA双链中的单链切口双链中的单链切口作用特点：作用特点： 大肠杆菌和其它细菌的大肠杆菌和其它细菌的DNADNA连接酶连接酶要求要求NADNAD+ +提供能量；在高等生物和噬菌体中的提供能量；在高等生物和噬菌体中的DNA连接酶连接酶，则要求，则要求ATPATP提供能量。提供能量。T T4 4噬菌体的噬菌体的DNADNA连接酶不仅能连接双链连接酶不仅能连接双链DN

29、ADNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链端的平头双链DNADNA。 DNA DNA连接酶在连接酶在DNADNA复制、损伤修复、重复制、损伤修复、重组组等过程中起重要作用。等过程中起重要作用。第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复DNADNA连接酶作用机理连接酶作用机理1、拓扑异构酶、拓扑异构酶 拓扑异构酶：拓扑异构酶：催化催化DNADNA的拓扑连环数发的拓扑连环数发生变化的酶，在生变化的酶，在DNADNA重组修复和其它转变方重组修复和其它转变方面起重要作用。面起重要作用。 除连环数不同外其它性质均相同的除连环数不同外其它性质均相同的DNADNA

30、分子称为分子称为拓扑异构体拓扑异构体，引起拓扑异构体反，引起拓扑异构体反应的酶称为应的酶称为拓扑异构酶拓扑异构酶。第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复( (四四) )与与DNADNA合成有关的其它蛋白因子合成有关的其它蛋白因子( (大肠杆菌中大肠杆菌中) )蛋白质蛋白质功能功能相对分子量相对分子量（10103 3）分子分子/ /细胞细胞DNADNA旋转酶（或拓旋转酶（或拓扑异构酶）扑异构酶）DNADNA解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白引物合成酶引物合成酶DNADNA聚合酶聚合酶引入或松开引入或松开超螺旋超螺旋使双链使双链DNADNA解链解链稳定单链区稳定单链区合成合成RNARNA引

31、物引物除去引物并除去引物并填满缺口填满缺口4004006565747460601091095050300300100100300300 拓扑异构酶拓扑异构酶：使使DNADNA一条链发生断裂和再一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。量。主要集中在活性转录区，同转录有关。 拓扑异构酶拓扑异构酶：使使DNADNA两条链发生断裂和再两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由连接。当引入负超螺旋时需要由ATPATP提供能量，提供能量，同复制有关。同复制有关。两类拓扑异构酶作用特点两类拓扑异构酶作用特点: :

32、 二者共同控制二者共同控制DNADNA的拓扑结构。的拓扑结构。第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复2 2、解螺旋酶、解螺旋酶 （解链酶）（解链酶） 通过水解通过水解ATPATP将将DNADNA两条链打开。两条链打开。E.coliE.coli中的中的reprep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I I、IIII、IIIIII。每解开一对碱基需要水解。每解开一对碱基需要水解2 2个个ATPATP分子。分子。 稳定稳定DNADNA解开的单链，防止复性和保护单解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。链部分不被核酸酶水解。3 3、单链结合蛋白：、单链结合蛋白：

33、第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复解螺旋酶（解螺旋酶（helicasehelicase）可以促使）可以促使DNADNA在复制叉处在复制叉处打开双链。解螺旋酶可以和单链打开双链。解螺旋酶可以和单链DNADNA结合，并且结合，并且与与ATPATP结合，利用结合，利用ATPATP分解成分解成ADPADP时产生的能量沿时产生的能量沿DNADNA链向前运动促使链向前运动促使DNADNA双链打开。目前，大肠杆双链打开。目前，大肠杆菌中发现有两种解螺旋酶参与这个过程，一种称菌中发现有两种解螺旋酶参与这个过程，一种称为解螺旋酶为解螺旋酶I I、IIII、IIIIII，与滞后链的模板，与滞后链的模板D

34、NADNA结结合沿合沿5353方向运动方向运动; ;第二种称为第二种称为RepRep蛋白，和前蛋白，和前导链的模板导链的模板DNADNA结合沿结合沿3535方向运动。方向运动。 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(SSBP) 螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNADNA不会长久存在，会很快重新配对形成双链不会长久存在，会很快重新配对形成双链DNADNA或被核酸酶降解。在细或被核酸酶降解。在细胞内有大量单链胞内有大量单链DNADNA结合蛋白能很快地和单链结合蛋白能很快地和单链DNADNA结合，防止其重新结合，防止其重新配

