槐角中总黄酮分离提取工艺、山奈素纯化工艺及生物活性研究

1、分 类 号 ： O629论文编号：贵州大学2009 届硕士研究生学位论文槐角中总黄酮分离提取工艺、山奈素纯化工艺及生物活性研究学科专业： 有机化学研究方向： 植物化学导师： 胡德禹(研究员)研 究 生： 冉 晓 燕（在职）中国贵州贵阳2009 年 5 月贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文目录摘要 . 1Abst ract.3前1 综言 . 6述 . 8 山奈素简介.8 山奈素的主要植物来源 .8 槐角的主要活性成分及其药理作用 .10 槐角活性成分在生活中的应用 .122 研 究 思 路 . 1 9 研究的目的和意义.19 研究内容.19 本课题设计思路.20 关键技术.20

2、3 实 验 部 分 . 2 1 仪器、材料与试剂.21HPLC 测定方法.21 原料药物的确定.21 槐角指纹图谱的建立 .22 槐角在一个生长周期中黄酮含量的变化规律研究 .23 提取原材料前处理. 23 实验方法. 24 槐角中总黄酮的提取分离工艺研究 .24 提取液选择. 24 提取温度优化. 24 提取料液量优化. 24 提取时间优化. 24 槐角中分离提取山奈素的工艺路线 .25 树脂选择. 25.3贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文 洗脱浓度选择. 26 槐角提取物中分离提纯山奈素的工艺路线 .26 萃取剂的选择. 26 纯化工艺研究. 26 槐角提取物中山奈素生

3、物活性研究 .26 实验药材. 27 实验动物. 27 实验方法. 27 硅胶吸附色谱分离提纯山奈素的工艺研究 .274 结 果 与 讨 论 .29结致论 .45谢 .46参 考 文 献 .47附录 .53原 创 性 声 明 . 54贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文摘要山奈素是一种生物黄酮类物质，是蜂胶、百蕊草片、银杏叶片等药物的主要成分。研究表明，山奈素无毒无害，具有平喘、祛痰止咳、降低血压、增强毛细血管抵抗力、降血脂、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量等作用。已广泛用于临床治疗缺血性心脑血管病、内分泌疾病及各种慢性炎症。在肿瘤临床治疗的应用上，山奈素能减轻常规化疗带来的毒副作

4、用，与化疗药物联合应用可起到协同增效的抗肿瘤作用等，尤其适用于年老体衰伴有各种并发症的晚期肿瘤患者，深入研究可望成为有效的抗癌防癌的治疗及保健制剂。山奈素由于其在中药中含量较低，分离提取较为困难。虽然有报道从高良姜药材中分离出山奈素，但事实上，并非所有的高良姜药材中都含有山奈素成分。目前系统地从槐角中提取总黄酮以及从其提取物中纯化山奈素的方法还比较少，本课题的目的就是为了找到一条合理的、经济适用的水浸提方法将槐角中总黄酮提取出来并纯化山奈素。使其具有成本低、工艺简单、综合利用率高等优点，并通过动物实验了解山奈素的生物活性。研究内容如下：1 确定槐角为山奈素提取原料通过HPLC方法鉴定槐米、山奈

5、、银杏叶、金钱草和槐角中山奈素含量，确定槐角为提取分离山奈素的原料物。2 成功地研究出槐角在一个生长周期中总黄酮含量的变化规律四月份采摘的是槐花，含量最高为 3.22 %（其总黄酮中主要成分为槲皮素，山奈素含量较少）；五月份和六月份采摘的是刚结果的槐角，含量较四月份低，七月份槐角较成熟，含量也随之上升；八月份槐角最饱满，含量较高为 2.31 %（其总槲皮素含量低，山奈素的含量高）；九月份含量比八月份稍低，原因可能是槐角开裂部分籽掉落而影响含量；十月份之后槐角基本掉落，无采摘意义。3 HPLC 方法鉴定槐角中总黄酮组分通过标准的槲皮素和山奈素样品，使用 HPLC 方法，建立槐角中总黄酮的组成成分

6、 HPLC 指纹图谱。4 槐角中提取总黄酮使用 HPLC 方法对槐角中的黄酮组分进行测定，在温度梯度、料液梯度、时-1-贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文间梯度、浓度梯度等方面逐一筛选浸提条件，成功地找到槐角与料液（水）比例为 18，温度为 90 下浸提 2 次，每次 2 h，浸提液用 AB-8 型大孔树脂对其总黄酮进行吸附，用纯水洗去无机盐，再用 60 % 的乙醇洗脱，蒸干洗脱液后得到槐角提取物总黄酮。成功地找到了槐角中黄酮组分提取分离的最佳条件。5 槐角总黄酮中纯化山奈素利用槐角提取物酸水解实验成功地从槐角提取物中分离出山奈素，购买的槐角提取物中山奈素含量为 15.7 %

