金匮肾气丸对2型糖尿病肾病大鼠igf-et及心脏组织形态影响

1、独 创 性 声 明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本研究做出奉献的个人和集体均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解甘肃中医学院有关保存、使用学位论文的规定，本人同意学院保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权甘肃中医学院可以将学位论文的全部或局部内容编入有关数据库进行检索，可以采用任

2、何复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书学位论文作者签名：导师签名：签字日期：签字日期：年年月月日日目 录中 文 摘 要 . 1ABSTRACT . 3缩 略 词 表 . 5前 言 . 6一 立 题 依 据 . 71 现代医学研究进展 . 71.1 糖尿病肾病流行病学概况 . 71.2 糖尿病肾病的发病机制 . 71.3 糖尿病肾病的临床分期 . 111.4 糖尿病肾病的现代医学治疗现状 . 122 传统医学研究进展 . 122.1 糖尿病及糖尿病肾病中医病机概述 . 122.2 中医药治疗糖尿病肾病研究进展 . 143 选取实验指标的依据 . 153.1 胰岛素样生长

3、因子-1IGF-1 . 153.2 血浆内皮素ET . 163.3 糖尿病肾病中 IGF-1 与 ET 的关系 . 173.4 心脏组织 . 17二 实 验 研 究 . 191 实验材料 . 191.1 试验药物及试剂 . 191.2 实验仪器 . 192 技术路线图 . 203 实验方法 . 213.1 造模与分组 . 213.2 给药 . 213.3 标本采集与处理 . 213.4 检测指标 . 223.5 统计学处理 . 224 实验结果 . 234.1 金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠给药前后血糖的影响 . 234.2 金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠血脂的影响 . 244.3 金

4、匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠血肌酐、尿素氮的影响 . 254.4 金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠尿白蛋白排泄率的影响 . 264.5 金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 的影响 . 274.6 金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠心脏组织形态的影响 . 285 讨论 . 295.1 模型评价 . 295.2 金匮肾气丸的选用依据 . 295.3 罗格列酮的选用依据 . 305.4 金匮肾气丸治疗 2 型糖尿病肾病的机理探讨 . 316结语 . 337 问题与展望 . 33参考文献 . 34致谢 . 40附录 1附录二心脏组织切片. 41动物实验设施使用证 . 42附录三

5、 实验动物质量合格证 . 43附录四 在校期间发表论文 . 44金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响中 文 摘 要目的：观察金匮肾气丸对实验性 2 型糖尿病肾病大鼠血清 IGF-1、血浆 ET 以及心脏组织形态的影响，探讨金匮肾气丸防治 2 型糖尿病肾病的机制。方法：SPF 级 Wistar 大鼠 60 只，雄性,体重为 20020g，普通饲料适应性喂养 1周后，将大鼠按体重编号，以随机数字表法抽取 8 只为空白组，喂以普通饲料；其余52 只大鼠喂以高脂高糖饲料诱发胰岛素抵抗。第 6 周，分 2 次左侧下腹部腹腔注射30mg/kg 链脲佐菌素Strepto

6、zotocin，STZ，诱发 2 型糖尿病肾病大鼠模型。第 8 周，检测相关指标后选择造模成功的 40 只大鼠，称重并按体重编号，以随机数字表法分为5 组：模型组、西药罗格列酮组、金匮肾气丸大剂量组、金匮肾气丸中剂量组和金匮肾气丸小剂量组，分别给予生理盐水、罗格列酮、金匮肾气丸溶液灌胃治疗。第 13 周,于实验结束前一天，用代谢笼收集 24h 尿标本以测定 24h 尿白蛋白含量，并计算尿白蛋白排泄率(UAER)。取血检测各组大鼠血糖、血肌酐SCr、血尿素氮(BUN)、总胆固醇TC、甘油三酯TG、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、胰岛素样生长因子-1IGF-1和内皮素ET含量；处死大鼠，取

7、大鼠心脏组织切片，并观察心脏形态改变。结果：模型组与空白组相比拟，血糖、血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白排泄率、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和内皮素ET均升高，而高密度脂蛋白与胰岛素样生长因子-1IGF-1降低P0.01。与模型组比拟，罗格列酮组和金匮肾气丸大剂量组血糖、血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白排泄率、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、内皮素均降低，而高密度脂蛋白和胰岛素样生长因子-1 升高P0.01 或 P0.05；金匮肾气丸中剂量组，除高密度脂蛋白以外差异均有统计学意义P0.01 或 P0.05；金匮肾气丸小剂量组甘油三酯、尿白蛋白排泄率、胰岛素样生长因子-1 和内皮素降低，差异有统计学意