35、对形成双链配对形成双链DNADNA或被核酸酶降解。一个或被核酸酶降解。一个SSBPSSBP四聚体结合于单链四聚体结合于单链DNADNA上可以促进其他上可以促进其他SSBPSSBP四聚体现相邻的单链四聚体现相邻的单链DNADNA结合，这个过程称为协结合，这个过程称为协同结合同结合(cooperative binding)(cooperative binding)，SSBPSSBP结合到单链结合到单链DNADNA上后，使其呈上后，使其呈伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链DNADNA作为模板。作为模板。SSBPSSBP可以重可以重复使用，当新生的复使用，当新生的

36、DNADNA链合成到某一位置时，该处的链合成到某一位置时，该处的SSBPSSBP便会脱落，便会脱落，并被重复利用。并被重复利用。 引发体可以沿模板链引发体可以沿模板链5 5 3 3方向移动方向移动, ,具有具有识识别合成起始位点别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引的功能，移动到一定位置上即可引发发RNARNA引物的合成。移动和引发均需要引物的合成。移动和引发均需要ATPATP提供能量，提供能量， nn蛋白具有蛋白具有ATPATP酶的活力。引发体的移动与复制叉酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与移动的方向相同，与冈崎片段冈崎片段的合成方向相反。的合成方向相反。3 3、引物合成

37、酶与引发前体、引物合成酶与引发前体 引物合成酶：引物合成酶：催化引物催化引物RNARNA的生成的生成 引发前体引发前体: :它由多种蛋白质它由多种蛋白质dnaAdnaA、dnaBdnaB、dnaCdnaC、n n、nn、nn和和i i组成。引发前体再与引发酶结组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。合组装成引发体。 第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复（五）、参（五）、参与与DNA复制复制的酶与蛋白的酶与蛋白因子总览图因子总览图五、五、 DNADNA的复制过程的复制过程：（以大肠杆菌为例）（以大肠杆菌为例） 复制的终止复制的终止： 复制的起始复制的起始1 1、起始复合物的形成：称为引

38、发、起始复合物的形成：称为引发2 2、RNARNA引物的合成引物的合成 链的延伸：链的延伸：第第34章章 DNA的复制和修复的复制和修复复制原点复制原点oriC和原点的识别：和原点的识别： 从复制原点到终点，组成一个从复制原点到终点，组成一个复制单位复制单位，叫，叫复制子复制子（基因组独立进行复制的单位）。（基因组独立进行复制的单位）。 DNA DNA的复制有特定的起始位点，叫做的复制有特定的起始位点，叫做复制原点复制原点。常用。常用ori C(ori C(或或o o）表示。大肠杆菌的复制原点）表示。大肠杆菌的复制原点ori Cori C由由245245个个bpbp构成，含两组保守的重复序列：

39、三个构成，含两组保守的重复序列：三个13bp13bp的序列（富含的序列（富含A A、T T的序列）和四个的序列）和四个9bp9bp的序列；许多生物的复制原点也都是的序列；许多生物的复制原点也都是富含富含A A、T T的区段的区段。复制原点复制原点由由DnaADnaA蛋白识别，蛋白识别， 在原点由在原点由DnaBDnaB蛋白（解螺旋蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链补链(DNA(DNA双链的解开还需双链的解开还需DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶 、 SSB),SSB),在原在原点处形成一个眼状结构，叫点处形成一个眼

40、状结构，叫复制眼复制眼。（一）复制起始（一）复制起始1 1、拓扑异构酶解开超螺旋。、拓扑异构酶解开超螺旋。2 2、Dna ADna A蛋白识别并在蛋白识别并在ATPATP存在存在下结合于四个下结合于四个9bp9bp的重复序列。的重复序列。3 3、在类组蛋白（、在类组蛋白（HUHU、ATPATP参与下参与下, , Dan ADan A蛋白变性蛋白变性1313个个bpbp的重复序的重复序列列, ,形成开链复合物。形成开链复合物。4 4 、Dna BDna B借助于水解借助于水解ATPATP产生的产生的能量在能量在Dna CDna C的帮助下沿的帮助下沿5 3 5 3 方向移动，解开方向移动，解开D

41、NADNA双链，形成双链，形成前引发复合物。前引发复合物。5 5、单链结合蛋白结合于单链。、单链结合蛋白结合于单链。6 6、引物合成酶（、引物合成酶（Dna GDna G蛋白）开蛋白）开始合成始合成RNARNA引物。引物。(二二) 链的延链的延长（冈崎片长（冈崎片段的合成）段的合成） 真核生物的真核生物的冈崎片段为：冈崎片段为：100-200bp100-200bp 原核生物的原核生物的冈崎片段为：冈崎片段为：1000-2000bp1000-2000bp DNA DNA链的延伸链的延伸 在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下，的催化下，以四种以四种5 -5 -脱氧核苷三磷脱氧核苷三磷酸为底物，在酸

