第4章 动物细胞与组织培养

1、第第4章章 动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养东北大学生物技术研究所东北大学生物技术研究所细胞工程教案细胞工程教案本章主要内容本章主要内容q 4.1 4.1 动物细胞的特点动物细胞的特点q 4.2 4.2 动物细胞与组织培养的定义与分类动物细胞与组织培养的定义与分类q 4.3 4.3 发展简史发展简史q 4.4 4.4 动物细胞的体外培养生长特性动物细胞的体外培养生长特性q 4.5 4.5 动物细胞、组织培养的基本技术动物细胞、组织培养的基本技术q 4.6 4.6 干细胞干细胞4.1 4.1 动物细胞的特点动物细胞的特点 动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞比动物细胞属于真核细胞，与细菌等

2、原核细胞比进化程度高，结构、成分更复杂，功能更全面。进化程度高，结构、成分更复杂，功能更全面。 白血球白血球 巨噬细胞巨噬细胞 细胞与细胞细胞与细胞 癌细胞癌细胞 胶质细胞胶质细胞 上皮细胞上皮细胞 4.1 4.1 动物细胞的特点动物细胞的特点动物细胞与微生物细胞的比较动物细胞与微生物细胞的比较（1 1）细胞大，无细胞壁；）细胞大，无细胞壁；（2 2）倍增时间长，生长缓慢，易受污染；）倍增时间长，生长缓慢，易受污染；（3 3）需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感；）需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感；（4 4）以聚集体形式存在；）以聚集体形式存在；（5 5）原代细胞一般繁殖）原代细胞一般繁殖5050

3、代左右就退化死亡。代左右就退化死亡。动物细胞与植物细胞比较动物细胞与植物细胞比较共同点共同点：动植物细胞中都有细胞膜、细胞质和细胞核。：动植物细胞中都有细胞膜、细胞质和细胞核。区别区别：动物细胞中无细胞壁、叶绿体和液泡，但是有的植物细胞中无叶绿：动物细胞中无细胞壁、叶绿体和液泡，但是有的植物细胞中无叶绿 体。体。 4.1 4.1 动物细胞的特点动物细胞的特点动物细胞连接的动物细胞连接的5 5种形式：种形式：（1 1）紧密连接（常见）紧密连接（常见）（2 2）间隙连接（常见）间隙连接（常见）（3 3）隔壁连接（无脊椎动物细胞）隔壁连接（无脊椎动物细胞）（4 4）中间连接（脊椎动物细胞）中间连接（

4、脊椎动物细胞）（5 5）桥粒连接（常见）桥粒连接（常见）Anchoring Anchoring junctionjunction动物细胞有三种类型的细胞连接动物细胞有三种类型的细胞连接 封闭连接封闭连接 紧密连接紧密连接 锚定连接锚定连接 桥粒、粘着带桥粒、粘着带 通讯连接通讯连接 间隙连接、化学突触、胞间连丝间隙连接、化学突触、胞间连丝细胞连接（细胞连接（cell junction）：）： 细胞间的联系结构，是细胞质膜局部区域特化形成的，在结构细胞间的联系结构，是细胞质膜局部区域特化形成的，在结构上包括膜特化部分、质膜下的胞质部分及质膜外细胞间的部分。上包括膜特化部分、质膜下的胞质部分及质膜

5、外细胞间的部分。细细胞连接胞连接是多细胞有机体中相邻细胞之间通过细胞质膜相互联系是多细胞有机体中相邻细胞之间通过细胞质膜相互联系, , 协协同作用的重要基础。同作用的重要基础。 1 1、封闭连接（、封闭连接（occluding junctions) occluding junctions) ：细胞质膜细胞质膜 细胞间隙细胞间隙 嵴线嵴线细胞细胞 A细胞细胞 B 紧密连接是封闭连接的主要形式。将相邻细胞的质膜密切的连接紧密连接是封闭连接的主要形式。将相邻细胞的质膜密切的连接在一起。在一起。紧密连接的存在部位和结构特点：紧密连接的存在部位和结构特点： 又叫不通透连接又叫不通透连接, ,它不仅连接相

6、邻的细胞它不仅连接相邻的细胞, , 而且封闭细胞间隙而且封闭细胞间隙, , 使大多数分子难以在细胞间通透。使大多数分子难以在细胞间通透。 这种连接方式普遍存在于这种连接方式普遍存在于腔道上皮细胞靠近管腔端的相邻细胞腔道上皮细胞靠近管腔端的相邻细胞膜间膜间。 从结构上看从结构上看, , 通过连接蛋白形成焊接线（嵴线），封闭相邻细通过连接蛋白形成焊接线（嵴线），封闭相邻细胞间的空隙。胞间的空隙。 紧密连接的功能：紧密连接的功能： 形成渗漏屏障，起重要的形成渗漏屏障，起重要的封闭作用封闭作用； 连接作用连接作用 隔离作用，使游离端与基底面质膜上的膜蛋白行使隔离作用，使游离端与基底面质膜上的膜蛋白行使