8、义P0.01 或 P0.05。与罗格列酮组比拟，金匮肾气丸小剂量组内皮素升高，差异有统计学意义P0.01, 金匮肾气大、中、小剂量组胰岛素样生长因子-1 均无明显差异P0.05。与中、小剂量组比拟，金匮肾气丸大剂量组血糖、尿白蛋白排泄率、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白均降低，差异有统计学意义P0.01 或 P0.05。各治疗组均可不同程度的修复受损的心肌组织，罗格列酮组与金匮肾气丸大、中剂量组优于小剂量组。1金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响结论：金匮肾气丸有降低 2 型糖尿病肾病大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白排泄率、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂

9、蛋白和血浆内皮素的作用，可升高高密度脂蛋白及胰岛素样生长因子-1 的含量，从而防治 2 型糖尿病肾病的发生与开展，同时亦促进心脏受损组织的修复。关键词：金匮肾气丸；糖尿病肾病；尿白蛋白排泄率；IGF-1；ET；心脏组织2金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响ABSTRACTObjective: To observe the effects on insulin-like growth factor-1(IGF-1) , endothelin(ET) and the heart tissue morphologic changes in the experim

10、ental rats of type 2 diabeticnephropathyDNby using Jin kui shen qi pill. To explore the mechanism of the preventionand cure of type 2 diabetic nephropathy.Methods: 60 SPF grade Wistar male rats whose weight were about 20020g wereselected to feed the normal food for 1 week. Number the rats according

11、to their weight, then 8rats would be selected randomly as the blank group for ordinary food. The remaining 52 ratswere fed with the high-fat and high-sugar food to cause the insulin resistance. At the 6th week,the 52 rats would be undergo intraperitoneal injection twice on left hypogastrium with30mg

12、kg-1 streptozotocin (STZ) to made Type 2 diabetic nephropathy rats models. At the 8thweek, test the related indexes and select 40 successful animal models which were dividedrandomly into 5 groups: a models group, a rosiglitazone (RSG) group, a Jin kui shen qi pill(JK) high dose group, a Jin kui shen

13、 qi pill medium dose group and a Jin kui shen qi pill lowdose group. Then therapy them by NS、Rosiglitazone and Jin kui shen qi pill solution. At the13th week, the day before the end of the experiment, collect urine samples using metaboliccages to test the contents of 24h urinary albumin, then calcul

14、ated urinary albumin excretionrate (UAER). Collect the blood to test for the blood glucose, SCr, BUN, TC, TG, HDL, LDL,IGF-1 and ET. Kill the rats, make heart slices and observe the changes of heart biopsy.Results: Compared model group with blank group，the level of the blood glucose,SCr, BUN, UAER,

15、TG, TC, LDL and ET of the model group increased，while the HDL andIGF-1 decreasedP0.01). Compared with the model group, the blood glucose, SCr,BUN, UAER, TC, TG, LDL, ET of the RSG group and the JK high dose group decreased, butthe HDL and IGF-1 increased(P0.01 or P0.05). Compared with the model grou

16、p, otherresults of the JK medium dose group except HDL had differences which had statisticalsignificanceP0.01 or P0.05. The JK low dose group compared with model group,there were obvious difference on the level of TG, UAER, IGF-1 and ET which decreasedbetween the two groupsP0.01 orP0.05. Compared wi

17、th the rosiglitazone group,ET of the JK low dose group was different which increasedP0.01. The levels of IGF-13金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响had no obvious difference between the Jin kui shen qi pill groups and the rosiglitazone groupP0.05. Compared with the JK medium and low dose group, bloo

18、d glucose, UAER,TG ,TC, LDL of the JK high dose group decreased which had Statistically significant (P0.01 or P0.05). Pathological biopsy of the heart tissue shows that the heart tissue hadobservably repaired by the treatment groups. Rosiglitazone group, Jin kui shen qi pill highdose group and Jin k

19、ui shen qi pill medium dose group had gotten better curative effect thanJin kui shen qi pill low dose group.Conclusion: Jin kui shen qi pill can decrease the level of the blood glucose, SCr, BUN,UAER, TG, TC, LDL and ET, also can increase HDL and IGF-1 of type 2 diabeticnephropathy rats in order to

20、prevent and treat the development of diabetic nephropathy. Jinkui shen qi pill can improve insulin resistance and promote the heart tissue repairs at the sametime.KEY WORDS: Jin kui shen qi pill (JK)； diabetic nephropathy(DN)；urinary albuminexcretion tate(UAER)；insulin-like growth factor-1(IGF-1); e

21、ndothelinET；the heart tissuepathological morphology4金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响缩 略 词 表缩 略 词AGEsAngARBUNDNECMESRDETFBGGHHDLIGF-1LDLPKCSCrSTZTCTGUAER英 文 全 称Advanced GlucosylationEndproductsangiotensin Aldose reductaseBlood urea nitrogenDiabetic nephropathyExtracellular matrixEnd stage renal

22、diseaseEndothelinFasting blood glucosegrowth hormoneHigh density lipoproteinInsulin-like growth factor-1Low density lipoproteinProtein kinase CSerum creatinineStreptozotocinTotal cholesterolTriglycerideUrinary albumin excretion tate5中 文 名 称晚期糖化终末产物血管紧张素醛糖复原酶血尿素氮糖尿病肾病细胞外基质终末期肾脏病内皮素空腹血糖生长激素高密度脂蛋白胆固醇胰岛

