单孝全 形态分析、分级分析和土壤中重金属元素的生物可给性研究

1、第8章 形态分析、分级分析和土壤中重金属元素的生物可给性研究单孝全、张淑贞 中国科学院生态环境研究中心81形态分析与分级分析形态分析与分级分析的定义传统分析化学只测定样品中待测元素的总量或总浓度。但是生物分析与毒性研究证明，环境中某个元素的生物可给性或在生物体中的积累能力或对生物的毒性与该元素在环境中存在的物理形态及化学形态密切相关。根据国际纯粹和应用化学协会(International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC)的定义，形态分析speciation analysis是指表征和测定某个元素在生物样品或环境中存在的不同的化学形态和物理形

2、态的过程1。环境中某个元素的分级分析fractionation是指根据其物理性质如颗粒大小、溶解度或化学性质如键合，反响活性进行分级的过程2。 形态分析的分类形态分析可以分为物理形态与化学形态两大类。化学形态又可以分为筛选形态、分组形态、分配形态与个体形态表8-1。表8-1 形态分析的根本类型形态分析类型应用领域说 明实 例物理形态环境污染分析大气、水、土壤从不同的化学过程与生化过程的角度考虑，这种形态分析是极其重要的。土壤与沉积物用分级萃取别离以后不同级分中的痕量金属的分析。化学形态筛选形态环境污染分析，食品污染分析，生态毒理学。这是形态分析中最简单的，只测定一种特定的形态。海水、沉积物与组

3、织中三丁基锡的测定。分组形态环境污染分析，食品污染分析，生态毒理学。某组化合物或以不同化合物或以不同氧化态存在的某些元素的测定。不同形态汞元素汞、无机汞与有机汞的测定。分配形态环境污染分析与生态毒理学。这类形态分析常与生物样品的分析相关联。血清与血细胞中痕量金属的测定。个体形态分析环境污染分析，食品污染分析，生态毒理学。形态分析中最困难的。分级与别离发挥特殊的作用。分子、络合物、电子或原子结构的表征与测定。(引自文献1)。 实验操作定义的分级提取或萃取实验操作定义的分级提取或萃取法常用在土壤和沉积物的物理形态分析中，也用于水和大气颗粒物的物理形态分析中。在土壤和沉积物中元素可以1存在于颗粒物外

4、表的离子交换位；2吸附在颗粒物外表；3以沉淀物的形式存在；4以共沉淀形式存在，特别是与无定形铁和锰氧化物的形式存在；5与有机分子形成络合物；6被包裹态； 7进入矿物的晶格3。现将常用的分级提取方法列在表8-2 4。代表性的物理形态分级提取形态方法是Tiesser等人提出的 5。按照这个方法沉积物或土壤中金属元素的形态分析可以分为可交换态、碳酸盐结合态、铁-锰氧化物结合态、有机物结合态与残渣态。该方法已经过较长时间的研究和严格测试，已被广泛应用于土壤和底泥中的重金属物理形态分析。表8-2 常用的分级提取方法提取剂级分参考文献H2ONH4Ac/HAcNH2H2O2/HNO3N2N4HClHClO4

5、水溶态交换态氧化态硫化物和氧化物结合态铁结合态非硅酸盐残渣态6MgCl2NaAc/HAcNH2H2O2/HNO3/NH4AcHF/HClO4交换态碳酸盐结合态氧化物结合态有机物结合态残渣态5KNO3NaOHEDTAHNO3可交换态吸附态有机质结合态碳酸盐和硫化物结合态7H2OKNO3Na4P2O7EDTANH23Na-citrate/NaHCO3/Na2S2O4HNO3HNO3/H2O2水溶态 交换态有机物结合态碳酸盐、无定型铁结合态氧化锰结合态晶型铁氧化物结合态硫化物结合态残渣态8HCO3- S2O42-NaOHHClHot NaOH有机物和胡敏酸结合态 局部胡敏酸结合态碳酸盐、铁氧化物结合