42、为底物，在RNARNA引物的引物的33端以磷酸二酯键连接上脱端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。磷酸。DNADNA链的延伸同时进链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。两条链方向相反。 前导链前导链 滞后链滞后链 冈崎片段冈崎片段 半不连续复制半不连续复制冈崎模型冈崎模型冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接: 前导链和滞后链的合成（前导链和滞后链的合成（DNADNA聚合酶的异二聚体催化）聚合酶的异二聚体催化）(三三) 复制的终止复制的终止顺时针终止陷阱顺时针终止陷阱逆时针终

43、止陷阱逆时针终止陷阱 Ter: Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp20bp的序列，终止的序列，终止利用物质利用物质TusTus可识别并结合，从而导致可识别并结合，从而导致DNADNA复制的终止。复制的终止。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA复制的终止复制的终止( (四四) DNA) DNA复制的精确性（高保真复制）复制的精确性（高保真复制）1 1、碱基的配对规律：、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为对保证碱基配错几率约为1/101/104 41/101/105 5。2 2、DNADNA聚合酶的聚

44、合酶的3535外切酶活性的校对功能，外切酶活性的校对功能，使使碱基的错配几率又降低碱基的错配几率又降低10010010001000倍。倍。3 3、DNADNA的损伤修复系统。的损伤修复系统。 DNA DNA复制必须具有复制必须具有高度精确性高度精确性，在大肠杆菌的细胞，在大肠杆菌的细胞DNADNA复制中其复制中其错误率约为错误率约为1/101/109 91/101/101010，即每即每10109 910101010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体体DNADNA复制复制100010001000010000次才出现一个核苷酸的错误。次才出现一

45、个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：这么高的精确性的保证主要与下列因素有关： 六、复制起始六、复制起始的时序控制的时序控制七、真核生物七、真核生物DNADNA复制复制的特点的特点4 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体开始复制；而在快速生长的原核生物染色体DNADNA复制复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用往往采用更多的复制起点更多的复制起点。1 1、真核生物染色体有多个复制起点，称为真核生物染色体有多个复制起点，称为

46、自主复自主复制序列（制序列（ARSARS）或复制基因）或复制基因(replicator);(replicator);多复制眼，多复制眼，呈双向复制，多复制子。呈双向复制，多复制子。2 2、冈崎片段长约冈崎片段长约200bp200bp( (原核原核1000-2000bp)1000-2000bp)。3 3、真核生物真核生物DNADNA复制速度复制速度比原核比原核慢慢，速度为，速度为100010003000bp/min(3000bp/min(仅为原核生物的仅为原核生物的1/201/201/501/50）。）。真核真核DNADNA复制特点复制特点7 7、RPARPA：真核生物的单链结合蛋白；真核生物的

47、单链结合蛋白；RNaseHRNaseH1 1和和MF-1MF-1切除切除RNARNA引物，引物，DNADNA聚合酶聚合酶填补缺口。填补缺口。5 5、真核生物有真核生物有多种多种DNADNA聚合酶聚合酶,DNA,DNA聚合酶聚合酶（）是真正的复制酶，在是真正的复制酶，在PCNAPCNA存在下有持续的合成能力存在下有持续的合成能力（PCNAPCNA称为称为增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原，相当于大肠杆菌，相当于大肠杆菌DNADNA聚聚合酶合酶的的-夹子）。夹子）。RFCRFC蛋白相当于夹子装配器。蛋白相当于夹子装配器。6 6、真核生物线性染色体两端有真核生物线性染色体两端有端粒结构端粒结构，它是由许，

48、它是由许多成串的重短复序列组成，端粒功能是稳定染色体末多成串的重短复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5-5-末段在消除末段在消除RNARNA引物后造成的空缺，使染色体引物后造成的空缺，使染色体保保持持一定长度一定长度。端粒酶端粒酶是含一段是含一段RNARNA的逆转录酶的逆转录酶. .端粒酶（端粒酶（telomerase） DNA复制需要引物，但在线形复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊如

49、果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶端粒酶是是一种含一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于催化互补于RNA模板的模板的DNA片段的合成，使复制以后的线片段的合成，使复制以后的线形形DNA分子的末端保持不变。分子的末端保持不变。 初步研究表明，人体中生殖细胞的端初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随

50、个体的老化而逐步缩短。对此的一则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识会有助于对生命衰老的认识。5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型3 5 TTTTGGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3 5 TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3 5 AATTTTG5 3 AAAACCCCAAA

51、ACCCCCCAGTTTTG 整合和整合和杂交杂交移位和移位和再杂交再杂交端粒合成的完成端粒合成的完成TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT5 3 nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTCCCCT nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTAAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n进一步加工进一步加工继续继续延伸延伸动画动画真核细胞内有五种真核细胞内有五种DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合聚合酶酶DNADNA聚合聚合酶酶 DNADNA聚聚合酶合酶 DNADNA聚合聚合酶酶DNAD