7、 各自不同的膜功能各自不同的膜功能 支持功能支持功能2 2、锚定连接（、锚定连接（Anchor junctions)Anchor junctions)： 通过细胞骨架系统将细胞与相邻细胞或细胞与基质之通过细胞骨架系统将细胞与相邻细胞或细胞与基质之间连接起来。间连接起来。包括包括桥粒与半桥粒连接桥粒与半桥粒连接和和粘合带与粘合斑连接粘合带与粘合斑连接桥粒与半桥粒连接：桥粒与半桥粒连接：与中间纤维相关的锚定连接。与中间纤维相关的锚定连接。粘合带与粘合斑连接：粘合带与粘合斑连接：与肌动蛋白纤维相关的锚定连接。与肌动蛋白纤维相关的锚定连接。 锚定连接在组织内分布很广泛，在上皮组织锚定连接在组织内分布很

8、广泛，在上皮组织, ,心肌和子心肌和子宫颈等组织中含量尤为丰富。宫颈等组织中含量尤为丰富。 主要靠黏着蛋白、整联蛋白和细胞骨架体系将相邻两细主要靠黏着蛋白、整联蛋白和细胞骨架体系将相邻两细胞或细胞与细胞外基质连接在一起。胞或细胞与细胞外基质连接在一起。 锚定连接的类型、结构与功能锚定连接的类型、结构与功能与中间纤维相连的锚定连接与中间纤维相连的锚定连接桥粒桥粒： 铆接相邻细胞，提供细胞内中间纤维的锚定位点，形铆接相邻细胞，提供细胞内中间纤维的锚定位点，形成整体网络，起支持和抵抗外界压力与张力的作用。成整体网络，起支持和抵抗外界压力与张力的作用。半桥粒半桥粒：半桥粒与桥粒形态类似半桥粒与桥粒形态

9、类似, ,但功能和化学组成不同。它但功能和化学组成不同。它通过细胞质膜上的膜蛋白整合素将上皮细胞固着在基底膜上通过细胞质膜上的膜蛋白整合素将上皮细胞固着在基底膜上, , 在半桥粒在半桥粒中，中间纤维不是穿过而是终止于半桥粒的致密斑内。中，中间纤维不是穿过而是终止于半桥粒的致密斑内。与肌动蛋白纤维相连的锚定连接与肌动蛋白纤维相连的锚定连接 粘着带粘着带：位于紧密连接下方位于紧密连接下方, ,相邻细胞间形成一个连续的带状相邻细胞间形成一个连续的带状 结构。间隙约结构。间隙约151520nm,20nm,也称带状桥粒。也称带状桥粒。 粘着斑粘着斑：细胞通过肌动蛋白纤维与细胞外基质之间的连接方式。：细胞

10、通过肌动蛋白纤维与细胞外基质之间的连接方式。 桥粒连接桥粒连接 一种特殊的细胞连接，位于特化的具有细胞间通讯作一种特殊的细胞连接，位于特化的具有细胞间通讯作用的细胞。用的细胞。 具机械的细胞连接作用具机械的细胞连接作用 通讯连接的方式：通讯连接的方式： 间隙连接间隙连接 化学突触化学突触 胞间连丝胞间连丝3 3、通讯连接（、通讯连接（communicating junctions) communicating junctions) ： 间隙连接间隙连接 间隙连接处相邻细胞质膜间的间隙为间隙连接处相邻细胞质膜间的间隙为23nm 基本单位是连接子基本单位是连接子 一种跨膜蛋白一种跨膜蛋白 每个连接

11、子由每个连接子由6 6个相同或相似跨膜蛋白亚单位个相同或相似跨膜蛋白亚单位环绕中央形成孔径为环绕中央形成孔径为1.5-2nm1.5-2nm的水性通道的水性通道 相邻两细胞分别用各自的连接子相互对接形成相邻两细胞分别用各自的连接子相互对接形成分子间的通道，允许分子量在分子间的通道，允许分子量在10001000道尔顿以道尔顿以下的分子通过。下的分子通过。间间隙隙连连接接 胞间连丝胞间连丝 是相邻植物细胞壁上的一个穿过细胞壁的狭窄通道。是相邻植物细胞壁上的一个穿过细胞壁的狭窄通道。 有管状的内质网通过。因此，通过胞间连丝，使得相有管状的内质网通过。因此，通过胞间连丝，使得相邻细胞的细胞质膜、细胞质、