6、态, 硫化物结合态 局部高岭土结合态 (局部), 硫化物结合态9Mg(NO3)2NaOClNH2O4Ac(NH4)2OX抗坏血酸/草酸缓冲溶液HCl/HF/HNO3交换态碳酸盐锰氧化物结合态无定型铁氧化物结合态 硫化物和有机物结合态 残渣态10NH4AcNaAc/HAcNH2OHCl/HNO3草酸缓冲溶液H2O2/HNO3/NH4AcHNO3交换态碳酸盐锰氧化物结合态无定型铁氧化物结合态硫化物和有机物结合态残渣态11NH4AcNaAc/HAcNH24Ac(NH4)2EDTA(NH4)2Ox抗坏血酸/草酸缓冲溶液HF/HClO4/HNO3交换态(非特性吸附)交换态(特性吸附)锰氧化物结合态有机物

7、结合态无定型铁氧化物结合态铁氧化物结合态 (晶型)残渣态12H2ONH4AcC6H6/CH3OHC6H6/CH3OH/KOHHClHFHCl/HClO4/HNO3水溶态交换态可溶性有机物结合态可溶性有机物结合态(胡敏酸和富里酸)矿物结合态 (易溶出的)矿物结合态 (难溶出的)非可溶性有机物结合态131992年欧共体标准物质局European Community Bureau of Reference,简称 BCR组织了35个欧洲实验室开始致力于土壤和沉积物中金属元素的物理形态分析方法的研究。他们提出了三步提取法简称BCR法，14。B1：水溶态、交换态及碳酸盐结合态；B2：铁锰氧化物结合态；B3

8、：有机物及硫化物结合态。这种方法和Tessier等人提出的方法有很大的相似之处。实验操作定义的分级萃取方法存在两个根本性问题，即所用萃取剂缺乏选择性，萃取过程中痕量元素的再吸附及再分配。但就是否存在这些问题与如何证明这些问题的存在，一直是有争议的。争论的焦点是沉积物与土壤是经过长期的风化过程形成的，多种地球化学相共存，痕量金属在不同的地球化学相中已到达平衡。因此，用物理化学性质与真实土壤性质完全不同的模拟土壤难以证明上述问题的存在 15，16。此外，样品的采集和预处理过程也会带来形态的变化。按土壤中主要组分比，采用天然单矿物赤铁矿、方解石、软锰矿、伊利石、蒙脱石及从土壤中提取的腐殖酸合成模拟土

9、壤。由于这些单矿物及腐殖酸均来自土壤，其物理化学性质与真实土壤非常类似。较有说服力地证明了操作定义的形态分析中存在萃取剂的非选择性，萃取过程中痕量元素的再吸附与再分配问题 17-19，从而较好地解决了在这个问题上的长期争论20-24。天然水中痕量金属的物理形态可以按照其粒径大小分类表8-325。在研究水中金属的物理形态中，胶体颗粒物占有特殊的重要性。因为各种不同的污染物会与胶体颗粒物发生不同的物理化学反响。这样，即使在地壳深处，污染物也会随着地下水的流动向远距离传输 26，27。为区分水中金属不同粒径的形态，常常应用不同孔径的膜，截留分子量为1000将水样过滤。先用膜将颗粒物除去，然后再用膜过

10、滤，那么能通过膜而不能通过膜的级分为粒径较大的胶体结合局部。通过膜过滤的局部，接着再用截留分子量为1000的膜过滤。能够通过膜而不能通过截留分子量1000的局部为粒径较小的胶体局部，而能通过截留分子量为1000道尔顿的膜的局部可视为游离金属离子与真正可溶局部 28。当然这种胶体分级是不严格的。表8-3 水中痕量金属物理形态的粒径分级 (引自文献25)物理化学形态例 子大约粒径nm水合金属离子Cu(H2O) 2+1无机络合物Cu(H2O)4Cl21有机络合物Cu-富里酸2-5无机胶体Cu2+-Fe2O310-200有机胶体Cu2+-腐殖酸10-200颗粒物颗粒物450 金属有机化合物分析 在化学

11、形态分析中应当特别提出金属有机化合物的分析。金属有机化合物是指至少有一个碳原子与一个金属原子之间形成一个共价键。根据这个定义将金属与氮、氧和磷生成的金属配合物或其它类型金属有机配合物不再包含在内。同样将与烷基和芳基形成共价键化合物，非金属砷与硒也排除在外。水环境中最重要的金属有机化合物的来源是持久性有害金属有机化合物直接进入环境，如水中金属锡化合物。另一种重要来源是生物体与环境中某些金属离子反响生成金属有机化合物，最著名的例子就是自然界中汞的烷基化29。一般而言，环境样品中金属有机化合物的测定首先需要用萃取手段将金属有机化合物别离。这种萃取别离必须满足两个互相矛盾的条件。一是应尽量防止损失与有