23、素样生长因子-1低密度脂蛋白胆固醇蛋白激酶 C血肌酐链脲佐菌素总胆固醇甘油三脂尿白蛋白排泄率金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响前 言由于社会经济的开展，生活水平的提高和生活方式的改变，过去 20 年中世界糖尿病患者数量飞速增长，预计将来还会增加，尤其在开展中国家，糖尿病患者增长速度极快。本病使患者生活质量降低，并发症及病死率增高，已成为严重威胁人类健康的疾病之一。而在糖尿病患者中，2 型糖尿病占绝大多数，我国患病人群中，以 2 型糖尿病为主，占糖尿病总数的 93.7%，1 型糖尿病占 5.6%，其他类型糖尿病仅占 0.7%。糖尿病肾病(diabetic

24、nephropathy，DN)作为糖尿病常见的微血管并发症之一，在糖尿病患者中的发病率为 20%40%，是导致终末期肾病end-stage renal disease，ESRD发生的最重要原因之一 1。糖尿病肾病多见于病程 10 年以上的糖尿病患者，已成为糖尿病病人主要的死亡原因之一。DN 发病机制十分复杂，尚未完全说明，可以确定的是，DN 的发生是多种因素共同作用的结果，主要包括遗传因素、肾小球血流动力学改变、多元醇途径活化、醛糖复原酶AR和蛋白激酶 CPKC的激活、蛋白非酶糖基化以及细胞因子、生长因子、炎症、介质、高血压等因素。中医认为糖尿病肾病属于“消渴、“水肿、“尿浊、“癃闭、“关格等

25、范畴，其病机那么为阴虚燥热，本虚标实。金匮肾气丸是中医治疗消渴的根本方之一，可起到阴阳双补之效，从根本上改善肾脏疾患。从现代医学研究来看，该方能够改善糖类、脂类代谢，调节机体内分泌，提高免疫力。进一步加深对该方的研究对指导临床治疗糖尿病肾病具有非凡的意义。本实验旨在通过对 2 型糖尿病肾病模型大鼠血糖、SCr、BUN、UAER、TC、TG、LDL、HDL、IGF-1 及 ET 的检测，和对心脏组织形态学改变的观察，进一步揭示金匮肾气丸对糖尿病及其并发症的治疗作用和可能机理，探讨金匮肾气丸对 DN 的防治作用，以及观察 DN 发生同时可能出现的心脏病变的影响，为金匮肾气丸临床用于防治糖尿病及其并

26、发症提供理论依据。6金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响一 立 题 依 据1 现代医学研究进展1.1 糖尿病肾病流行病学概况糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，病变主要累及肾脏小血管和肾小球，引起蛋白尿排泄和滤过异常。2007 年 2 月美国肾脏病基金会公布了?糖尿病及慢性肾脏病的临床实践指南?，其中指出 “糖尿病肾病这一专业术语应被“糖尿病肾脏疾病diabetic kidney disease，DKD所替代。糖尿病肾病是导致终末期肾病end-stage renal disease，ESRD发生的最

27、重要原因之一，在美国有近 1/3 的终末期肾病是由糖尿病肾病引起的；在欧洲 DN 约占ESRD 的 7.9%，日本约占 18%，而我国约为 5%。人群研究显示，1 型糖尿病在发病 1-3 年有 8%患者出现微量蛋白尿，30 年后发病率增加至 50%-60%。而临床蛋白尿在发病 5 年左右开始出现，30 年后发生率增加至 30%。2 型糖尿病诊断时已有 5%-10%的患者伴有 DN，英国前瞻性糖尿病研究UKPDS统计表明，2 型糖尿病诊断 10 年后的微量白蛋白尿发病率是 25%。糖尿病人群肾功能衰竭发生率是一般人群的 17 倍。DN 一般出现在糖尿病发生数年后，目前认为 DN 发病可能与遗传易

28、感性、糖脂代谢紊乱及肾小球血流动力学改变等因素有关。早期积极干预治疗是可以阻止或延缓其向下一阶段开展的，即早期 DN 是可逆转的。1.2 糖尿病肾病的发病机制DN 的发病机制甚为复杂，很多因素尚未明确，可以肯定的是 DN 的发病是多种因素共同作用的结果。包括遗传易感性、肾小球血液动力学改变、高血糖导致的生化代谢紊乱、氧化应激、血管活性物质和细胞因子等。1.2.1 遗传易感性目前，很多学者发现DN的发病出现了家庭聚集现象，因此可以判断DN的发病具有明显的遗传倾向。大多数学者认为遗传因素在DN的发生、开展中起着重要作用，并且DN的发病具有种族差异，这种种族差异也说明了其发病具有遗传倾向。目前对于D