12、内质网交融在一起。邻细胞的细胞质膜、细胞质、内质网交融在一起。 胞间连丝直径约胞间连丝直径约30-60nm30-60nm，允许，允许10001000道尔顿以下的分子道尔顿以下的分子渗透。渗透。 是存在于可兴奋细胞间的一种连接方式，其作用是通过释放神经递质来传导兴奋。 是神经递质用以传递电信号的通道。将电信号转化为化学信号或将化学信号转化为电信号的过程。 由突触前膜、突触后膜、突触间隙三部分组成。 突触前神经元的突起末梢膨大呈球形，称突触小体。 突触小体内有突触小泡，内含神经递质。 化学突触化学突触细胞连接的不同方式细胞连接的不同方式各类连接的比较各类连接的比较4.2 4.2 动物细胞与组织培养

13、的定义与分类动物细胞与组织培养的定义与分类1 1、 定义定义 动物细胞与组织培养（动物细胞与组织培养（animal cell and tissue animal cell and tissue culture)culture) 是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。2 2、 分类分类 动物细胞与组织培养可分为动物细胞与组织培养可分为细胞培养细胞培养、组织培养组织培养和

14、和器官培养器官培养。 v 细胞培养细胞培养( (cell culture):cell culture):细胞培养是指细胞的体外细胞培养是指细胞的体外培养培养, ,这是在无菌条件下这是在无菌条件下, ,将机体内的组织取出将机体内的组织取出, ,分散分散( (机械或机械或酶消化酶消化) )成单个细胞成单个细胞, ,在模拟体内的环境中在模拟体内的环境中, ,给以营养物质给以营养物质, ,使使细胞不断生长、繁殖或传代细胞不断生长、繁殖或传代, ,借以观察细胞的生长、分裂、接借以观察细胞的生长、分裂、接触抑制以及衰老、死亡等生命现象。细胞培养也包括单个细触抑制以及衰老、死亡等生命现象。细胞培养也包括单个

15、细胞的培养。胞的培养。v器官培养器官培养( (organ culture):organ culture):器官培养是指器官的原器官培养是指器官的原基基( (芽胚基芽胚基) )、整个器官或器官的一部分、整个器官或器官的一部分, ,在体外条件下保存在体外条件下保存( (维持维持) )或生长或生长, ,并能分化和保持结构和并能分化和保持结构和/ /或功能。或功能。v 组织培养组织培养( (tissue culture)tissue culture): :组织培养是指组织在体外条件下的维持或生长。此种方法可有组织分化及保特组织的结构和/或功能的特点。这里需要说明的是,当我们做组织培养时,不论用什么方法

16、和条件,组织培养中的主要成分仍然是细胞;细胞在生长过程中总有移动(运动)和其他变化,这样就使得被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长,发生变动的可能性越大。结果常使单一类型的细胞易保存下来,最终也成了细胞培养。v 所谓细胞培养,并不意味着细胞彼此之间是独立的。细胞在培养中的生命活动和体内细胞一样,仍然是相互依存的,呈现一定组织的特征。所以组织培养和细胞培养并无严格区别,两者在一定程度上可看作是同义语。细胞体外培养细胞体外培养可分为可分为原代培养与传代培养原代培养与传代培养v 原代培养原代培养( (primary culture):primary culture):是指将机体取

17、出的细胞或组织进行实效培养的过程。实效培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。v 传代培养传代培养( (subculture)subculture)：从原代培养的细胞继续转接培养的过程。 v 细胞系（细胞系（cell linecell line）：）：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。v 细胞株：细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标记的单一类型的细胞群体。 体外动物细胞在形态结构上均程度不同的与原来的体外动物细胞在形态结构上均程度不同的与原来的细胞有所差异细胞有所差异。 4.3 4.

18、3 发展简史发展简史第1次成功地培养脊椎动物细胞是在19071907年,美国科学家HarrisonHarrison首先利用蛙淋巴液来培养蛙胚神经管,并观察到神经纤维是由细胞质进行阿米巴运动所形成,解决了当时争论不休的神经纤维起源问题。是动物细胞组织培养的奠基人。19121912年德国科学家CarrelCarrel采用更换培养基和传代的方法解决了组织块长期存活的问题；设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 19431943年年,EarleEarle首先培养C C3 3H H小鼠的结缔组织并用致癌物20-甲基胆蒽处理,获得了能回种于小鼠体内并生长肉瘤的长期

19、培养的细胞系,定名为L L细胞系细胞系。 5年之后,SanfoldSanfold使用预先处理的条件培养基条件培养基(condition medium)成功地使L细胞系的一个单细胞在体外发展成“克隆”(clone)并繁殖成克隆株克隆株。 19511951年年GeyGey成功地用人的宫颈癌组织建立起能在体外连续培养的人的肿瘤细胞并定名为HeLaHeLa细胞系细胞系。这些细胞至今仍在世界各国广为应用。L L与与HeLaHeLa细胞系就成为最早建成的动物与人的细胞系。细胞系就成为最早建成的动物与人的细胞系。 19551955年年EagleEagle研制成人工合成的培养基研制成人工合成的培养基, ,使组