12、适宜的回收率，二是不能导致待测金属有机化合物结构的破坏30。很多因素可以影响样品中金属有机化合物的萃取。以组织中金属有机锡的萃取为例，有机溶剂、酸的性质与浓度、络合剂的存在与否均会影响萃取结果 31。超临界流体萃取的技术不能直接应用于水相中金属有机化合物的萃取。但当与固体萃取技术相结合，然后用超临界流体技术萃取金属有机衍生物那么能成功。到目前为止，已经开展了两种固相萃取技术，即固相萃取膜上金属氯化有机锡的格林试剂衍生 32与水相中用NaEt4B衍生然后用固相萃取 33。Bayona 34应用超临界流体色谱萃取环境样品中有机金属锡、汞、铅与砷化合物。原那么上，在测定金属有机化合物时应尽量防止衍生

13、。但为了增加金属有机化合物的挥发性，也难免采用衍生技术 35。最有效的金属有机化合物测定技术是仪器联用技术，即将具有高别离能力的色谱技术与具有高灵敏度的原子光质谱技术结合起来。这些联用技术包括LC-，GC-，SFC-，CE-与AA，ICP-AES，ICP-MS 的联用1，36-38。联用技术中最为关键的是接口，它在很大程度上决定方法的灵敏度。、游离金属离子的分析测定土壤中金属元素的总量和形态分布决定了元素的生物可给性。但是最为主要的是土壤间隙水中游离金属离子(free metal ion, FMI)的浓度。有关游离金属离子的浓度的获得主要有以下三种方法：1金属离子MZ+m等来计算得到。常用的模

14、型包括GEOCHEM, SOILCHEM,HYDRAQL,ECOSAT和MINTEQA2。模式计算基于这样一个假设，即各相之间已经到达热力学平衡，存在于土壤-土壤溶液之间的一些反响是非常慢的和不可逆的。因此，这些模型使用的不当会带来错误的结论。最近报道的道纳膜平衡技术39-41因其适用范围广，能很好地评价土壤中金属元素的生物可给性，因而得到了广泛的应用。道纳膜平衡技术包括一个连续的流动体系如图 8-1所示。供体和受体两边都连续充满溶液，供体一边的溶液有游离金属离子、无机与有机金属配合物，受体一边只包括无机离子和无机配合物。它们被中间的带负电的离子交换膜隔开，通过膜的阳离子交换经过一定时间后到达

15、平衡。我们称这种平衡为道纳膜平衡。在到达平衡时可以用常用的元素分析方法测得受体一边的游离离子浓度。从而获得土壤溶液中游离离子的浓度。土柱：土壤/土壤溶液=80/1g/L带负电的离子交换膜： meq/g -0.17 mm外表积： 6.16 cm2 A: 受体 D:供体 蠕动泵流速：2.9 ml/min图 8-1 道纳膜平衡体系 生物体中的金属有机化合物、植物螯合肽和金属硫蛋白的分析在生物体内，金属与非金属往往与氨基酸、脂、蛋白质与多糖结合。这些生物大分子是不挥发性的 42。这些生物大分子可以粗分为以下类型36：无机非金属元素砷、硒与锑被植物或动物代谢为有机非金属化合物。经典的例子是海洋生物中存在

16、含砷有机化合物，富硒环境中存在的硒氨基酸、硒糖与硒蛋白；金属胁迫条件下在植物体内与动物体内合成的与单糖或多糖结合的金属螯合肽。最典型是植物中合成富含胱氨酸的植物螯合肽phytochelatins；与转运蛋白质与酶结合的金属配合物，如动物体内诱导产生的金属硫蛋白metallothioneins；与其它生物大分子多糖、叶绿素、糖蛋白结合的配合物。其中某些配合物能与聚羧基基团牢固结合而具有热稳定性。金属硫蛋白是动物肾脏与肝脏中因摄入有毒重金属而诱导产生的一种蛋白质。金属硫蛋白含约33%胱氨酸，主要异构体有两个，分子量在10000左右，可以用高效液相色谱别离 43。大量使用农用稀土，一局部稀土会被植物

