第6章 微生物的生长与生长环境-11-30

1、第第6章章 微生物的生长与环境条件微生物的生长与环境条件第一节第一节 微生物的生长和测定方法微生物的生长和测定方法第二节第二节 微生物的生长与环境条件微生物的生长与环境条件目的要求目的要求 1. 掌握微生物的生长和纯培养；掌握微生物的生长和纯培养； 抑菌、灭菌、消毒和过滤除菌；抑菌、灭菌、消毒和过滤除菌； 分批培养和连续培养的基本概念。分批培养和连续培养的基本概念。2. 掌握微生物生长的测定方法。掌握微生物生长的测定方法。3. 掌握细菌群体生长的规律掌握细菌群体生长的规律生长曲线生长曲线4. 掌握环境条件对微生物生长的影响及应用。掌握环境条件对微生物生长的影响及应用。 第一节第一节 微生物的生

2、长和测定方法微生物的生长和测定方法n1生长的定义生长的定义n 在高等生物中，在高等生物中， 生长：生长：个体的增大；个体的增大；繁殖：繁殖：个体数量的增加；个体数量的增加；n对微生物个体来说，生长与繁殖也是两个不同的过程。对微生物个体来说，生长与繁殖也是两个不同的过程。n微生物的生长：微生物的生长：微生物群体微生物群体一个微生物细胞一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果

3、各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长群体的生长2. 微生物生长的测定方法微生物生长的测定方法n微生物生长：微生物生长：n n单位时间里微生物数量或生物量（单位时间里微生物数量或生物量（BiomassBiomass）的变化）的变化n 个体计数个体计数- -细胞数量细胞数量的测定的测定 n微生物生长的测定：微生物生长的测定： 群体重量测定群体重量测定- -细胞生物量细胞生物量的测定的测定n 群体生理指标测定群体生理指标测定1） 细胞

4、数量的测定细胞数量的测定n直接测数法（测直接测数法（测总数总数）n比浊法（测比浊法（测总数总数）n稀释平板计数法（测稀释平板计数法（测活菌数活菌数）n浓缩法浓缩法n最大概率稀释法最大概率稀释法直接测数法（测总数）直接测数法（测总数）n对象：对象：单细胞微生物单细胞微生物n 细菌、酵母、孢子细菌、酵母、孢子n工具：工具：血球计数板，细菌计数板血球计数板，细菌计数板n优点：优点：简便、快速、准确；简便、快速、准确；n缺点：缺点：是难以区分死活细胞或与细菌类是难以区分死活细胞或与细菌类n 似的杂质似的杂质。 比浊法（测总数）比浊法（测总数）n原理：原理：在一定的浓度范围内，菌悬液中的细胞浓度与液在一

5、定的浓度范围内，菌悬液中的细胞浓度与液体的光密度成正比，与透光度呈反比。体的光密度成正比，与透光度呈反比。n仪器：仪器：光电比色计光电比色计n优、缺点：优、缺点：同直接测数法。同直接测数法。稀释平板计数法（活菌计数法）稀释平板计数法（活菌计数法）n原理：原理：在充分稀释的条件下经培养由单个细胞长成一个单在充分稀释的条件下经培养由单个细胞长成一个单独的菌落，从菌落数可以计算样品中的细菌数。独的菌落，从菌落数可以计算样品中的细菌数。n优点：优点：活菌数，活菌数，n缺点：缺点：费工、费时、费料。费工、费时、费料。 采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果：样品充分混匀；每支移液管

6、及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复,取平均值；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。浓缩法浓缩法n 适用于检测微生物数量适用于检测微生物数量很少的水和空气样品。很少的水和空气样品。最大概率稀释法最大概率稀释法n优点：优点：可在一个混杂的样品中测定具有某种特殊生理功可在一个混杂的样品中测定具有某种特殊生理功能类群的活菌数量。能类群的活菌数量。2） 细胞生物量的测定细胞生物量的测定n干重法：干重法： l mg干细胞干细胞45 m

7、g湿菌湿菌n 45l09 细胞，细胞， n总氮量测定法：总氮量测定法：细菌含氮量一般为细菌含氮量一般为1215%nDNA含量测定法：含量测定法：每个细菌细胞每个细菌细胞DNA含量含量n 平均为平均为8.410-5ng，n代谢活性法：代谢活性法：三三. 细菌群体的生长细菌群体的生长 生长曲线生长曲线 growth curven若以少量细菌纯种接种到一个若以少量细菌纯种接种到一个装有无菌培养液的三角瓶中，装有无菌培养液的三角瓶中，在培养过程中，定时取样测定在培养过程中，定时取样测定活菌数和总菌数，以其对数为活菌数和总菌数，以其对数为纵坐标纵坐标，以时间为横坐标以时间为横坐标，可，可以绘出一条以绘出