20、织培养工作使组织培养工作的劳动量大大减轻。的劳动量大大减轻。 2020世纪世纪7070年代年代SatoSato等人发展了无血清培养等人发展了无血清培养, ,解决了血清中解决了血清中存在的一系列问题存在的一系列问题, ,使细胞培养技术得到长足的发展使细胞培养技术得到长足的发展, ,并并推动了基因工程产品及其产业的发展。推动了基因工程产品及其产业的发展。 2020世纪世纪7070年代年代以来以来, ,我国组织培养技术发展更快我国组织培养技术发展更快, ,它已不它已不再是个别研究室所拥有的技术再是个别研究室所拥有的技术, ,而是已成为生物学和医学而是已成为生物学和医学研究中普遍应用的手段。近研究中普

21、遍应用的手段。近2020年建立的各种细胞系已不年建立的各种细胞系已不可胜数。最近我国科学家对干细胞的研究已走在世界前可胜数。最近我国科学家对干细胞的研究已走在世界前列列, ,特别是治疗性克隆研究已达到世界先进水平。特别是治疗性克隆研究已达到世界先进水平。4.4 4.4 动物细胞的生长特性动物细胞的生长特性 1 1、在活体内的生长特性、在活体内的生长特性 ，动物细胞，动物细胞: :分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有明显的形态学特征。明显的形态学特征。 例如：例如： 肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能；肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展

22、功能； 神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激；神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激； 红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动；红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动； 上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。 增殖增殖分化分化活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类：活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类： 第一类是第一类是能保持继续分裂能力的细胞，可以继续不断能保持继续分裂能力的细胞，可以继续不断地分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞；地分裂，如骨髓干细胞

23、、各类前体细胞；第二类细胞群是第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞，如各类高永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的细胞；度特化的细胞； 第三类是第三类是静止细胞群，即所谓的静止细胞群，即所谓的G0G0细胞，在正常情况细胞，在正常情况下，它们不分裂，也不合成下，它们不分裂，也不合成DNADNA，但在受到刺激后，则，但在受到刺激后，则重新进入细胞分裂。如人的肝脏细胞等。重新进入细胞分裂。如人的肝脏细胞等。 第一类和第三类细胞第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。在适当条件下可进行离体培养。 2 2、动物细胞的体外培养生长特性、动物细胞的体外培养生长特性离体培养的动物细胞可分为：离体培养的

24、动物细胞可分为： （1 1）贴附依赖型）贴附依赖型(anchorage-dependent) (anchorage-dependent) （2 2）非贴附依赖型）非贴附依赖型(anchorage-independent) (anchorage-independent) （3 3）兼性贴附细胞）兼性贴附细胞（1 1） 贴附型细胞贴附型细胞简称为简称为贴壁细胞贴壁细胞，包括成纤维细胞型细胞、，包括成纤维细胞型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。贴附型细胞：贴附型细胞：大多数培养细胞贴附生长，属于大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞。贴附

25、贴附: :是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。在方式。结果结果: : 基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生存和生长。存和生长。体外培养时：体外培养时：这些细胞被放到体外环境中以后这些细胞被放到体外环境中以后, ,同样需要贴同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞贴附贴附( (锚定或锚着锚定或锚着) )依赖型依赖型

26、( (性性) )细胞：细胞：唯有贴附于固相表面唯有贴附于固相表面才能生存的细胞。才能生存的细胞。细胞在细胞在体内、外体内、外的贴附方式：存在差异。的贴附方式：存在差异。体内：体内：贴附是全方位贴附是全方位, ,外形具有复杂的立体特征。外形具有复杂的立体特征。体外：体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同。般与体内时明显不同。贴附的固相表面贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培养细胞的按照培养细胞的主要形态主要形态，可分为以下几大类型：，可分为以下几大类型：成纤维细胞型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞成纤维

27、细胞型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。 名称：名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的。凡在培养中形态与成纤维细胞类似的。来源：来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮。血管内皮。形态：形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出三角形，胞质向外伸出2 23 3个长短不等的突起，个长短不等的突起，中有卵圆形核。中有卵圆形核。生长特点：生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，排列成放射状，漩涡状，并

28、不紧靠连成片， 细胞细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起。的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起。成纤维细胞型细胞成纤维细胞型细胞成纤维细胞型细胞成纤维细胞型细胞名称：名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同。仅形态上似体内，实际上不完全相同。来源：来源：来源于外胚层、内胚层细胞来源于外胚层、内胚层细胞, , 如：皮肤及其衍如：皮肤及其衍生物生物, ,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡, , 上皮性肿瘤。上皮性肿瘤。形态：形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核