7、，用水解液（HCl 4 mol/L:甲醇=3:7）水解 3 h，调水解液至弱碱性，回收甲醇至无醇，冷却后抽滤，再经过萃取后纯度提高，山奈素单体含量提高到 90 % 以上，收率也在 90 % 以上。6 槐角总黄酮中山奈素生物活性研究通过动物实验，对槐角提取物中山奈素抗氧化的生物活性进行研究，结果表明衰老时血清 TAA 及心肌组织 SOD 活性均降低，LPO 含量增高；给以槐角提取物山奈素大、小两剂量 30 d 后，均可提高血清 TAA 和心肌组织 SOD 活性，且可降低 LPO 含量，尤以大剂量组效果更佳，得出其具有抗氧化功能。关键词：槐角；总黄酮；山奈素；提取分离；生物活性图书分类号：O629

8、-2-贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文ABSTRACTAempferide is a kind of biological flavones and mainly exist in propolis, tabellaof the Thesium chinense Turcz, and the tabella of ginkgo leaf . Studies show that it issafe and harmless for human, and can suppress cough and relieving dyspnea, lowerblood pressure,

9、 raise the resistance of micrangium, lower blood lipid, and expand theaeteria coronaria. In recent years，it has been widely used in clinical treatment of thecardia and cerebral vascular diseases, the disorder of the endocrine secretion and allkinds of chronic inflammation. In application of in clini

10、cal therapy of tumors,Kaempferide can lessen the toxical and side effect caused by the conventionalchemotherapy, and showed synergism function when combinated with otherchemotherapeutics. Kaempferide is especially suitable to the treatment of advancedneoplastic disease in people wearied with age. It

11、 has great potent to be developed intoeffective preparation for anti-cancer, cancer chemoprevention and health protection.Due to low content in the herb plants, Kaempferide is difficult to collect by extractand isolation.Although it was reported that Kaempferide could be isolated from thealpinia off

12、icinarum, but not all alpinia officinarum possess such components. So far,the methods for extract and isolateion from alpinia officinarum are very few. Thepurpose of this study is to find a reasonable and economical method to then isolateand purify total flavonoids from the alpinia officinarum, with

13、 low cost. Brief technicalflow and higher comprehensive utilization rate. Meanwhile, we studied the biologicalactivity of Kaempferide by the animal experiment. All the results are as following.Part To ascertain raw material for extracting KaempferideThe contents of kaempferide from the alabastra sop

14、horae japonicae, kaempferiae,ginkgo leaf and alpinia officinarum were tested by HPLC method, and fructussophorae was selected as materials for extracting Kaempferide.Part To find out the variety rules of the content of total flavonoids in a growthcycle of the fructus sophorae.The flavones content of

15、 flos sophorae is as high as 3.22 % in April, whichincreased the content of just fruited fructus sophorae in May and June, is less than that-3-贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文in April; and the content raised in July for mature og fructus sophorae, in August, thecontent arrives highest by plump and fall do

16、wn aginn in September due to some openparts seeds falling; In October, most of fructus sophorae has fallen.Part Using the HPLC method to identify the total flavonoids from the fructussophorae.Seting up finger printing of the total flavonoids by HPLC method.Part Extracti of the total flavonoids from

17、the fructus sophorae .Flavones in fructus sophorae were determined by HPLC method. Investigatingthe temperature gradient, materials-liquid rate gradient, time gradient, andconcentration gradient, the best suitable conditions to extract and isolate the flavonesare found after screening the conditions

18、 of extraction: materials-liquid rate is 1:8, thetemperature is 90 , heated by water-bath twice for 2 hours. Using macroporousresin of AB-8, the component wsa washed with water, eluted to 60 % with ethanol,collectingthe eluant, condense and dry.Part Purification of kaempferide fromthe fructus sophor

19、ae.The extracts of the fructus sophorae is treated with acid hydrolysis, andkaempferide was isolated from the extracts of the fructus sophorae. The content ofkaempferide is 15.7 % in the purchased extracts. Which were hydrolyzed for 3 hours(HCl 4 mol/L:methanol = 3:7), modulate the hydrolyzate to a

20、neutral pH, recover themethanol by distillating, and vacuum filtrate when cool down, wash to leach the salts,dry the filter cake, and filter and dry the filtrate. After treating the acid hydrolysis,precipitation and crystallization, and extraction, the content of the kaempferide isincreased to more

21、than 90% with recovery rate higher than 90 %.Part Biological Activities of the kaempferide from the fructus sophorae.The antioxidation effect of the kaempferide from the fructus sophorae isinvestigated by animal experiment. The results showed that the kaempferide can cutdown the activities of TAA in

22、 serm, of the SOD in the cardiac muscle tissues in oldanimals, increased the LPO, decreased TAA. When the kaempferide is given toanimals with high and low dosage, after 30 days treatment, the kaempferide can allincreased the activities of the SOD in the serm and the cardiac muscle tissues,-4-贵 州 大 学

23、 2009 届 硕 士 学 位 论 文decreased the content of the LPO, increased the level of TAA in serm, especially inthe high dosage group, so the kaempferide have very strong antioxidation effect.KEY WORDS ： Fructus sophorae; Total flavonoids; Kaempferide; Extraction andIsolation; Biological activity-5-贵 州 大 学 20