29、N遗传因素多认为是与基因多态性相关。这些基因包括血管紧张素转换酶(ACE)基因、血管紧张素l型受体(AT1R)基因、醛糖复原酶(AR)基因、亚甲基四氢叶酸复原酶(MTH-FR)基因及7金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响胱硫醚D合成酶(CBS)基因等的多态性都与DN的发病关系密切2。亦有报道，葡萄糖转运体-1(GLUT-1)基因、血管紧张素原(AGT)基因、转化生长因子 (TGF-)基因、白细胞介素-6(IL-6)基因及载脂蛋白E基因的多态性也与DN的发生有一定的相关性3-4。1.2.2 肾血流动力学改变一般认为肾血流动力学改变在糖尿病肾病发生中，起至关重

30、要的作用，甚至可能是始动因素。其早期主要表现为肾小球高灌注、高滤过状态；中晚期发生肾血管硬化、狭窄，肾血流量减少，肾功能逐渐降低乃至丧失。肾血流动力学改变可以导致蛋白尿的产生、ECM增加，肾小球硬化5。其发生肾小球硬化的机理为：高血糖可导致很多血管活性因子反响性增强，如AT-、血管紧张素转化酶、激肽释放酶-激肽系统、前列腺素系统、心钠素、血栓素、内皮素和NO等活性改变，这些因素使肾小球出、入球小动脉舒缩平衡失调，造成肾小球“三高状态，即高灌注、高内压和高滤过 6。高血糖时，肾小球内处于高灌注，高滤过状态，毛细血管内压力增高，使系膜细胞扩张，上皮细胞足突融合产生致密小滴，肾小球上皮细胞从基底膜上

31、脱落；肾小球基膜型胶原信使糖核酸增高，使基底膜增厚，最终形成系膜的弥漫性、结节性病变，发生肾小球硬化。在压力增高的情况下，损害肾小球毛细血管上皮细胞，滤过膜通透性增加，蛋白滤过增加，沉积于系膜区和肾小球基底膜，促进基质增生，形成恶性循环，并可造成结节性和弥漫性肾小球硬化。1.2.3 高血糖导致的生化代谢紊乱蛋白质非酶糖化有证据说明，高糖状态下非酶糖化形成的晚期糖化终末产物AGEs在DN的发病机制中起重要作用，是DN发病机制的重要因素之一7。AGEs为蛋白质、脂质或核酸与葡萄糖及其衍生物通过非酶促反响产生的化合物。细胞外蛋白质AGEs干扰基质与细胞、基质与基质的相互作用，影响多种基质分子的结构和

32、功能。AGEs导致的细胞外基质功能异常可影响血管的功能和结构，如血管弹性的降低、NO扩张血管功能的缺陷。AGEs形成除可影响蛋白质的功能外，还会影响蛋白质的转变及去除过程，导致AGEs在组织中的堆积。肾小球的AGEs可诱发肾小球浆膜胶原分子的过度交联，影响肾小球基底膜及肾小球膜细胞的结构，并通过血小板生长因子作用于肾小球膜细胞，造成细胞合成更多的细胞外基质。这些过程可能导致肾小球膜细胞的细胞外基质沉积，阻碍肾小球膜细胞大分子的清除，改变巨噬细胞功能，造成肾小球系膜细胞扩张及肾小球闭锁。8金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响AGEs亦可通过与特异受体相互作用

33、影响细胞功能。AGEs与巨噬细胞受体结合会刺激白介素-1、胰岛素样生长因子-1、肿瘤坏死因子以及巨噬细胞克隆刺激因子的产生，这些细胞因子促进各种细胞生长和胶原的合成。AGEs与肾小球膜细胞受体结合，刺激血小板生长因子分泌，介导型胶原、层粘连蛋白的产生，使基底膜增厚，最终形成系膜的弥漫性、结节性病变，发生肾小球硬化。1.2.3.2 蛋白激酶C蛋白激酶CPKC是许多外在刺激因子如激素、生长因子等发挥作用的信号调节因子8。PKC的激活可引起胰岛素抵抗IR及糖尿病血管并发症的出现。DN最早期的表现是血流动力学的异常，肾小球滤过率的升高及轻微的血流速度的增加是其特征性改变。DN早期的高滤过率及肾小球高滤

34、过压是高血糖介导的微动脉阻力变化的结果，包括血管紧张素活性的增强、前列腺素类化合物PGE2、PGI2、PGF2a及花生四烯酸水平的升高。PKC激活可以引起血管紧张素活性增强，也可以引起前列腺素水平的升高，导致DM早期肾小球高灌注、高滤过。血管通透性增加是糖尿病另一个特征性血管异常。PKC冲动剂能使白蛋白或其他大分子物质通过肾小球毛细血管内皮细胞屏障，反之，使用PKC抑制剂可使其降低。此外，在高糖环境中，血管内皮细胞血管内皮生长因子VEGF表达增高，能调节血管内皮细胞增殖和新生血管形成，使用PKC抑制剂后，VEGF表达降低，细胞通透性也明显降低。PKC的激活参与高糖状态下转化生长因子TGF-的激