17、吸收而与植物体内的蛋白结合 44，45。中国低硒带大豆中的硒主要以硒蛋白、壳多糖与多糖的形成存在 46。一般而言，生物体内的金属有机化合物、肽和蛋白质是不能直接测定的，必须进行生物样品的预处理，包括从细胞中将所需形态别离出来。亚细胞分级步骤如图8-1-所示47：器官 + 缓冲液匀浆4C离心10 min，700g上清液核上清液线粒体细胞溶胶微粒体离心25 min，30000g上清液溶酶体离心10 min，9000g离心40 min，105000g图8-2 亚细胞分级步骤生物样品经过预处理以后，可以用不同的色谱技术将所需测定的个体形态别离出来。生物大分子中结合的金属元素可以用元素分析仪器测定。仪器

18、联用技术可以同时完成个体形态的别离和元素的测定，如HPLC-ICPMS。与原子吸收光谱和发射光谱测定技术相比，ICP-MS作为HPLC的检测器其优点是能同时多元素测定和高灵敏度。土壤外表的形态分析土壤外表金属元素的形态分析主要指元素在土壤颗粒物与土壤溶液界面上的结合位点的键合形式。一些现代的光谱分析技术的应用在很大程度上推动了土壤外表形态分析的创立和进步。这些技术包括：傅立叶变换红外光谱FTIR、核磁共振光谱、X-射线吸收光谱和扫描探针48。这里特别要提到的是X-射线吸收光谱。利用同步辐射产生的X-射线吸收光谱可以在分子水平上研究元素的形态，包括元素的价态、与其键合元素的种类和键长等。由于土壤

19、外表形态分析的研究还在起步阶段，没有形成一个很完整的方法学。因此，下面只就我们关心的对环境研究有重要意义的一些研究动态做简单的介绍。土壤中砷主要以AsIII亚砷酸盐和AsV砷酸盐的形式存在。土壤中的AsIII可以被氧化成AsV。在复原性土壤条件下，AsV是主要的存在形态。针铁矿-FeOOH是土壤中最主要的铁氧化物。应用透射傅立叶变换红外光谱T-FTIR和漫反射傅立叶变换红外光谱ATR-FTIR研究了亚砷酸盐和砷酸盐在针铁矿-FeOOH上的键合结构49。在针铁矿外表有3个对应于单配位、双配位和三配位的OH能带。大局部砷酸盐和亚砷酸盐阴离子可以取代两个单配位体的外表OH基团A型，生成Fe-O-As

20、O(OH)-O-Fe和Fe-O-As(OH)-O-Fe桥式配合物。但是它们与双配位体C型和三配位体B型外表OH基团的作用是明显不同的。AsIII主要与C型OH基团反响，AsV主要与B型OH基团反响。这些反响可能是由于氢键或化学键。图8-349显示不同pH条件下用D2O处理后的针铁矿的T-FTIR扫描图。pH对真空条件下A-、B- 和C-型DO的吸收谱带的影响不大。参加砷酸盐和亚砷酸盐使2548 cm-1谱带的强度减低图8-3 b和c。 当砷的浓度达200 mol/g针铁矿时，AsIII和AsV在2548 cm-1的峰均不能再检出。这说明AsIII和AsV与A-OH基团发生很强的反响。对AsV处

21、理的样品图8-3 b，在2686 cm-1处出现一新峰。随着AsV外表覆盖度的增加，2701 cm-1谱带强度降低，2686 cm-1谱带强度增加。在200 mol AsV/g针铁矿处理时，在2713 cm-1处出现一个新谱带。假设AsV到达400 mol/g针铁矿时，原来的2701 cm-1谱带就不明显了，可能分裂为2686 cm-1的主谱带和2713 cm-1的次谱带。图8-3 氘处理后的针铁矿T-FTIR吸收光谱图。(a) 不同pH的纯针铁矿；(b) As(V)处理过的针铁矿 (c)As(III)处理过的针铁矿。引自文献 49。X-射线吸收精细光谱EXAFS证明双配位体双核络合是砷酸盐在

22、针铁矿外表的主要键合机理50-52。 基于压力跃升松弛研究并经EXAFS证实，随着外表覆盖度的不同，砷酸盐在针铁矿外表可以生成三种不同类型的外表配合物图8-450，53。Frendorf等人 50指出当外表覆盖度低时，单配位体配合物RAs-Fe3.59 是主要的。当外表覆盖度高时，双配位体单核配合物是主要的RAs-Fe。当外表覆盖度接近单层容量时，双配位体双核配合物是主要的RAs-Fe。当外表覆盖度非常低时，H2AsO4-与外表OH基团发生交换反响，生成单配位体配合物。当外表覆盖度高时，第二个OH基团交换反响就会发生，生成双配位体外表配合物54。图8-4 针铁矿上砷酸盐吸附机制示意图 引自文献