24、09 届 硕 士 学 位 论 文前言天然产物是由各种化学成分所组成的复杂体系。由于它结构的复杂性和特殊的生物活性，可作为许多药物合成的先导化合物。天然陆生植物体内的主要成分有：生物碱、萜类、甾体、苷类、黄酮类、蒽醌类、糖类、蛋白质、脂类等等。黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，许多黄酮类成分具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和对心脏正性肌力功能，具凉血、止血之功效，对骨质疏松、癌症等疑难杂症有较好的预防和治疗效果。山奈素是一种生物黄酮类物质。研究表明，山奈素无毒无害，具有平喘、祛痰止咳、降低血压、增强毛细血管抵抗力、降血脂、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量等作用。特别是山奈素能对抗-淀粉样蛋白(amylo

25、id beta protein,A)对神经元的损伤，而槲皮素无此作用 (WangCN，2001)。总之，黄酮类化合物具有多种的生物活性，临床上已被用于心血管疾病、癌症、免疫系统疾病的治疗。近年来随着对槲皮素和山奈素这些经典黄酮类化学成分的深入研究，发现了某些新的极有价值的药用线索。因此，对黄酮化合物进行有针对性的筛选和研究，将有助于创新药物的发现。而槐角、山奈、金钱草、银杏叶、槐米中富含黄酮类化合物和异黄酮类化合物。本草纲目记载久服槐实“令人可夜读书，延年益气力”，提示槐角可作为防治冠心病的辅助治疗药物及保健饮料的原料。关于槐角提取液降低血清胆固醇的机理，认为与槐角所含黄酮类物质有关。我国城乡

26、槐树种植较普遍，槐角产量丰富，价值低廉。如能收集给以利用，可发挥较好的经济效益和社会效益。现在主要开发的产品有槐角丸、银杏提取物等，对山奈素的提取和分离报道的不多，而现行市场上槐角提取物中山奈素含量低（最高 34 %），无法满足市场高含量山奈素的需求，本课题将对此进行一定的研究。即本课题主要研究从天然产物槐角中提取总黄酮工艺、纯化山奈素工艺及山奈素抗氧化生物活性的研究。-6-贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文槐角简介名称：槐角来源：Sophora japonica L科属：豆科槐属拉丁：Fructus sophorae别名：家槐、中国槐（通称）、豆槐（湖南）、白槐（山西、湖南

27、、广东潮州）、细叶槐（江西）。产地分布：槐在我国分布较广，南北各地普遍栽培，尤以黄土高原及华北平原最为常见。槐角性寒、味苦，归肝、大肠经，有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和对心脏正性肌力功能，具凉血、止血之功效，药用历史悠久，也是历版中国药典收载的常用中药。槐角中富含黄酮类化合物和异黄酮类化合物，主要有效成分为芸香苷、染料木素、染料木苷和槲皮素。对骨质疏松、癌症等疑难杂症有较好的预防和治疗效果。-7-贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文1 综述 山奈素简介黄酮类化合物是很多药用植物中的有效成分，主要组成成分繁多，目前研究最多的是槲皮素（quercetin），山奈素（kaempferol）

28、和异鼠李素（isorhamnetin）三种。由于其具有抗炎、凉血、抗癌、抗癫痫、抗氧化剂、解痉、抗溃疡、利胆利尿剂、止咳等药理作用，所以对黄酮类化合物的研究有很高的经济价值。山奈素是一种生物黄酮类物质。研究表明，山奈素无毒无害，具有平喘、祛痰止咳、降低血压、增强毛细血管抵抗力、降血脂、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量等作用（常新全等，2002）。近年来作为蜂胶、百蕊草片、银杏叶片等药物的主要成分，已广泛用于临床治疗缺血性心脑血管病、内分泌疾病及各种慢性炎症。在肿瘤临床治疗的应用上，山奈素能减轻常规化疗带来的毒副作用，与化疗药物联合应用可起到协同增效的抗肿瘤作用等，尤其适用于年老体衰伴有各种并发症的

29、晚期肿瘤患者，深入研究可望成为有效的抗癌防癌的治疗及保健制剂。 山奈素的主要植物来源山奈素的主要植物来源有：山奈、槐角、金钱草、银杏叶、槐米等。山奈(岭南又名沙姜)为姜科植物山奈（Kaempferia galanga）的干燥根茎，它的化学成分己确定的有对甲氧基桂皮酸乙酯、桂皮酸乙酯，龙脑、茨烯、芘烯、对甲氧基苏合香烯等四十种挥发油组分和山奈酚、山奈素等黄酮类组分（石伟等，2004）。是一种常用的中药，有行气温中、消食、止痛的功效，用于治疗胸膈胀满、肮腹冷痛、饮食不消等症。目前，通过人工栽培，在很大程度上丰富了山奈资源，应用范围也已拓展，如制备精油、用于食用香料或调制调味剂，甚至有的直接以山奈粉