35、活，增加细胞外基质沉积，亦导致DN的发生。另外，PKC激活后可上调细胞粘附因子在肾小球系膜细胞中的表达，促进肾小球处自细胞粘附聚集，加速肾小球损伤9。1.2.3.3 多元醇代谢旁路多元醇代谢旁路又称山梨醇代谢旁路，醛糖复原酶aldose reductase，AR不可逆的将葡萄糖转化为其醇糖山梨醇；多元醇脱氢酶将山梨醇转化为果糖。一般情况下，多元醇通路葡萄糖代谢极少，高血糖状态下激活该通路，使葡萄糖转换成山梨醇和果糖。山梨醇不易透过细胞膜而果糖极少进一步代谢，使细胞内山梨醇和果糖堆积，导致细胞内渗透压增加，血流动力学障碍，影响肾小球和肾小管功能，诱使早期DN肾小球高滤过的发生。近年来认为NO在D

36、N的发病中起到重要作用，而NOS起作用时要消耗NADPH，多元醇通路激活也需消耗NADPH，因此多元醇通路的激活有可能影响到NO的代谢，使NO生成减少，影响血管张力，损伤血管内皮，导致DN的发生。9金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响1.2.4 氧化应激2005年，Michael Brownlee10根据实验结果提出了糖尿病慢性并发症的统一机制：氧化应激。氧化应激产生活性氧簇(ROS),ROS包括有大量氧自由基、活性氧等，在DN的发病机制中起重要作用。ROS通过激活线粒体、NF-KB、DNA氧化损伤及影响基因表达来诱导细胞凋亡,促进DN的发生开展。在DN中

37、，ROS的过量产生可以直接导致高血糖，而各种细胞包括内皮细胞、系膜细胞、血管平滑肌细胞和肾小管上皮细胞等又在高血糖状态下产生ROS，形成恶性循环，不断地损伤肾脏而加重DN的开展。ROS可影响到多元醇通路、蛋白激酶C、糖基化终末产物形成及转化生长因子-活化等多条途径,激起内皮素-1、结缔组织生长因子及血管内皮生长因子等细胞因子的活化，引起肾小球细胞外基质蛋白增加。抗氧化剂能有效抑制蛋白激酶C的活化、转化生长因子-和纤维连接蛋白表达的上调,说明ROS介导了肾小球细胞外基质的沉积11。细胞生长因子1.2.5.1 结缔组织生长因子(CTGF)在糖尿病肾病出现肾小球硬化及肾小管间质纤维化的过程中, CT

38、GF是关键性的细胞因子之一,作为转化生长因子的下游调节因子, 参与整个纤维化过程。CTGF具有有丝分裂原活性, 能促使成纤维细胞活化、增殖, 并诱导成纤维细胞和肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转化。有学者发现，在高糖培养液或者晚期糖基化终末化产物培养液中，肾小球系膜细胞CTGF mRNA水平明显上升。说明CTGF在过度表达可能是导致糖尿病肾病细胞外基质沉积和肾小球进行性硬化的重要原因之一。1.2.5.2 转化生长因子-1TGF-1TGF-1在DN的病理形成过程中占有重要的地位。高血糖、高血脂、AGEs等因素使TGF-1的活性增加，TGF-1mRNA表达上调，抑制细胞增生、促使细胞肥大，使ECM沉

39、积，从而导致了肾小球硬化及肾小管间质纤维化12-13。TGF-1能抑制细胞增殖，促进糖尿病肾脏肥大；TGF-1亦可刺激胶原I、纤连蛋白等异常增加，抑制降解ECM所需的蛋白酶如胶原酶的合成，减少ECM的降解，增加ECM的产生，促进肾小球硬化。1.2.5.3 胰岛素样生长因子-1IGF-1高糖状态下, IGF-1 分泌升高，能够刺激系膜基质生成, 减少系膜细胞中胶原蛋白的降解,并促进系膜细胞产生NO, 增加系膜细胞对葡萄糖的摄入。IGF- 1受体介导IGF- 1的生物学行为, 而二者间的相互作用受IGF-1结合蛋白( IGFBP) 的调节。IGF- 1、IGFBP以及IGF- 1受体三者共同在糖尿

40、病肾病的发生开展中起着重要作用。另外，生长激素GH/10金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响IGF-1轴也在DN的发病过程中起重要作用，IGF-1直接作用于靶细胞,促进GH的生物效应,同时反响性地调节垂体对GH的合成与释放。 血管内皮生长因子(VEGF)VEGF可作用于血管内皮细胞，通过改变内皮细胞的结构和功能，增加肾小球毛细血管的通透性，促进细胞外基质合成，促使肾小球基底膜增厚、肾小球与肾小管纤维化及肾脏肥大。高血糖与PKC、AngII、AGEs、TGF-Bl等均可上调VEGF。上述各种因子在糖尿病肾病的病理改变中都起到了不同的作用，使肾小球基底膜增厚，