8、一条S形的曲线，这就是形的曲线，这就是生长曲线生长曲线。lgNT / h细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图一条典型的生长曲线至少可以分为 迟缓期迟缓期，对数期对数期，稳定期稳定期和和衰亡期衰亡期等四个生长时期细菌群体生长的细菌群体生长的4 4个时期个时期1. 延滞期延滞期 lag phase2. 对数期对数期(指数期指数期) logarithmic or exponential phase3. 稳定期稳定期 stationary phase4. 衰亡期衰亡期 decline phase /death phase1. 延滞期延滞期n 细胞特征：细胞特征：个体变长，个体变长，n 体积增大，

9、体积增大，n 代谢加强，代谢加强，n RNA含量增加，含量增加，n 贮存物消失。贮存物消失。n长短：长短：菌种遗传性状、菌龄、接种前后菌种遗传性状、菌龄、接种前后培养条件的差异等。培养条件的差异等。lgNT / h2. 2. 对数期对数期( (指数期指数期) )n表表细胞生长旺盛，代谢活力细胞生长旺盛，代谢活力强、分裂速度快，以几何级强、分裂速度快，以几何级数增加，代时稳定。数增加，代时稳定。n细细形态、生理、生化组成较形态、生理、生化组成较为一致，适合于用作研究材为一致，适合于用作研究材料。料。n在工业发酵中作种子。在工业发酵中作种子。lag phaselag phaselog phasel

10、gNT / hG值的计算值的计算 T0 T1 n 1 2 4 8 n 20 21 22 23 2n n 1代代 2代代 3代代 n代代 n Nt = N0 X 2n , n lgNt = n X lg2 + lgN0 , 即即n = (lgNt - lgN0) / lg2 n 求得求得 G = t / n = 0.301t / (lgNt - lgN0)3.稳定期稳定期 stationaryn 营养物质消耗，有害代谢产营养物质消耗，有害代谢产物积累、物积累、pHpH、EhEh变化使生长速变化使生长速率下降、死亡率上升，两者平率下降、死亡率上升，两者平衡。衡。n细细体积较小，开始积累贮存物体积较

11、小，开始积累贮存物和次生代谢产物、芽胞细菌开和次生代谢产物、芽胞细菌开始形成芽胞。始形成芽胞。n 在工业生产中可通过补料、在工业生产中可通过补料、调温度、通气等措施来延长稳调温度、通气等措施来延长稳定期。定期。lag phaselag phaselog phaseStationary phaselgNT / h4. 衰亡期衰亡期n营养物质消耗完，营养物质消耗完，环境条件恶化，死环境条件恶化，死亡率迅速上升，总亡率迅速上升，总菌数仍很高，但活菌数仍很高，但活菌数急剧下降。菌数急剧下降。n细胞特征：细胞特征：多形态、多形态、畸形、革兰氏染色畸形、革兰氏染色不稳定。不稳定。lag phaselag

12、phaselog phaseStationary phaselgNT / hDeath phase 同步生长同步生长 以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长。并同时进行分裂的生长。n同步生长的诱导同步生长的诱导 n 离心方法离心方法 1 1、机械筛选法、机械筛选法 过滤分离法过滤分离法 硝酸纤维素滤膜法硝酸纤维素滤膜法n n 温度温度n 2 2、环境条件诱导法、环境条件诱导法 培养基成份控制培养基成份控制 其他（如光照和黑暗交替培养）其他（如光照和黑暗交替培养） 连续培养连续培养 continuous-flow cultur

13、en批量生长：批量生长：微生物在有限液体培养基中的生长方式。微生物在有限液体培养基中的生长方式。n连续培养：连续培养：该方法的原理是不断地向培养器中流加培养液，该方法的原理是不断地向培养器中流加培养液，同时移出同体积菌液同时移出同体积菌液使培养器中微生物保持相对稳定生长使培养器中微生物保持相对稳定生长速率，始终处于对数期或稳定期，以获得大量的均匀的菌体速率，始终处于对数期或稳定期，以获得大量的均匀的菌体或代谢产物。或代谢产物。n连续培养在工业上应用能缩短发酵周期，提高设备利用率，连续培养在工业上应用能缩短发酵周期，提高设备利用率，减少成本，是今后发酵工业的发展方向。减少成本，是今后发酵工业的发