30、作调料（郑公铭，2003）。槐角是植物槐的果实。槐角性寒、味苦，归肝、大肠经，有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和对心脏正性肌力功能，具凉血、止血之功效，药用历史悠久，也是历版中国药典收载的常用中药。槐角中富含黄酮类化合物和异黄酮类化合物，有效成分主要为芸香苷、染料木素、染料木苷和槲皮素。对骨质疏松、癌症等疑难杂症有较好的预防和治疗效果。现在主要开发的产品有槐角丸等（边清泉等，2005）。金钱草为报春花科多年生草本植物过路黄的全草，因其叶近圆形而似钱，-8-贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文故名金钱草。金钱草生长于路边、沟边及山坡、树林、草丛阴湿处.分布于河南、山西、江苏、安徽、浙江江西

31、、福建、台湾、湖北、湖南、广东、广西、陕西、云南、贵州、四川等省区。金钱草味淡性微寒，有利胆、排石、利尿、解毒 、清利湿热、通淋、消肿等功效。常用作热淋、石淋、黄疸、疮毒、水肿、跌打损伤用药。煎剂有显著利尿作用，并能促进胆汁从胆管排出，有排石作用。现在国内主要产品有金钱草颗粒。近年来有关金钱草在临床和药理方面有许多报道，而在化学成分的分析方面报道尚不多见（侯冬岩等，2004）。最新研究表明其主要成分为黄酮苷类及酚酸，所含的槲皮素和山奈素为主要有效活性成分（张集盘等，2005）。银杏叶(ginkgo biloba )为银杏科银杏属植物。银杏树出现于二亿年前，在冰川世纪几近灭种，仅在我国幸存，被达

32、尔文称为“活化石”。我国银杏资源占世界总量的70 ，其主要来源于人工栽培。目前已形成几大银杏栽培基地，并建有专门的采叶园，用于大规模生产银杏叶，2000年产银杏叶高达2万吨，年产银杏叶标准提取物百余吨，原料十分充足。银杏叶中含有黄酮类、萜类、酚类、生物碱类、聚异戊二烯、多糖等多种具有药理作用的活性成分。从银杏叶中分离提取的提取物即银杏叶提取物(EGB)具有相当强烈的抗氧化作用，能消除生物体内过剩的自由基，阻止体内脂质过氧化，提高肌体免疫能力促进血液循环及脑代谢，同时还具有抗衰老、防止神经系统疾病等功能（李兆龙等，1996）。国产的银杏制剂主要有：天保宁(浙江康恩贝)、银可络(深圳海王药业)、银

33、杏叶片(三九集团立华制药)、银杏口服液(河北道化制药厂)、银杏胶囊(山西心研所)等（刘志敏等，1999）。槐米（Flos Sophorae Immaturus）为豆科植物槐（Sophora japonica ）的干燥花蕾，槐米主要含芦丁(rutin)、桦皮醇、槐二醇以及槐花米甲、乙、丙，还含有山奈素和槲皮素(quercetin)槐花皂苷等，芦丁在酶或酸的作用下水解成槲皮素（赵文彬等，2006）。研究表明：槐米具有抗癌防癌、抗血小板聚集、镇痛、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗炎、抗过敏、具有抗氧化及清除氧自由基作用、能降低血压、保护心肌缺血再灌汁损伤。有增强免疫功能及抗癌、抗菌、抗病毒和镇痛及影响多种酶

34、的活性等作用，且对人体无毒、无害、无致死、治癌、治突变等作用。近年来，许多国内外医药工作者都热衷于对槲皮素的提取、分离、检测及药理作用-9-贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文等方面的研究（伍世清等，2005）。目前国内对槐米的使用较多，除在一些中药方剂中为要药外，也已经有一些制剂形成了工业生产规模。如槐米浮萍胶囊。槐米浮萍胶囊中槐米、浮萍芳化清利为君；辅以水蛙、乳香、没药、赤芍活血祛癖、行气止痛；佐以获荃、白鲜皮、蛇床子健脾渗湿；怀牛膝活血强筋，直达病所；并配以黄岑、苦参清热除湿；甘草缓急止痛，调和诸药。全方共奏清热利湿、活血祛痕之功（缠双莺等，2005）。 槐角的主要活性成

35、分及其药理作用 槐角活性成分的组成及性质槐角提取物中黄酮类化合物的组成：槐角提取物中黄酮类化合物可分为黄酮和异黄酮两类化合物，主要以苷的形式存在。其中黄酮是槐角的主要药理成分之一，其苷元有 7 种，即槲皮素、山奈素、异鼠李素、杨梅素、芹菜素、木犀草素和三粒小麦黄酮。其中前三种是其主要成分（结构如图），槐角提取物的质量控制中主要检测这三种黄酮苷元的含量。其中，槲皮素类化合物有 9 个，其糖基主要是葡萄糖和鼠李糖基。山奈素比槲皮素在 3位少一个酚羟基，极性较小，槐角中山奈素类化合物有 8 个。异鼠李素是槲皮素的 3上羟基被甲基化的衍生物，槐角中异鼠李素化合物有 4 个（周金娥，2006 等）。R1