41、系膜细胞增生，细胞外基质增多、沉积，促进了DN的发生。1.3 糖尿病肾病的临床分期目前临床使用的分期标准是由Mogensen提出的，根据尿蛋白和肾小球滤过率GFR将DN的自然病程分为5个阶段。期肾小球高滤过期：以肾小球滤过率GFR增高和肾体积增大为特征，GFR 可高达 150 ml/min；尿白蛋白排泄率UAER正常20 g/min，或30 mg/24 h；血压正常。病理：肾小球肥大，基底膜GBM和系膜正常。期正常白蛋白尿期：GFR 增高或正常；UAER 正常20 g/min，或5 年的糖尿患者。期 临床糖尿病肾病期或显性糖尿病肾病期：GFR 下降(早期 13070 ml/min，后期 703

42、0 ml/min)，平均每月下降 1 ml/min；大量白蛋白尿，UAER200g/min，或持续尿蛋白0.5 g/24 h，为非选择性蛋白尿，约 30%的患者可出现典型的糖尿病肾病“三联征大量尿蛋白(3.0 g/24 h)、水肿和高血压的肾病综合征特点；血压增高。病理：GBM明显增厚，系膜基质增宽，荒废的肾小球增加平均占 36%，剩余肾小球代偿性肥大。期肾功能衰竭期：GFR 进行性下降，多16.7mmol/L，尿糖定性+ + 以上，且尿量增加 1 倍以上为糖尿病模型形成54。再继续喂养 1 周,第 8 周用代谢笼收集 24h 尿液，记录 24 小时尿量，混匀后留取 10ml检测尿白蛋白含量，

43、并计算尿白蛋白排泄率尿白蛋白排泄率=尿白蛋白含量24h 尿量/1440min，以尿白蛋白排泄率20g/min，确定 DN 模型成立55。选择造模成功的大鼠 40 只，称重后按体重编号，按照随机数字表法分为 5 组，分别为模型对照组，西药罗格列酮治疗组，金匮肾气丸大剂量治疗组，金匮肾气丸中剂量治疗组，金匮肾气丸小剂量治疗组。各组均继续喂以高脂高糖饲料 5 周，并每周测血糖。3.2 给药第 8 周，各组动物开始灌胃给药，每日一次，持续 5 周。给药按人与大鼠体外表积比折算成等效剂量。空白组、模型对照组分别每日灌胃等剂量的生理盐水；罗格列酮治疗组每日灌以罗格列酮 0.36mg/kg 溶液；金匮肾气丸

44、大、中、小剂量治疗组分别每日灌以等体积金匮肾气丸溶液 1600mg/kg、800 mg/kg、400mg/kg。3.3 标本采集与处理第 13 周，实验结束前 1 天，用代谢笼收集 24h 尿液，记录 24 小时尿量，混匀后留取 10ml 检测尿白蛋白含量，并计算尿白蛋白排泄率。禁食不禁水 12h，腹腔注射 2%戊巴比妥钠生理盐水溶液 40mg/kg 麻醉，尾静脉取血测血糖后，行股动脉取血后处死大鼠，取出相关脏器。将血液分成两局部，一局部血液迅速参加装有 40000U/ml 抑肽酶 20ul的冰冷试管中混匀，以 3500 rpm 离心 10 min，别离血浆，于-20冰箱内保存以检测ET 含量

45、。另一局部血液放在 37温箱，使其充分凝固，然后置 4过夜，以 1500rpm21金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响离心 30 分钟，吸取上部清亮的血清于-20冰箱内保存以检测检测空腹血糖、血肌酐、血尿素氮、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白LDL、血清 IGF-1 指标。取大鼠心脏称重，去除包膜后，长轴方向对切，用 10%中性甲醛固定后，石蜡包埋切片。经二甲苯脱蜡、酒精水化后，分别制成苏木精-伊红HE染色切片，于光学显微镜下观察、摄片。3.4 检测指标血糖使用血糖仪和血糖试纸取大鼠尾静脉血测定；尿白蛋白检测按照试剂

46、盒说明书，采用放射免疫法测定；血浆 ET 水平按放免分析试剂盒说明书使用 y 放射免疫计数仪测定； 血清 IGF-1 按照大鼠 Elisa-胰岛素样生长因子 1 试剂盒说明书操作后，使用酶标仪检测。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白LDL、血肌酐SCr、血尿素氮(BUN)均用酶比色法测定，全自动生化分析仪读数。3.5 统计学处理采用 SPSS17.0 统计软件处理。所有数据用 x s 表示。组间均数比拟采用单因素方差分析及 t 检验，P0.05 为差异有统计学意义。22金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响4 实验结果4