23、 53关于砷酸盐是否会生成桥式结构配合物的问题，人们曾有过争论。Waychunas等人51和Fendorf等人50认为AsV在针铁矿和水合铁ferrihydrite外表生成桥式配合物。但当外表覆盖度很低时，在结晶针铁矿外表生成单配位体配合物。对无定形铁氧化物而言，随着砷酸盐覆盖度的增加，其单配位体配合物减少。对水合铁而言，在1-7周培养期间内单配位体配合物并没有观察到时间效应aging effect。Manceau51对Waychunas等人50的上述观察结果提出质疑。Waychunas等人在反驳Manceau时提出的质疑时，认为角共享双配位体砷酸盐配合物RAs-Fe是普遍存在的。OReill

24、y 等人53应用EXAFS揭示了针铁矿外表上被吸附的砷周围有两层原子壳层。在最里层的原子壳是O原子，向外第二层是Fe原子，As-Fe键长为3.30 。如果将样品培养不同的时间段，其分子环境并不发生变化。在大局部地表水与地下水中UVI生成可溶性化合物，而UIV那么生成不溶性沥青铀矿UO2c。X-射线荧光与X-射线吸收光谱测定的结果证明，在土壤颗粒中85U以UVI的形式存在55，56。有机物涂层可以改变土壤外表特性，从而影响其吸附机理。有机物涂层也可以掩盖矿物外表，防止金属吸附。镍在高岭土外表的吸附在开始阶段会随着高岭土涂层腐殖酸HA的增加而增加，并且镍的吸附特性在一个较长的时间段内没有到达平衡。

25、EXAFS分析证明，当高岭土外表没有HA涂层时，就会在其外表生成Ni-Al层状双氢氧化物LDH沉淀。HA本身可以与Ni生成内层配合物与两个碳原子，平均径向距离2.85 。假设高岭土外表有1重量HA涂层，那么在高岭土外表生成Ni-Al LDH沉淀。假设高岭土外表有5重量涂层，外表沉淀生成的速度就大为减低，而且其沉淀结构类似于Ni(OH)2(s)。 Ni(OH)2与Ni-Al LDH沉淀不同，不能防止质子溶解57。这些实验结果对早期的发现提出质疑。过去认为Ni以及其它第一排过渡金属生成稳定的外表配合物是固定环境中有毒金属的重要途径。图8-5 针铁矿-腐殖酸盐络合物上Cu(II)的可能构象示意图：

26、Cu(II)在针铁矿位点上的内配合物以及A型和B型三元配合物引自文献58。应用EXAFS对CuII-腐殖酸/针铁矿或CuII-腐殖酸糊状物作Cu K边测定，铜以扭曲的八面体结构存在，含有四个短的平伏键1.94-1.97 ，两个长的与氧结合的轴向键。当参加的腐殖酸从0增加到28 g/kg针铁矿时，轴向Cu-O键减小到2.24 0.03 0.02 0.03 相应的Cu-O的轴向键长。 Cu-O轴向键长的变短是由于基团场分裂能量的降低所致。如果腐殖酸基团代替Cu(II)配位壳层中平伏水分子，基团场强度就会变弱。当吸收的腐殖酸达88 g/kg针铁矿时，在3.17-3.20 间就能观察到第二铁壳层。这就

27、意味着CuII与针铁矿和腐殖酸平均键合。针铁矿-腐殖酸配合物的Cu(II) EANES谱难以用针铁矿或腐殖酸的CuII谱拟合。当腐殖酸浓度介于216-236 g/kg针铁矿时，第二铁壳层就不能检出。Cu-O轴向键长2.32 0.02 和XANES谱证明CuII只与腐殖酸结合。XANES和EXAFS数据认为在吸收腐殖酸低时，CuII与无机针铁矿和有机腐殖酸平均键合，生成A型三元配合物。在吸收腐殖酸高时，生成B型配合物图8-558。 植物根外表的形态分析 某些植物根的外表可以积累较高浓度的金属或类金属。 金属或类金属可以沉积在根外表或在根细胞壁或泡浆中。这两种不同的沉积方式就是某些植物根外解毒与内