36、HOOHOOOR2OHR1R2分子式山奈素槲皮素异鼠李素HOHOCH3HHHC15H10O6C15H10O7C16H12O7图槐角中三种主要黄酮类的结构Figure1. 1The structure of three kinds of main flavones in fructus sophorae槐角中黄酮类化合物的性质：该类黄酮与银杏黄酮结构相近，均为酚性成分，属多环多元酚类，由于含有苯并 r-吡酮而形成烯醇酮的结构所表现的特性是黄酮- 10 -贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文分子中的酚羟基的弱酸性与铁盐的显色反应；还能与铝形成配合物，使光吸收长移，显较深的颜色，可用

37、于鉴定黄酮类化合物。同时酚羟基具有还原性，表现在提取加工过程中的氧化变色（Herath HMTB，1998）。黄酮苷类化合物的苷元多为结晶体，苷元多为无定形粉末，因苷类的结构中引入糖基，故均有旋光性，且多为左旋；黄酮、黄酮醇及其苷类分子含有助色团，颜色为深黄色；在紫外光下产生荧光，可用于黄酮类化合物的定性检验。该类化合物的苷元一般难溶于水，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂及稀碱溶液中。槐角中黄酮苷元与糖结合成苷后，水溶性相应增大，一般可溶于热水、甲醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯中，难溶于苯、氯仿等有机溶剂（刘志敏等，1999）。槐角中异黄酮类化合物主要包括 9 种：染料木素（

38、genistein）、槐属苷（sophororicoside）、染料木苷（genistin）、槐属双苷（sophorabioside）、染料木素7,4-二葡萄糖苷(genistein 7,4di-O-D-glucoside)、刺芒柄花素(formononetin)、刺芒柄花苷(ononin)、大豆苷(daidzin)、7-羟基-6, 4-二甲氧基异黄酮（afrormosin）（周金娥，2006 等）。染料木素抗癌与防癌活性确切，文献报道主要集中在乳腺癌和前列腺癌方面的活性。最新研究表明，其对胃腺癌细胞和肺癌细胞也有一定的抑制作用。 槐角活性成分的药理作用槐角提取物中活性成分主要包括黄酮和异黄酮

39、，国外对这类成分做了大量化学、药理和临床研究，发现其中的黄酮是其特殊生理活性的关键成分，具有很高的药用价值和广阔的临床应用前景，其主要药理作用如下：对心血管系统的作用槐角提取物中黄酮类化合物灌入家兔离体心脏，可引起冠状血管扩张；注射豚鼠后肢动脉，可扩张其后肢血管。对脑神经系统的作用黄酮类成分是强力自由基清除剂，故可起到抗衰老作用；同时又是血管调节剂、抗血管栓剂和代谢增强剂，可用于消费品疗脑缺血性疾病的起始期，还能防止自由基及PAF 引起的膜紊乱，对于防治衰老起重要作用。对抗血小板活化因子的作用血小板活化因子PAF 是目前已知作用最强的低分子时血小板激活剂，具有广泛的生理活性。在免疫或非免疫因素

40、刺激下，对- 11 -贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文多种细胞，如白细胞、巨噬细胞、内皮细胞、血小板和嗜中性白细胞均能产生PAF，而PAF 又能激活大多数炎症细胞产生PAF，近来研究发现PAF 与血管的通透性有关，且与血栓形成及动脉粥样硬化形成有关。含有银杏叶提取物（主要成分为内酯、黄酮）的药物制剂对PAF 有特异性的拮抗性，因此它们有显著的治疗动脉硬化、冠心病、脑出血及脑缺血等心脑血管病及有抗炎症、降血压作用（李兆龙等，1996）对自由基的清除作用在人体的新陈代谢过程中，会产生某些高度活性的自由基，随着人年龄的增长或某些生理病变及外界因素的影响，人体内自由基的这种动态平衡

41、受到破坏，自由基积累过多，引起生物膜上的不饱和脂肪酸的过氧化作用，使膜结构发生变化，导致生物膜功能受损，从而导致某些疾病或引起衰老。现已证明黄酮类化合物具有超氧化物歧化酶样的作用，对与自由基有关的疾病如老年性痴呆症、衰老、神经病、心脑血管系统疾病及糖尿病等均有改善作用。对平滑肌的作用和抗过敏作用槐角的重要提取物黄酮类化合物，对豚鼠离体肠管有解痉作用，并能对抗组织胺及氯化钡引起的痉挛，其作用与罂粟碱相似，但更持久。对其他方面的作用山奈素在一定条件下能通过活化 PXR 诱导 CYP3A4 的转录表达,并存在剂量-效应和时间-效应关系。有研究显示，山奈酚在低浓度mol/L)就可以活化 PXR 诱导