14、展方向。1.恒浊连续培养恒浊连续培养n测定菌体浓度，调节加入培测定菌体浓度，调节加入培养液的流速，保持培养物浊养液的流速，保持培养物浊度恒定。度恒定。n一般使用养料浓度较高的完一般使用养料浓度较高的完全培养基，没有限制性成分。全培养基，没有限制性成分。n较高的的生长速率。较高的的生长速率。n大量形态与生理特征基本相大量形态与生理特征基本相同的细胞。同的细胞。n控制一种低浓度的限制性养控制一种低浓度的限制性养料因子，通过调节其浓度来料因子，通过调节其浓度来获得具有不同生长速率的培获得具有不同生长速率的培养物。养物。n常用于模拟和研究微生物在常用于模拟和研究微生物在自然状态下养料稀薄状态下自然状态

15、下养料稀薄状态下的生长规律。的生长规律。2 恒化连续恒化连续培养培养第二节第二节 环境条件对微生物生长的影响环境条件对微生物生长的影响n几个概念几个概念n抑菌：抑菌：对微生物的代谢产生抑制作用，并不导致死亡，抑对微生物的代谢产生抑制作用，并不导致死亡，抑制因子消失后，微生物可恢复生长。制因子消失后，微生物可恢复生长。n灭菌：灭菌：使微生物不可逆地失去繁殖能力。使微生物不可逆地失去繁殖能力。n消毒：消毒：指消除、灭活病原微生物。指消除、灭活病原微生物。n过滤除菌：过滤除菌：用滤膜过滤法除去液体、空气中的微生物，获用滤膜过滤法除去液体、空气中的微生物，获得无菌材料。得无菌材料。环境因素环境因素n1

16、温度温度 5. 辐射辐射 n2水分水分 6. 超声波超声波n3酸碱度酸碱度 7. 高压高压n4. O2和和Eh 8. 化学杀菌剂和抑菌剂化学杀菌剂和抑菌剂1温度（温度（temperature）n1） 温度对微生物的作用温度对微生物的作用 n温度的温度的3个临界值：最低、最适、最高生长温度。个临界值：最低、最适、最高生长温度。温度温度生生长长速速率率最最低低最适最适最高最高中温型中温型高温型高温型低温型低温型2） 微生物生长的温度类型微生物生长的温度类型n低温型微生物低温型微生物 小于小于0可生长可生长n中温型微生物中温型微生物 最适温度最适温度 20-40n高温型微生物高温型微生物 最适温度最

17、适温度 50-603） 温度对微生物的抑制作用温度对微生物的抑制作用n低温低温：在比最低点低的温度，微生物停在比最低点低的温度，微生物停n 止生长，可长期保存活性。止生长，可长期保存活性。n 低于低于0结冰，将会致死。结冰，将会致死。n应用：应用： 保存菌种保存菌种 4，n 20，40，n 80，液氮，液氮高高 温温：n超过超过Max点的温度，死亡。点的温度，死亡。n蛋白质含水量愈高，愈易蛋白质含水量愈高，愈易n凝固，所以在同一温度下，凝固，所以在同一温度下，n湿热更容易引起微生物死湿热更容易引起微生物死n亡。亡。 10 20 30 40 50 蛋白质含水量（%）1604080120蛋白质凝固

18、最低温度蛋白质凝固最低温度常用的消毒灭菌方法常用的消毒灭菌方法n煮煮 沸沸 法法: 100，3060min。n巴氏消毒法巴氏消毒法: 6365，30min，或，或70，l5min，n 杀灭病原微生物及不耐热的营养细胞杀灭病原微生物及不耐热的营养细胞,适用于风味饮料。适用于风味饮料。n间歇灭菌法间歇灭菌法: 100 1530min 室温过夜（残留芽胞萌发）室温过夜（残留芽胞萌发）,n 重复重复3次，可杀灭所有微生物。适用次，可杀灭所有微生物。适用:不耐热的药不耐热的药品、营养成分、特殊培养基，或缺乏高压灭菌锅时。品、营养成分、特殊培养基，或缺乏高压灭菌锅时。n高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌: 121