28、解毒机制。某些植物根系外表可以形成一薄层铁膜。在Typha latifolia根外表生成的铁膜是无定型氢氧化物。在Dryza satire L. 生成的铁膜是r-FeOOH和-FeOOH。在Phragmites australis上的铁膜是FeCO3 59。但是，Hansel等人60那么认为在湿地植物Phalaris arundinacea 的根外表会生成连续的沉淀物铁膜， 铁膜含约63水合铁，32针铁矿与5菱铁矿。虽然，Pb在根外表与Fe同时存在，但Pb与有机基团络合。相反，Mn和Zn在根外表以分散的菱锰矿/水锌矿结核存在。这说明土壤/根外表看来是一个很复杂的生物化学环境，同时含有复原性质和

29、氧化性质的矿物。正因为如此，含水铁氧化物、微生物生物膜和金属碳酸盐将影响根际环境中金属的生物可利用性与可移动性。 湿地植物P. arundinacea和T. latifolia的铁膜主要是水合铁ferrihydrite， 少量针铁矿与微量菱铁矿。但T. latifolia与P. arundinacea的铁膜有所不同。T. latifolia的铁膜含有大量的纤铁矿lepidocrocite和较多的结晶形矿物。针铁矿与纤铁矿共存这一点就足以证明植物根外表的微环境的化学性质是多样性的。 砷以两种吸附态存在，82是砷酸盐，18是亚砷酸盐-铁氢氧化物配合物，且砷与铁呈时空相关性。在植物根外表形成一个连续

30、的铁氢氧化物配合物环时，砷那么在根的外部或内部是以分散的状态存在的。与根外表结合的砷往往与铁富集区相对应，这可能是铁的非均匀性和砷的优势吸收反响的直接结果61。由于土壤的酸化，土壤中的铝会溶解而成为Al3+。Al3+的毒性是导致某些农作物减产的主要原因。但对于某些耐Al3+植物而言，有机酸可以有效地消除Al3+的毒性。其解毒的机制分为植物根外部解毒与植物根内部解毒机制。植物根外部解毒机制是指某些植物根在Al3+胁迫条件下，会分泌出低分子量有机酸。柠檬酸根、草酸根是植物根分泌的常见的有机酸阴离子。这些有机酸阴离子可以与Al3+生成配合物，从而防止Al3+对植物根的毒害作用。植物对Al3+的内解毒

31、机制是指某些耐Al3+植物可以在草本植物的地上局部积累很高浓度的铝，不呈现任何中毒病症。其内解毒机制是有机酸与铝生成1:1的配合物，从而极大地减少了Al3+对细胞质的毒性，防止Al3+与植物敏感细胞生成配合物62。Eu3+可以与羧基基团生成单配位、双配位和三配位体的配合物。核磁共振和红外光谱证明羧基是Eu3+与水葫芦根键合的主要基团。EXAFS光谱证明Eu3+与10-11个氧原子配位，其键距为2.44 。水葫芦根吸收Eu3+是在其根外表通过羧基基团而实现的。双羧基基团配位配合物的Eu-O键长比与水配位的Eu-O键长要长。对水葫芦而言，其Eu-O键长要比Eu(NO3)36H2O 的Eu-O键长要

32、短。这一点反映与Eu3+ 配位的羧基基团较少，配位的水分子那么较多63。因含砷废水的灌溉或者含砷杀毒剂的使用，会使砷进入水稻Oryza satira。在水中砷可以以亚砷酸盐、砷酸盐、一甲基砷酸和二甲基砷酸的形式存在。亚砷酸盐的吸收是一个主动过程，其吸收速度与砷酸盐吸收过程相似。当磷酸盐存在时，砷酸盐的吸收被强烈抑制。但亚砷酸盐的吸收却不受磷酸盐影响。这说明砷酸盐和亚砷酸盐的吸收机制是不相同的64。印第安那芥菜Brassica Juncea L.是一类生物量大，但能积累较大量镉的农作物。其积累机理是在根中可以快速积累植物螯合肽phytochelatins，其结构可能是Cd-S4配合物。但镉在木质