47、.1 金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠给药前后血糖的影响表 1 各组大鼠血糖比拟 x s见表 1 和图 1组别空白组模型对照组N88给药前空腹血糖5.140.4827.542.59给药后空腹血糖5.290.6026.302.87罗格列酮组827.251.9718.152.65金匮肾气大剂量组828.031.6518.142.21金匮肾气中剂量组827.152.0523.253.22金匮肾气小剂量组828.102.0124.383.60P0.01，P0.05；与给药前比拟P0.05，PP30252015给药前FPG给药后FPG1050空白组模型组罗格列酮 金匮大剂 金匮中剂 金匮小剂图 1 各

48、组大鼠血糖比拟由表 1 和图 1 我们可以看出：给药前，模型组及各治疗组血糖较空白组显著升高P0.01，说明高脂高糖饲料喂养与 STZ 腹腔注射造模后大鼠血糖明显升高，模型成功。给药后，与模型组血糖相比，罗格列酮组、金匮肾气丸大剂量组血糖降低，有显著性差异P0.01，说明金匮肾气丸大剂量与罗格列酮降糖效果相当；金匮肾气丸中剂量组血糖降低，差异有统计学意义P0.05；金匮肾气丸小剂量组血糖与模型组相比没有差异P0.05。与罗格列酮组比拟，金匮肾气丸中、小剂量组血糖水平升高，差异有统计学意义P0.05，说明金匮肾气丸的降糖作用存在剂量上的差异性，在本实验中金匮肾气丸大剂量的降糖效果最正确。23注：

49、与空白组相比拟P0.01；与模型组相比拟0.01；与罗格列酮组比拟 0.05。金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响4.2 金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠血脂的影响见表 2 与图 2表 2 各组大鼠血脂的比拟 x s组别空白组模型对照组罗格列酮组金匮肾气大剂量N TG1.24250.334.89750.72TC4.57250.508.63750.72HDL-C1.47130.290.77630.16LDL-C2.22750.595.11750.97金匮肾气中剂量0.84880.12金匮肾气小剂量注：与空白组相比拟P0.01；与模型组相比拟P0.01，P0

50、.05；与罗格列酮组比拟P0.01，P0.05。987654321TGTCHDL-CLDL-C0空白组模型组罗格列酮金匮大剂金匮中剂金匮小剂图 2 各组大鼠血脂的比拟表 2 和图 2 可以看出，模型组血清 TG、TC、LDL-C 含量与空白组相比升高，HDL-C降低，差异有统计学意义P0.01。各治疗组与模型组相比：TG 含量在罗格列酮组、金匮肾气丸大、中、小剂量组均降低P0.01 或 P0.05，说明药物降低大鼠血清TG 含量效果显著；而金匮肾气丸对于降低本指标尤为敏感，无论大、中、小剂量组差异均有统计学意义P0.01 或 P0.05。血清 TC、LDL-C 含量在罗格列酮组、金匮肾气丸大、

51、中剂量组降低，差异有统计学意义P0.01 或 P0.05，说明药物降低 TC、LDL-C 含量疗效可靠；组间相比拟，罗格列酮组较金匮肾气丸中、小剂量组血清 TC、LDL-C值降低P0.01，说明西药罗格列酮比中成药金匮肾气丸药效更显著。与模型组相比，血清 HDL-C 含量仅在罗格列酮组、金匮肾气丸大剂量组升高P0.01 或 P0.05，说明金匮肾气丸改善大鼠血清 HDL-C 指标的效果略差于其它同类指标。从整体观察，罗格242.13630.6785.44501.351.05500.193.10130.822.14500.5685.61500.950.98871.493.25380.8082.9

52、5500.9287.68000.734.27130.953.95250.9888.45750.490.84630.134.68130.72金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响列酮和金匮肾气丸对于脂代谢紊乱都有改善作用，且罗格列酮治疗组略优于中药治疗组。此外，从数值上看金匮肾气丸大剂量组比中、小剂量组降低血脂作用为好。4.3 金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠血肌酐、尿素氮的影响 见表 3 与图 3、图 3-1表 3各组大鼠血肌酐、尿素氮的比拟 x s组别空白组模型对照组罗格列酮组金匮肾气大剂量金匮肾气中剂量金匮肾气小剂量N888888SCr (umol/L

53、)57.08758.2898.06254.50BUN(mmol/L)5.31250.7511.4003.44P0.01，P0.05；与罗格列酮组比拟P0.05。1008060SCr4020SCr0空白组模型组罗格列酮金匮大剂金匮中剂金匮小剂图 3 各组大鼠血肌酐的比拟BUN12108642BUN0空白组模型组罗格列酮金匮大剂金匮中剂金匮小剂图 3-1各组大鼠尿素氮的比拟2577.925014.797.72502.0683.575013.798.07501.7686.32507.528.68751.8088.63759.0910.35003.01注：与空白组相比拟P0.01；与模型组相比拟金匮肾