42、CYP3A4，该结果提示，摄入少量的山奈酚就可能影响某些与其同时使用的临床药物的代谢。在一定实验条件下，山奈酚的诱导作用甚至强于人 CYP3A4 诱导物利福平（刘冬英等 2006）。此外，PXR 还参与外源化学物对 CYP2B6、CYP2C、谷胱甘肽-S 转移酶、多药耐药 MDR1 和有机阴离子转运多肽 OATP2 等的调节。因此，山奈酚对 PXR 的活化还有可能影响这些代谢酶和相关因子的调节，从而使药物在体内的代谢和清除发生改变（徐玫等, 2006）。 槐角活性成分在生活中的应用槐角丸是中国药典收载品种，是由槐角(炒)、地榆、黄答、积壳、当归、防风组成，具有清肠疏风，凉血止血的功效，用于肠风

43、便血，痔疮肿痛。中国药典2000 年版一部仅有鉴别和定性检查项，未作有效成分含量测定。槐角是其中的君药，入肝经，有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和对心脏正性肌力功（边清泉等,2005）。目前国内生产槐角丸的企业多达数十家。- 12 -贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文槐角中的二十六醇可用于脂质代谢障碍的各种疾病的预防和治疗，包括高血压、动脉硬化症和伴随的末梢循环障碍、脑梗塞、心肌梗塞、血栓等疾病。二十八醇是降血钙素形成促进剂，可用于治疗血钙过多的骨质疏松、高胆固醇和高脂蛋白，以及刺激动物及人类的性行为。麦芽酚具有极好的抗氧化损伤功能，在细胞学及生物学水平上具有明显的保护神经细胞免受氧化

44、损伤的作用，可抑制活性氧引起的人神经瘤细胞株(SH-SY5Y)凋亡，可作为一种预防老年性痴呆等神经衰弱性病的新药。染料木素是一种植物雌激素，具有明显异黄酮的激素样作用，对防治妇女绝经期的骨质疏松、癌症等疑难杂症具有预防和治疗作用（马磊等 ,2006）。抗肿瘤作用黄酮类化合物的抗菌和抗病毒作用（Alasubramanian, 2007）已得到医学界的肯定, 其抗肿瘤作用主要是通过诱导细胞凋亡、促进抗肿瘤细胞增殖、干预细胞信号转导和促进抑癌基因表达等途径来实现。尽管黄酮类化合物发挥抗肿瘤活性时, 均有A 环与受体的负电荷中心结合、C 环与受体的正电荷中心结合、其它部分通过氢键与受体发生作用的共性,

45、 但因其苯环上取代基的不同而具有不同的抗肿瘤活性。如以不同糖基取代时, 其抗肿瘤、抗氧化作用效果的差别就会很大。Silvia 等（Gobbi S，2006）采用CoMFA 分析模式设计合成了9个黄酮类衍生物, 并对其生物活性进行测试, 期望研发出一批新颖的非甾体类芳香化酶抑制剂。结果表明，黄酮类化合物对细胞色素的抑制作用略优于市售药物法倔唑。抗心血管疾病作用黄酮类化合物具有抗心血管疾病的功能（Jones D. L,2004）。 美国食品与药物管理局(FDA)于1999 年10月就已将大豆异黄酮中的大豆蛋白推荐为降低血液中胆固醇浓度，以减少患心血管疾病危险的健康食品。研究表明, 黄酮类化合物可治

46、疗心脑血管系统的一些疾病, 有降血脂、胆固醇的作用, 还具有抑制血栓和扩张冠状动脉等作用, 可用于治疗高血压、动脉硬化。李永福等报道了一系列2-氨基-3-胺甲基-4-羟基-6-取代异黄酮衍生物的合成。中间体2-甲氧基-5-取代苯甲酸甲酯系采用相转移催化技术同时进行醚化和酯化得到。Claisen 缩合产物用三溴化硼脱甲基同时环化成2-氨基异黄酮化合物（图），利用Mannich 反应在4-羟基的邻位引入胺甲基制得目的物，药物筛选结果显示化合物对小白鼠具有明显的耐缺氧作用。纪庆娥等在黄豆甙元化学结构的基础上,- 13 -贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文合成了一系列异黄酮衍生物。小

47、鼠耐缺氧试验结果表明，化合物对其具有显著抗缺氧作用；其中化合物对大鼠静注脑垂体后叶素引起的缺血性心电变化具有明显的保护作用, 且能显著缩小实验家兔急性心肌梗塞范围。图2-氨基异黄酮合成路线The synthetic route of 2-amino isoflavonesEdwin 等合成了一系列2-烷基异黄酮衍生物(图)以研究3-苯基结构对异黄酮抗高血压活性的影响, 以及不同基团2-位取代效应。研究结果表明: 除2-异丙基取代产物外, 其他的衍生物在抗高血压活性方面均表现为缓发性和长效性；但是所合成的异黄酮衍生物均不如相应的黄酮衍生物以及3-苯基黄酮衍生物的生理活性强。- 14 -贵 州 大