29、。中有圆形核。生长特点：生长特点：易相连成片，相靠易相连成片，相靠紧密相连紧密相连成薄层成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。活动。上皮型细胞上皮型细胞上皮型细胞上皮型细胞游走型细胞游走型细胞特点特点：分散生长，细胞胞质常伸出伪足和突起，生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则，当细胞密度增大、连接成片时，形状类似于成纤维样细胞型或上皮细胞型。如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。 此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。巨噬细胞多

30、形型细胞多形型细胞特点：特点：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。如神经元和神经胶质细胞。（2 2）非贴附型细胞（也叫悬浮）非贴附型细胞（也叫悬浮型细胞）型细胞）特点：特点：细胞体外生长不贴壁，可在培细胞体外生长不贴壁，可在培养液中悬浮生长，胞体始终为球形。养液中悬浮生长，胞体始终为球形。如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。等。这类细胞一般呈圆形，密度较大，培这类细胞一般呈圆形，密度较大，培养效率高，可进行悬浮培养，易于大养效率高，可进行悬浮培养，易于大规模生产，便于过程

31、的控制。规模生产，便于过程的控制。 （3 3）兼性贴壁细胞）兼性贴壁细胞 动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929L929细胞等。细胞等。 3 3、影响细胞形态学特征的主要因素：、影响细胞形态学特征的主要因素： 血清成分、培养基的酸碱度、气相环境、培养基成血清成分、培养基的酸碱度、气相环境、培养基成分及添加成分、温度等。如分及添加成分、温度等。如HelaHela细胞原本是上皮型癌细细胞原本是上皮型癌细胞，但若在过酸或过碱的条件下培养，可呈梭形，

32、当酸胞，但若在过酸或过碱的条件下培养，可呈梭形，当酸碱度适中时又可恢复上皮型特征。碱度适中时又可恢复上皮型特征。 因此，细胞形态学仅是对培养物判断或识别的一种因此，细胞形态学仅是对培养物判断或识别的一种参考价值指标。若想明确某一培养物的确切类型，必须参考价值指标。若想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为特异性的鉴定方法。借助于更为特异性的鉴定方法。 4.5 4.5 动物细胞、组织培养的基本技术动物细胞、组织培养的基本技术 1 1、培养细胞的生长特点、培养细胞的生长特点 2 2、培养细胞的生长过程、培养细胞的生长过程 3 3、动物细胞培养的基本条件、动物细胞培养的基本条件 4 4、动物细胞培

33、养的传统方法、动物细胞培养的传统方法 5 5、原代培养技术、原代培养技术 6 6、传代培养技术、传代培养技术 7 7、贴壁技术、贴壁技术 8 8、细胞系与克隆株、细胞系与克隆株 9 9、细胞的常规检查、细胞的常规检查 1010、细胞保存技术、细胞保存技术1 1、培养细胞的生长特点、培养细胞的生长特点v 细胞在体外培养生长时其基本生物学规律与在体内时相细胞在体外培养生长时其基本生物学规律与在体内时相同。但由于生活环境条件的改变，有些方面如增殖的规律等，同。但由于生活环境条件的改变，有些方面如增殖的规律等，与体内不完全相同，而有其自身的规律。与体内不完全相同，而有其自身的规律。v 体外培养细胞重要

34、的生长特点有体外培养细胞重要的生长特点有：贴附和伸展贴附和伸展以及以及接触接触抑制抑制和和生长的密度限制生长的密度限制。 接触抑制接触抑制(contact inhibition)(contact inhibition)现象：现象： 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增

35、殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。制或密度依赖抑制现象。有限细胞系和永久细胞系有限细胞系和永久细胞系 动物细胞离体培养起始物，我们称之为动物细胞离体培养起始物，我们称之为原代培养原代培养（primary cultureprimary culture）。）。 经经继代培养后即成为继代培养后即成为有限细胞系有限细胞系(finite cell line)(finite cell line)。有限。有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的

36、时间内生存，一般经过有限的时间内生存，一般经过30503050世代后细胞将逐渐死亡。世代后细胞将逐渐死亡。 “代代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养5050代，而成年人的成纤维细胞则不能继代代，而成年人的成纤维细胞则不能继代5050次，同样是成纤维细胞，次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养3030代，而小鼠的只能培养代，而小鼠的只能培养8 8代。代。 大多数细胞系在有限

37、的代数内以不变的形式增殖，当超过有限大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期转换期(crisis)(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(in (in vitro transformation)vitro transformation)。 永久细胞系有如下特征：永久细胞系有如下特征： 细胞

38、形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前提升。永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前提。 2 2、 培养细胞的生长过程培养细胞的生长过程v 单个细胞生长过程：单个细胞生长过程：细胞周期细胞周期 动物细胞分裂周期一般为动物细胞分裂周期一般为12124848