19、20min。适用：一般培养基、液体、固。适用：一般培养基、液体、固体、器具等体、器具等n干干 热热 灭灭 菌菌: 160180，12h。适用：玻璃、金属制品。适用：玻璃、金属制品2水分和渗透压水分和渗透压n1） 水活度水活度 aw Water activity n水活水活度度aw即表示环境中水对微生物生长可给性高低的指标。即表示环境中水对微生物生长可给性高低的指标。naw 的测定的测定 ：naw Ps （溶液的蒸汽压）（溶液的蒸汽压）/ Pw （纯水的蒸汽压）（纯水的蒸汽压）n RH (相对湿度相对湿度)。各类微生物生长的各类微生物生长的aw 范围范围n细菌细菌 0.901.00n酵母和丝状真

20、菌酵母和丝状真菌 0.900.952 2） 渗透压渗透压 osmotic pressureosmotic pressuren渗透：渗透：纯水或其它低浓度溶液经过半透性膜向高浓纯水或其它低浓度溶液经过半透性膜向高浓度进行扩散的现象。度进行扩散的现象。n渗透压：渗透压：渗透压是溶剂透过半透膜所产生的压力为渗透压是溶剂透过半透膜所产生的压力为渗透压。渗透压。n在低渗溶液中原生质体会吸水膨胀破裂。在低渗溶液中原生质体会吸水膨胀破裂。n在高渗环境中，质壁分离，会脱水，直至死亡。在高渗环境中，质壁分离，会脱水，直至死亡。n微生物生长都受到抑制，微生物生长都受到抑制，n应用：腌菜：应用：腌菜：10；n 腌鱼

21、肉类：腌鱼肉类：1015；n 蜜饯：蔗蜜饯：蔗 糖糖5070；n 晒干材料。晒干材料。3 3酸碱度酸碱度 Acidity and pHn在在pH 112范围内，都有微生物生长。范围内，都有微生物生长。n主要类群最适主要类群最适pH：n 细细 菌：菌： 6.57.4n 放线菌：放线菌： 7.08.0n 真真 菌：菌： 5.06.0n极端微生物极端微生物应用应用n1.配培养基时，要调配培养基时，要调pH值。值。n2.微生物的活动也可改变环境微生物的活动也可改变环境pH值，使用缓冲剂：值，使用缓冲剂：K2HPO4KH2PO4或或CaCO3。n3.强酸、强碱的杀菌能力很强，但是强酸腐蚀性太强，强酸、强

22、碱的杀菌能力很强，但是强酸腐蚀性太强，很少采用。很少采用。n4.石灰酸常应用于卫生消毒，苯甲酸、乳酸可用作防石灰酸常应用于卫生消毒，苯甲酸、乳酸可用作防腐剂。腐剂。4O2和Eh 1 1）氧气对微生物生长的影响）氧气对微生物生长的影响 n根据微生物与氧气的关系，可以分为根据微生物与氧气的关系，可以分为5种类型种类型: 类类 型型 特特 征征 代代 表表 类类 群群n需氧菌需氧菌 O2为最终电子受体为最终电子受体 大多数微生物大多数微生物n兼性厌氧菌兼性厌氧菌 O2 ：有氧呼吸：有氧呼吸n - O2 ：发酵：发酵/无氧呼吸无氧呼吸 许多细菌、酵母许多细菌、酵母n微需氧菌微需氧菌 只在只在210%

23、O2下生长下生长 种类不多种类不多,如嗜盐片球菌如嗜盐片球菌n耐气性厌氧菌耐气性厌氧菌 以发酵获取能量以发酵获取能量, 乳酸菌乳酸菌n O2无毒害作用，无毒害作用，n专性厌氧菌专性厌氧菌 O2毒害作用，毒害作用， 产甲烷细菌产甲烷细菌,梭菌梭菌 专性厌氧菌专性厌氧菌n 由于缺少过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶，无由于缺少过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶，无法消除在有法消除在有O2时产生的这些过氧化物，一旦暴露在空气中，时产生的这些过氧化物，一旦暴露在空气中，将停止生长，甚至很快死亡。将停止生长，甚至很快死亡。2） Eh值与微生物的生长值与微生物的生长n环境的氧化还原电位除受环境的氧