54、气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响从表 3 和图 3、图 3-1 可以看出，模型组血清 SCr、BUN 含量与空白组相比拟升高，差异有统计学意义P0.01。各治疗组与模型组相比拟，血清 SCr、BUN 在罗格列酮组、金匮肾气丸大、中剂量组降低P0.01 或 P0.05，说明药物降低 SCr、BUN 疗效显著；组间相比拟，罗格列酮组较金匮肾气丸小剂量组血清 SCr、BUN 降低，差异有统计学意义P0.05，说明西药罗格列酮比中成药金匮肾气丸药效更显著。总之，罗格列酮和金匮肾气丸均能降低大鼠血清 SCr、BUN 含量，从数值上看，罗格列酮效果略胜与金匮肾气丸，且金

55、匮肾气丸存在不同剂量疗效存在差异。4.4 金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠尿白蛋白排泄率的影响表 4 各组大鼠尿白蛋白排泄率的比拟 x s见表 4 与图 4组别空白组模型对照组罗格列酮组金匮肾气大剂量金匮肾气中剂量金匮肾气小剂量N888888尿白蛋白排泄率ug/min7.73750.9527.90002.7030252015105UAERP0.01，P0.05。UAER0空白组模型组罗格列酮 金匮大剂 金匮中剂 金匮小剂图 4 各组大鼠尿白蛋白排泄率的比拟2622.77503.9021.40001.7524.68753.0825.13571.81注：与空白组相比拟P0.01；与模型组相比拟金

56、匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响从表 4 和图 4 可以看出，模型组与空白组相比拟 UAER 升高，差异有统计学意义P0.01。各治疗组与模型组相比拟 UAER 均降低，差异有统计学意义P0.01 或 P0.05，说明两种药物均能降低 UAER,改善肾功能；而金匮肾气丸降低 UAER 跟显著，其大、中、小剂量组与模型组比拟均降低，差异有统计学意义P0.01 或 P0.05；从数值上看，金匮肾气丸大剂量组的效果最有效。4.5 金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 的影响见表 5 与图 5、图 5-1表 5各组大鼠 IGF-1、ET 的比拟

57、x s组别空白组模型对照组罗格列酮组金匮肾气大剂量金匮肾气中剂量金匮肾气小剂量N888888IGF-1pg/ml5.34250.363941.86120.18879ETpg/ml49.99871.18690140.72883.01345P0.01；与罗格列酮组比拟P0.05；与金匮6543IGF-1210空白组模型组罗格列酮金匮大剂金匮中剂金匮小剂图 5 各组大鼠 IGF-1 的比拟273.65500.23379114.51881.236693.40750.27814113.44502.269583.22130.20032114.89881.508113.18880.21108120.2800

58、1.71887注：与空白组相比拟P0.01；与模型组相比拟肾气大、中剂量组比拟 P0.05。金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响图 5-1 各组大鼠 ET 的比拟由表 5、图 5 和图 5-1 可以看出，与空白组比拟，各组 IGF-1 明显降低，ET 均明显升高P0.01；与模型组比拟，各治疗组 IGF-1 均明显升高，ET 明显降低P0.01，说明两种药物均有升高 IGF-1，降低 ET 的作用；与罗格列酮组比拟，金匮肾气大、中、小剂量组 IGF-1 均无明显差异P0.05，说明二者对 IGF-1 的疗效相当，且中药剂量对疗效影响不大；除金匮肾气小剂量组

59、外，金匮肾气大、中剂量组与罗格列酮组降低ET 疗效相当，差异无统计学意义P0.05；与金匮肾气大、中剂量组比拟，金匮肾气小剂量组 ET 明显升高，差异有统计学意义P0.05。从数值上看，金匮肾气大剂量组对降低 ET 水平效果最好，中药对大鼠 ET 的影响具有量效关系。4.6 金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠心脏组织形态的影响图片见附录一从心肌组织图片可以看出，正常心脏组织细胞排列整齐，细胞形态未见异常；模型组可见肌纤维增粗，排列紊乱，细胞核肿胀；西药组、中药大、中剂量治疗组肌纤维排列较整齐，细胞核肿胀不明显；中药小剂量组细胞核轻度肿胀，肌纤维增粗，排列轻度紊乱。因此，可以得出结论，金匮肾气丸

60、可以改善细胞核肿胀及心肌纤维的增粗情况，它对于心脏组织形态改变具有一定的改善作用。28金匮肾气丸对 2 型糖尿病肾病大鼠 IGF-1、ET 及心脏组织形态的影响5 讨论5.1 模型评价目前, DN 的动物模型均由诱发 DM 而来,而诱发 DM 动物模型主要有四种方法：胰腺切除、用 STZ、四氧嘧啶等化学物质诱导、自发性模型及转基因模型等56 。本研究工程的造模，采用高脂、高糖饮食诱发胰岛素抵抗，后给予低剂量(30mg/kg)STZ 溶液分 2 次左侧下腹部注射。造模后连续三天测空腹血糖16.7mmol/L，尿糖定性+以上且尿量增加 1 倍以上为糖尿病模型形成。继而计算尿白蛋白排泄率，以尿白蛋白