48、 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文图三类化合物结构Chemical structures of the target flavonid scompounds闫炳双等合成了8个7-(1-咪唑)烷氧基黄酮衍生物以及5个7-乙酰水杨酰氧基黄酮衍生物(图), 期望这些衍生物均具有抑制血小板聚集活性。图 目目标化合物的化学结构Figure1-4 Chemical structures of thethetarget flavonid compoundsMasahiro 等设计合成了一系列放射性碘标记的黄酮类衍生物(图), 以期研发一批新颖的生物体内淀粉显像剂。据报道, 这是首次以黄酮类化合物为核

49、心结构作为检测阿滋海默病(AD)的淀粉显像剂。- 15 -图of贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文图放射性碘标记的黄酮类衍生物合成路线抗骨质疏松The synthetic route of radioiodinated flavone derivatives黄酮类化合物可以用于治疗骨病和骨质疏松等症（Biasutto, L,2007）, 其作用机理在于: 其一, 它既可以抑制前列腺素E2 (PGE2) 的胶原蛋白合成增加, 又能抑制PGE2 的胶原蛋白合成减少, 通过调节使其含量趋于平衡, 因此可以用于治疗骨病；其次, 它能提高甲状腺对雌激素的敏感性, 使甲状腺C 细胞分泌降

50、钙素的作用加强，最终抑制骨再吸收而治疗骨质疏松症；其三, 它还能抑制饮食中缺钙和维生素D 引起的骨密度和骨钙含量的降低。周耘等设计合成了2个7-卤代烷基氧-4-甲氧基异黄酮和5个7-氮杂烷基氧-4-甲氧基异黄酮(图),其中6 个为新化合物, 并进行体外抗骨质疏松作用的初步药理筛选, 结果显示这些化合物对体外培养的兔骨髓成骨细胞的生长有较好的促进作用。图芒柄花素衍生物化学结构Chemical structures of formononetin derivativesWang 研究组利用超声波化学合成法合成了16 个染料木素衍生物。他们对去卵巢大鼠的骨头矿物密度(BMD)及骨灰灰烬的重量(WBA

51、)进行了生物测定,发现所合成化合物可以作为体内选择性雌激素受体调节器,还能够促进成骨细胞的生长, 具有抗骨质疏松的作用。研究结果显示：2-硫代羟乙基结构对化合物的- 16 -贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文抗骨质疏松活性是非常重要的；染料木素甲基化后会失去抗骨质疏松的活性, 但是当对甲基化产物磺化后, 其活性增强；其中化合物对去卵巢大鼠的生物活性最强；毒性试验结果表明该类生物活性化合物均无剧毒（，2004）。消除自由基和抗氧化活性自由基是引起癌症、衰老、心血管等退变性疾病的罪恶之源。自由基在体内可直接或间接地发挥强氧化剂作用而与机体内核酸、核蛋白和脂肪酸相结合, 转变成氧化

52、物或过氧化物, 使之丧失活性或变性, 细胞功能发生障碍, 引起机体逐渐衰老或病变。生物体内常见的自由基有: 超氧阴离子自由基(O2)、羟基自由基(OH)、烷氧自由基(RO)等。Sadik 等（Ayhan-Kilcigil,G，2004）的研究表明黄酮类化合物具有清除自由基和抗氧化活性的功能。研究显示,黄酮类化合物具有抑制自由基的生成、降低脂质过氧化（Kapiotis S，1997）和刺激抗氧化酶的作用。其作用机理在于它能有效阻止自由基在体内产生的三个阶段, 即与O2 反应阻止自由基引发；与金属离子螯合阻止OH 的生成；与脂质过氧化基ROO 反应阻止脂质过氧化过程。Philip 等合成了一系列4

53、-单取代、7-单取代和4，7-双取代的大豆甙元及染料木素脂肪酸酯和脂肪酸盐, 该反应选择性好, 合成产率高。实验证明此类异黄酮衍生物同样具有抗氧化活性以及具有抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化的活性。本实验组合成了水溶性较好的3-磺酸钠-4，7-二羧甲基异黄酮和3-磺酸钠-4-羟基-7-羧甲基异黄酮(图)。对自由基的清除作用在人体的新陈代谢过程中，会产生某些高度活性的自由基，随着人年龄的增长或某些生理病变及外界因素的影响，人体内自由基的这种动态平衡受到破坏，自由基积累过多，引起生物膜上的不饱和脂肪酸的过氧化作用，使膜结构发生变化，导致生物膜功能受损，从而导致某些疾病或引起衰老。现已证明黄酮类化合物

54、具有超氧化物歧化酶样的作用，对与自由基有关的疾病如老年性痴呆症、衰老、神经病、心脑血管系统疾病及糖尿病等均有改善作用。对平滑肌的作用和抗过敏作用槐角的重要提取物黄酮类对豚鼠离体肠管有解痉作用，并能对抗组织胺及氯化钡引起的痉挛，其作用与罂粟碱相似，但更持久。对其他方面的作用山奈素在一定条件下能通过活化 PXR 诱导 CYP3A4 的转录表达,并存在剂量-效应和时间-效应关系。有研究显示，山奈酚在低浓度mol/L)就可以活化 PXR 诱导 CYP3A4，该结果提示，摄入少量的山奈酚就可能- 17 -贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文影响某些与其同时使用的临床药物的代谢。在一定实验