52、NA聚合聚合酶酶定位定位亚基数目亚基数目外切酶活性外切酶活性引物合成酶活引物合成酶活性性持续合成能力持续合成能力抑制剂抑制剂功能功能细胞核细胞核4 4中等中等蚜肠霉素蚜肠霉素引物合成引物合成细胞核细胞核1 1低低双脱氧双脱氧TTPTTP修复修复线粒体线粒体2 23 3 55外切酶外切酶高高双脱氧双脱氧TTPTTP线粒体线粒体DNADNA合成合成细胞核细胞核2 2 3 5外切酶外切酶有有PCNAPCNA时时高高蚜肠霉素蚜肠霉素核核DNADNA合成合成细胞核细胞核1 15 3 外切酶外切酶高高蚜肠霉素蚜肠霉素修复修复真核细胞真核细胞DNADNA复制示意图复制示意图八、八、DNADNA损伤的修复损伤

53、的修复 DNA DNA突变：突变： DNADNA的的核苷酸顺序核苷酸顺序永久性的改变称为永久性的改变称为DNADNA的的突变。其主要形式有：突变。其主要形式有： 1.1.点突变：点突变：DNADNA分子中一个碱基对替代另一个碱基对分子中一个碱基对替代另一个碱基对称为点的突变。称为点的突变。 2.2.插入作用：插入作用：DNADNA分子中插入一个或几个碱基称为插分子中插入一个或几个碱基称为插入作用。入作用。 3.3.缺失作用：缺失作用： DNADNA分子中缺失一个或多个碱基对称为分子中缺失一个或多个碱基对称为缺失作用。缺失作用。 DNA DNA在复制时产生错配，病毒基因整合，某些物化因在复制时产

54、生错配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，都可能使子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，都可能使DNADNA的的结构及功能发生改变结构及功能发生改变。从而引起生物突变，甚至导致。从而引起生物突变，甚至导致死亡。死亡。 DNA DNA的损伤与的损伤与DNADNA突变：突变：DNADNA突变可能导致肿瘤的发生突变可能导致肿瘤的发生: 着色性干皮病：着色性干皮病：对嘧啶二聚体和大的对嘧啶二聚体和大的DNADNA损伤修损伤修复酶的缺失而产生的一种皮肤癌。复酶的缺失而产生的一种皮肤癌。 沉默突变：沉默突变：突变影响非必需的突变影响非必需的DNADNA或突变对一个或突变对一个基因的功能

55、的影响可忽略，称为沉默突变。基因的功能的影响可忽略，称为沉默突变。 回复突变：回复突变：一些突变可以克服第一次突变造成的一些突变可以克服第一次突变造成的影响，这类突变称为回复突变。影响，这类突变称为回复突变。 动物动物细胞的突变细胞的突变与癌的发生有强烈的相关性。与癌的发生有强烈的相关性。通常生物体通常生物体DNADNA的损伤有一系列的的损伤有一系列的修复机制修复机制，如：，如：错配修复、碱基的切除修复、核苷酸的切割修复、错配修复、碱基的切除修复、核苷酸的切割修复、直接修复、重组修复等。直接修复、重组修复等。DNADNA损伤的修复机制损伤的修复机制: :1 1、参与错配修复的酶与蛋白质、参与错

56、配修复的酶与蛋白质DamDam甲基化酶甲基化酶 ; MutH; MutH、MutLMutL、MutSMutS蛋白蛋白 ; ; 解螺旋酶解螺旋酶 ; DNA ; DNA聚合酶聚合酶 ; ;外切酶外切酶、 、 ； RecJRecJ核酸酶核酸酶DNADNA连接酶连接酶 ； SSBSSB（一）错配修复（一）错配修复MutS识别并结合于碱基错配处识别并结合于碱基错配处MutH-MutLMutH-MutL二聚体结合后沿两个方向二聚体结合后沿两个方向移动，形成移动，形成DNADNA环，直至遭遇半甲基环，直至遭遇半甲基化的化的CTAGCTAG。MutH在在CTAG的的5-端切开一个切口，核端切开一个切口，核酸外切酶酸外切酶、沿沿3 5方向切除含配错方向切除含配错碱基的新链碱基的新链DNADNA聚合酶聚合酶补缺，补缺，DNADNA连接酶连接切口连接酶连接切口。高高度度耗耗能能的的错错配配修修复复这是最早发现的DNA修复方式。修复是由细菌中的DNA光解酶（photolyase）完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300-600nm波长的光照射，