39、小时，它不仅随细胞种属的不小时，它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。此外，培养条件如温度、此外，培养条件如温度、pHpH、培养基的成分等，也会影响分裂周期、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。的长短。v 细胞系的生长过程细胞系的生长过程3 3、动物细胞培养的基本条件、动物细胞培养的基本条件 在体外培养细胞必须要能够维持和模拟细胞在体内生存的良好环境和物质代谢过程。为此必须提供必要的营养、严格的无菌条件、适宜的pH、渗透压、培养器皿、温度和CO2等条件。显著污染的标志是培养基pH迅速改变，

40、细胞外形模糊，甚至出现飘浮的集落。 （1 1）动物细胞培养的环境要求动物细胞培养的环境要求 1 1）无污染环境）无污染环境2 2）温度）温度 温度是细胞体外生存的基本条件之一，来源不同的细温度是细胞体外生存的基本条件之一，来源不同的细胞，其最适生长温度不尽相同。胞，其最适生长温度不尽相同。 如昆虫细胞培养温度一般是如昆虫细胞培养温度一般是252528 28 哺乳动物细胞的培养温度一般是哺乳动物细胞的培养温度一般是3737。 总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳动物细胞在乳动物细胞在4545下只能存活下只能存活1 1小

41、时，但在小时，但在2525条件下仍然能慢速生长，条件下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在并维持长时间不死，甚至在44下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。然可以正常生长。液氮冻存。 3 3）pHpH 动物细胞培养适宜的动物细胞培养适宜的pHpH一般在一般在7.2-7.47.2-7.4，低于，低于6.86.8或高于或高于7.67.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。 培养细培养细胞对胞对pHpH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而

42、永久细胞系对严格，而永久细胞系对pHpH具有较强的忍耐性。具有较强的忍耐性。 4 4）气体环境及溶氧）气体环境及溶氧 一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。将导致细胞缺氧而死亡。 除了氧气供应外，还应注意培除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和养基的氧气和COCO2 2的平衡。开放培养时一般把细胞置于的平衡。开放培养时一般把细胞置于95%95%空气加空气加5%5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳混合气体环境中。5 5

43、）渗透压）渗透压动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题：动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题： 一是培养基的渗透压维持；一是培养基的渗透压维持； 二细胞体内的渗透压维持。二细胞体内的渗透压维持。 大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。透压的维持一般采用平衡盐溶液。 （2 2）动物细胞培养的营养要求）动物细胞培养的营养要求1 1）天然培养基）天然培养基 直接采用取自动物体液或从组织中提

44、取的成分作培养液，主要有血直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。清、组织提取液、鸡胚汁等。 血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。 使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基

45、合用，能使细胞硕利增殖生长。合用，能使细胞硕利增殖生长。 血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。质主要是白蛋白和球蛋白。2 2）合成培养基）合成培养基目前用于动物细胞培养的合成培养基种类很多，一般均包含目前用于动物细胞培养的合成培养基种类很多，一般均包含氨基酸、氨基酸、维生素、糖类、无机离子维生素、糖类、无机离子和其它辅助成分（和其它辅助成分（激素、生长因子激素、生长因子）。）。 尽管各种合成培养基给细胞培养带来极大方便，但许多实验表明，尽管各种合成培养基给细胞培养带来极大方便，但许多实验表明

46、，单纯使用合成培养基细胞的贴壁、增殖效果常常不理想。因此，在使用单纯使用合成培养基细胞的贴壁、增殖效果常常不理想。因此，在使用时通常仍然需要加入一定量的动物血清，常用的动物血清有小牛血清、时通常仍然需要加入一定量的动物血清，常用的动物血清有小牛血清、鸡血清等。鸡血清等。 常用的人工培养基常用的人工培养基MEMMEM，DMEMDMEM，RPMI-1640RPMI-16403 3）无血清培养基）无血清培养基 动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分至今尚未搞清楚。血清对细胞

47、生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。限，成本高，限制了它的大量使用。 无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。效因子，激素等。1 1、平衡盐溶液平衡盐溶液（BSSBSS）2 2、消化液消化液：胰蛋白酶液、：胰蛋白酶液、NaNa2 2- - EDTAEDTA液、胶原蛋白酶液液、胶原蛋白酶液3 3、pHpH调整液调整液：NaHCONaHCO3 3溶液、溶液、10%10%醋酸

48、溶液、醋酸溶液、HEPEsHEPEs液液4 4、抗菌素液抗菌素液：青霉素、链霉素（双抗）液、卡那霉素液、：青霉素、链霉素（双抗）液、卡那霉素液、制霉菌素液制霉菌素液5 5、肝素抗凝剂肝素抗凝剂6 6、200 200 mmolmmol/L /L 谷氨酰胺谷氨酰胺4) 4) 细胞培养溶液细胞培养溶液（3 3） 培养工具培养工具 根据不同性质的培养可采用不同的培养器皿:固体单层培养可生长在塑料或玻璃瓶壁上,半固体培养可采用胶原或琼脂等凝胶培养,悬浮培养则可用培养基直接培养。我们现在通常使用优质中性玻璃制成的长方形玻璃培养瓶,规格有100mL、25mL和15mL等。有时还用扁圆形的卡氏瓶。它们的优点是