55、条件下，山奈酚的诱导作用甚至强于人 CYP3A4 诱导物利福平（刘冬英等，2006）。此外, PXR 还参与外源化学物对 CYP2B6、CYP2C、谷胱甘肽-S 转移酶、多药耐药 MDR1 和有机阴离子转运多肽 OATP2 等的调节。因此，山奈酚对 PXR 的活化还有可能影响这些代谢酶和相关因子的调节 ,从而使药物在体内的代谢和清除发生改变（徐玫等,2006）。图目标化合物合成路线The synthetic route of target compounds利用荧光光谱法研究了它们对羟基自由基的清除作用, 用紫外光谱法研究了它们对超氧阴离子自由基和有机自由基DPPH 的清除作用。并采用量子化学

56、半经验法(Semiempirical calculations)对所合成的化合物清除羟基自由基的能力做理论分析。实验结果表明这两种化合物都具有较好的清除羟基自由基、氧阴离子自由基和DPPH 有机自由基的作用。目前槐角提取物中山奈素的纯化工艺少有报道，山奈素提取分离一般采用硅胶吸附色谱分离，及醇提液减压浓缩后预先用乙醚或石油醚脱脂，再用正丁醇萃取出槐角苷类物质，再将槐角苷类用硅胶进行柱层析得到山奈素，得到纯度大于90 % 的梓醇单体,得率为6 %。可以看出这个工艺繁琐且需用大量有机试剂。 张秀丽等，2008）- 18 -（贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文2 研究思路 研究目的

57、和意义目前，山奈素作为一种活性甲氧基单体，其药理活性研究鲜有报道，主要是由于其在中药中含量较低，分离提取较为困难。虽然有报道从高良姜药材中分离出山奈素，但事实上，并非所有的高良姜药材中都含有山奈素成分。目前系统地从槐角中提取总黄酮以及从其提取物中纯化山奈素的方法还比较少。随着槐角药用价值的研究深入，越来越广泛地运用到很多疾病的治疗中去，药厂对山奈素的需求也越来越大，迫切要求纯度高（90 %）、成本低的产品上市，在这种背景下提纯山奈素具有重要的意义。本课题主要是对不同的药用植物（山奈、槐角、金钱草、银杏叶、槐米等）中的山奈素含量进行测定，从而选取其中山奈素含量较高的原料药物，进行进一步的提取分离

58、以及工艺优化；目的是为了找到一条合理的、经济适用的水浸提方法将槐角中总黄酮提取出来并纯化山奈素，使其具有成本低，工艺简单，综合利用率高等优点，建立槐角粗提取物（总黄酮）精提取物（山奈素）的生产工艺路线并对其中山奈素抗氧化的生物活性进行研究。 研究内容1、研究槐角、银杏叶等五种植物中山奈素的含量进行比较，确定槐角为山奈素提取原料，并在此基础上优化槐角提取条件。（1）提取温度优化（2）提取料液的量优化（3）提取时间优化2、确定槐角在一个生长周期中总黄酮含量的变化规律，采用水解法测定槐角阶段性的总黄酮含量（不同产地的槐角每个月采样一次），研究槐角在一个生长周期中总黄酮含量的变化。3、采用 HPLC

59、方法鉴定槐角中总黄酮组分，通过标准的槲皮素和山奈素样品，建立槐角中总黄酮的组成成分 HPLC 指纹图谱。4、采用大孔吸附树脂柱进行分离提纯，主要对大孔树脂的筛选、洗脱条件的优化进行研究，寻找一条从槐角中提取山奈素的最佳工艺路线。- 19 -贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文5、槐角总黄酮中纯化山奈素。利用酸水解从槐角提取物中纯化山奈素使其含量提高到 90 % 以上，构建一条成本低、纯度高、可适用于中试生产的工艺路线。6、通过动物实验，对槐角提取物中山奈素的抗氧化生物活性进行研究。 本课题设计思路建立槐角粗提取物（总黄酮）精提取物（山奈素）的生产工艺路线并对其中山奈素的抗氧化生

60、物活性进行研究，具体从以下方面开展研究：原料筛选HPLC 最佳检测条件的建立槐角中总黄酮 HPLC 指纹图谱的建立槐角生长周期中山奈素含量的变化规律槐角粗提物工艺研究提取物 HPLC 分析及数据采集山奈素纯化工艺研究山奈素生物活性研究图 山奈素研究设计路线图Figure2. 1The route designed for the researching on kaempferol 关键技术“槐角粗提物（总黄酮）精提物（山奈素）”槐角提取物工艺的建立及槐角提取物纯化工艺的建立。- 20 -贵 州 大 学 2009 届 硕 士 学 位 论 文3 实验部分 仪器、材料与试剂 仪器HB-8 型恒温水浴