24、化还原电位除受pH值、通气影响外，还取决于值、通气影响外，还取决于氧化氧化型物质型物质/还原型物质还原型物质比例，比例，Eh值与微生物生长的关系可图示值与微生物生长的关系可图示如下如下: -0.42 0 0.1 +0.82厌氧菌生长厌氧菌生长 需氧菌生长需氧菌生长 最适最适兼性厌氧菌兼性厌氧菌 发酵发酵 有氧呼吸有氧呼吸5. 辐射辐射 radiation1) 可见光可见光(397800nm)n能源能源n趋光性趋光性2) 紫外线紫外线 (136397nm)n紫外线是非电离辐射，杀菌作用最强在波长紫外线是非电离辐射，杀菌作用最强在波长260nm处，处，n杀菌机理杀菌机理:紫外线使紫外线使DNA上形

25、成的胸腺嘧啶的二聚体，引起细菌变异上形成的胸腺嘧啶的二聚体，引起细菌变异或死亡。或死亡。n用途用途: 1. 空气或器皿表面灭菌，空气或器皿表面灭菌，n 2. 常用的诱变剂。常用的诱变剂。3) 电离福射电离福射nX射线：射线：(0.0613.6nm),起源于原子内层电子跃迁；起源于原子内层电子跃迁；n射线：带正电的氦核流，电离作用强，穿透力弱；射线：带正电的氦核流，电离作用强，穿透力弱；n射线：带负电的电子流，电离作用弱，穿透力强；射线：带负电的电子流，电离作用弱，穿透力强；n射线：射线：(0.010.14nm)，起源于放射性同位素衰变产生的辐，起源于放射性同位素衰变产生的辐射，穿透力强。射，穿

26、透力强。共共 同同 特特 点点n是波长短、能量大、打断大分子的键，或使被照射是波长短、能量大、打断大分子的键，或使被照射的物质分子发生电离作用，形成游离基，后者与大的物质分子发生电离作用，形成游离基，后者与大分子结合可使之变性失活分子结合可使之变性失活:n X O2n H2O H+OH- H2O2 n用途：用途： 用用60Co产生的产生的射线进行食品、塑料制品等射线进行食品、塑料制品等不耐热材料的灭菌，减少能源消耗不耐热材料的灭菌，减少能源消耗。6超声波（超声波（ultrasound）n频率超过频率超过2万万Hz的声波，超声波通过强烈的振动使细的声波，超声波通过强烈的振动使细胞破裂死亡。胞破裂

27、死亡。n用途用途: 破碎细胞。破碎细胞。7. 7. 高压高压n人人1.52X107（127米）米）n敏感细菌敏感细菌2.02X107n抗性细菌抗性细菌5.57X1071.01X108n应用：应用：1000 10000个大气压可以进行灭菌保鲜。个大气压可以进行灭菌保鲜。8 8化学杀菌剂和化学疗剂化学杀菌剂和化学疗剂n化学杀菌剂：化学杀菌剂：通过坏微生物细胞结构或代谢机能而杀死微通过坏微生物细胞结构或代谢机能而杀死微生物的化学药剂生物的化学药剂.n抑菌剂抑菌剂:不坏细胞结构而只干扰新细胞物质合成和微生物生不坏细胞结构而只干扰新细胞物质合成和微生物生长繁殖的化学药剂长繁殖的化学药剂.n化学疗剂：化学

28、疗剂：可选择性地抑制或杀死人畜和家禽体内的病原可选择性地抑制或杀死人畜和家禽体内的病原微生物并可用于临床治疗的特殊化学药剂微生物并可用于临床治疗的特殊化学药剂.1) 化学药剂杀菌作用的一般规律化学药剂杀菌作用的一般规律n化学药剂对微生物的作用取决于药剂浓度、作用时间和微化学药剂对微生物的作用取决于药剂浓度、作用时间和微生物对药物的敏感性。生物对药物的敏感性。n许多化学药剂在高浓度时，起杀菌作用，低浓度时起抑菌许多化学药剂在高浓度时，起杀菌作用，低浓度时起抑菌作用；极低浓度时表现为刺激作用。作用；极低浓度时表现为刺激作用。化学药剂对微生物作用机理化学药剂对微生物作用机理a. 破坏细胞结构，如苯酚和乙醇；破坏细胞结构，如苯酚和乙醇；b.干扰细胞能量代谢，如重金属、干扰细胞能量代谢，如重金属、CO、氰化物等。、氰化物等。c.干扰细胞物质的合成，如磺胺等抗代谢物干扰细胞物质的合成，如磺胺等抗代谢物。2) 常用化学杀菌剂常用化学杀菌剂n苯酚苯酚 25 n来苏尔（乳化的甲酚）来苏尔（乳化的甲酚）35 桌面桌面n乙醇乙醇 70 皮肤、表面，使蛋白质