49、可以清洗、消毒、反复使用。细胞培养所用的器皿必须干净,器械的清洗是十分重要的,它直接影响到细胞培养的成败。 （1 1）悬滴培养法）悬滴培养法（2 2）旋转管培养法）旋转管培养法（3 3）灌注小室培养法）灌注小室培养法（4 4）卡氏瓶培养法）卡氏瓶培养法（5 5）培养板培养法）培养板培养法4 4、 动物细胞培养的传统方法动物细胞培养的传统方法 （1）悬滴培养法）悬滴培养法(drop culture)最简单、最原始的培最简单、最原始的培养法养法 悬滴培养法缺点：细胞生长空间狭小气体不足，不能持悬滴培养法缺点：细胞生长空间狭小气体不足，不能持续长时间生长培养基易液化，需要常更新培养基凹玻片折光，续长

50、时间生长培养基易液化，需要常更新培养基凹玻片折光，不便于观察。不便于观察。（2 2）旋转管培养法）旋转管培养法( (rotate tube culture) ) 组织块或细胞可交替地接触营养液和空气，利于细胞生长；组织块或细胞可交替地接触营养液和空气，利于细胞生长； 培养管缓慢转动，使整个管内壁全部长满细胞，提高了细胞产培养管缓慢转动，使整个管内壁全部长满细胞，提高了细胞产量，适于较大量的组织培养和各种长期传代细胞量，适于较大量的组织培养和各种长期传代细胞组织块或细胞可交替的培组织块或细胞可交替的培养。养。 缺点：缺点：不易在显微镜下观察。不易在显微镜下观察。（3 3）灌注小室培养法）灌注小室

51、培养法(dabble booth cultivation) 为大规模培养系统提供了参考原理。为大规模培养系统提供了参考原理。（4）卡氏瓶培养法）卡氏瓶培养法 卡氏瓶卡氏瓶(carlsbergs flask)（如下图）：（如下图）：将组织块剪碎，将组织块剪碎，BSS漂洗。漂洗。转移到另一只培养皿，在解剖显微镜下去掉不需要的组织如转移到另一只培养皿，在解剖显微镜下去掉不需要的组织如脂肪、坏死组织等。将组织块切成脂肪、坏死组织等。将组织块切成1mm3小块。小块。用预先润湿的滴管转移到消毒离心管，静置使组织小块下沉，用预先润湿的滴管转移到消毒离心管，静置使组织小块下沉，吸去上清。以新鲜吸去上清。以新鲜

52、BSS漂洗。重复漂洗。重复23次。次。转移到培养瓶（每个转移到培养瓶（每个25ml25ml的培养瓶可放置的培养瓶可放置20302030块组织小块），吸去液体。块组织小块），吸去液体。加入加入1ml1ml生长培养液，轻斜摆动培养皿，使组织小块均匀分布。盖好瓶盖，生长培养液，轻斜摆动培养皿，使组织小块均匀分布。盖好瓶盖，36.536.5培养培养1824h1824h。待组织块粘附瓶壁后待组织块粘附瓶壁后3535天，加入天，加入5ml5ml培养液；然后每周更新培养液一次。培养液；然后每周更新培养液一次。培养培养3535周，细胞不断增长，肉眼或低倍镜下观察可见围绕组织周围生长周，细胞不断增长，肉眼或低倍

53、镜下观察可见围绕组织周围生长犹如日晕，称犹如日晕，称“生长晕生长晕”。取出中央组织块，用预先湿润的滴管移到另一新的培养瓶。重复取出中央组织块，用预先湿润的滴管移到另一新的培养瓶。重复 操操作。作。在原生长晕培养瓶内换入新鲜培养液。待生长晕细胞扩展至约在原生长晕培养瓶内换入新鲜培养液。待生长晕细胞扩展至约50%50%培养瓶培养瓶底表面时，进行细胞培养。底表面时，进行细胞培养。5 5、原代培养技术、原代培养技术一般经过组织获得、组织消化、接种、培养、传代等过程。动物细胞培养的基本步骤包括：先对动物体的器官组织进行切割、酶解消化，分离出单个细胞，再将单个细胞转入含有葡萄糖、氨基酸和无机盐的动物细胞培

54、养细胞培养液中，在二氧化碳培养箱中温育培养，在将原代细胞传代，扩大进行继代培养。（1 1）组织块培养）组织块培养步骤如下：1、培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作. 2、点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等 。3、取材：（2 2） 组织消化培养组织消化培养6 6、传代培养技术、传代培养技术传代的理想时期：传代的理想时期：对数生长期，细胞对数生长期，细胞8090%或刚刚全部汇合。或刚刚全部汇合。方法：方法：消化：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶与消化：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶与EDTA混合液，盖满瓶底，作用混合液，盖满瓶底，作用25min；检查：如细胞间隙变大，细胞质回缩，则

55、终止消化。检查：如细胞间隙变大，细胞质回缩，则终止消化。终止消化：吸出消化液；加入终止消化：吸出消化液；加入Hanks液，轻轻转动，洗去残留的消化液。液，轻轻转动，洗去残留的消化液。如单用胰蛋白酶，可直接加入培养液。如单用胰蛋白酶，可直接加入培养液。细胞计数：用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落，制成悬液，计数并记录其细胞计数：用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落，制成悬液，计数并记录其浓度；浓度；重新稀释接种培养。重新稀释接种培养。根据细胞特点，掌握细胞消化时间和选择消化方法。根据细胞特点，掌握细胞消化时间和选择消化方法。7 7、贴壁技术、贴壁技术贴壁培养的材料与系统贴壁培养的材料与系统（1 1）主要材

56、料：）主要材料：a.a. 玻璃玻璃b.b. 塑料塑料c.c. 金属金属d.d. 微载体微载体（2 2）系统：）系统：e.e. 微载体培养系统微载体培养系统f.f. 多孔载体培养系统多孔载体培养系统g.g. 中空纤维培养系统中空纤维培养系统 微载体培养法微载体培养法( (microcarrier culture)载体载体：DEAE-DEAE-交联葡聚糖微粒、交联葡聚糖微粒、DEAE-DEAE-纤维素、聚苯乙烯、聚丙纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、无机玻璃基质微载体等。烯酰胺、无机玻璃基质微载体等。微载体培养系统培养细胞步骤：微载体培养系统培养细胞步骤：1 1、选择合适的微载体类型、选择合适的微载体

57、类型获得最大量的细胞，以微载体能全部悬浮在获得最大量的细胞，以微载体能全部悬浮在培养液内为最好。培养液内为最好。2 2、浸泡水化及消毒、浸泡水化及消毒 用无用无CaCa2+2+、MgMg2+2+离子的磷酸缓冲液浸泡离子的磷酸缓冲液浸泡3h3h以上。以上。3 3、接种（根据细胞类型决定接种浓度）、接种（根据细胞类型决定接种浓度）4 4、培养观察与细胞计数、培养观察与细胞计数5 5、消化、消化6 6、分离细胞或传代培养、分离细胞或传代培养 多孔载体培养多孔载体培养( (porosity carrier culture)优点：增加细胞固定化稳定性，比表面积大，保证细胞充分的生优点：增加细胞固定化稳定

58、性，比表面积大，保证细胞充分的生长空间，细胞生长在载体内部，免受机械损伤。长空间，细胞生长在载体内部，免受机械损伤。多孔载体被证明是用于大规模高密度细胞培养的优秀细胞生长多孔载体被证明是用于大规模高密度细胞培养的优秀细胞生长支持物，具有逐步取代传统的实心微载体的趋势。支持物，具有逐步取代传统的实心微载体的趋势。 中空纤维细胞培养法中空纤维细胞培养法 ( (hollow fiber cell culture)模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管毛细血管”中空纤维来供给细胞生长的营养等条件。中空纤维来供给细胞生长的营养等条件。细胞向三维空间生长

59、繁殖，形成类似组织的多层细胞群体，细胞细胞向三维空间生长繁殖，形成类似组织的多层细胞群体，细胞密度可达密度可达10109 9个个/ml /ml 。 适用于细胞代谢产物和分泌物的生产。适用于细胞代谢产物和分泌物的生产。8 8、细胞系与细胞株（、细胞系与细胞株（cell line and clonecell line and clone）（1 1）细胞系的建立）细胞系的建立原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂，培养初期，生长的原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂，培养初期，生长的细胞类型多种多样随培养时间延长：一些细胞退化、死亡；另一些细胞类型多种多样随培养时间延长：一些细胞退化、死亡；另

60、一些细胞适应环境而生长繁殖培养物逐步变均匀。细胞适应环境而生长繁殖培养物逐步变均匀。传代培养意义传代培养意义：不仅在于维持细胞不断地生长，而且使培养物逐：不仅在于维持细胞不断地生长，而且使培养物逐步演变为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即步演变为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细胞细胞系。系。细胞系细胞系：指从原代培养物经传代培养后得来的一群特征专一、类：指从原代培养物经传代培养后得来的一群特征专一、类型均匀的细胞，可以长期连续传代。型均匀的细胞，可以长期连续传代。限定细胞系（有限细胞系）：限定细胞系（有限细胞系）：寿命有限，一般为寿命有限，一般为20802080代。