33、部伤流液中运输时，主要是与氧或氮配位65。超积累植物中元素的存在形态由于植物修复技术是治理被金属污染土壤的最有前途的方法，有关超积累植物的根底研究与示范工程受到极大关注。有关金属元素或类金属元素在超积累植物中的积累机制和存在形态的研究都取得很大进步。本章将简要讨论超积累植物中金属元素或类金属元素的存在形态。极大多数超积累植物是镍超积累植物。超积累植物Alyssum lesbiaeum中镍与组氨酸的咪唑氮的键长是1.98 ，镍与其他5个原子的键长是2.05 ，与外壳层碳和氮原子的键长是2.93 和4.24 。此外，镍没有与硫配位。如果镍与硫配位，那么Ni-S键长2.25 应当能够检出。这一点非常

34、重要，因为某些人认为超积累植物之所以能耐高浓度的重金属，是由于在超积累植物中诱导产生了富含胱氨酸的低分子量植物螯合肽66。EXAFS和EXAFS说明了锌在超积累植物Arabidopsis halleri和非超积累植物Arabidopsis lyrata的亚种potraea中的化学形态67。水培植物和天然生长在被污染土壤的A. halleri中锌的存在形态是与植物的生长地或与锌的暴露无关。在植物的气生局部，主要是以八面配位体存在的，锌与苹果酸、羧基或羟基基团络合。如果A. halleri在水培条件下生长，在植物根中只能检出磷酸锌。如果A. halleri生长在被锌污染的土壤中，锌可以苹果酸锌，柠

35、檬酸锌和磷酸锌存在。在其亚种petraea的气生局部和根中均能检出磷酸锌。Pteris vittata是近来才发现的砷超积累植物68，后来又发现了一些其它蕨类植物，如Pityrogramma calomelanos69。HPLC-ICP-MS分析结果指出，P. vittata 中85砷是以亚砷酸盐存在的，其余局部是以砷酸盐存在的。并主要以As(III)固定在叶中70，71。在最后要特别强调一点，在所有形态分析的研究中样品的采集和预处理过程是非常重要的，必须保证样品的存在形态没有或尽可能小的改变。8. 2. 生物可给性过去，生物可给性是指土壤中重金属或疏水性有机污染物被生物体吸收的局部72。两个

36、主要的因素决定生物可给性的量：1化学物质从土壤向活体细胞转移的速率传质过程；2吸收和代谢的速率细胞的本征活性 73。近来，生物可给性是指决定生物暴露于土壤或沉积物中的化学物质的物理化学与生物反响的过程74。这个反响过程可以粗略地区分为：土壤和沉积物中的反响过程；污染物在生物体细胞膜外表的反响和进入生物体内的生物反响过程。随着人们对生物可给性的认识的逐渐深化，生物可给性的研究会推进到一个新的阶段。但考虑到污染物质在土壤和沉积物中的反响已有其它文章论及。因此，在以后的讨论中，将主要讨论土壤中重金属的生物可给性的方法学进展，并将这些进展与污染物的生物反响过程联系起来。在相当长的一段时间内，人们做出了

37、很多努力，以便深入了解金属元素在环境中的反响过程和被生物吸收的过程。基于不同的原理，开展了生物可给性的不同的方法学：8 游离离子活性模型(The free ion activity model, FIAM)早期，游离离子活性模型是用来解释金属-生物相互反响的。认为游离离子活性模型在决定金属阳离子的吸收和毒性中具有普遍的重要性75。Lombi和Nolan 76证明FIAM是基于以下平衡反响(为简单起见，不考虑电荷)： 8-1 (8-2) (8-3) (8-4)上式中，M代表金属，L是可溶性基团，_X代表细胞膜外表键合位点，其关键假设是：游离离子浓度Mn+只由可溶性基团L的反响所决定，对于细胞外表

38、的存在与否是“无差异的；KMLKM_X或LTXT。这里LT和XT指总基团浓度和总的细胞外表键合位点浓度；在水相和细胞膜外表之间能迅速到达快平衡；对金属的生物响应(BR)是与M_X 的形成程度成正比，即与M所占可能的外表键合位点的分量成正比： BR = KM_X_XM (8-5) _XM_X，实际上_X是常数，所以生物响应BR只与Mn+成正比；当暴露于某一金属时，细胞膜外表的性质仍保持不变。值得指出的是，与FIAM一致并不排除金属配合物在细胞膜外表通过以下置换反响而键合： (8-6) (8-7)将反响(2)和(7)重排，那么得： (8-8)当然，FIAM亦有例外。如果金属配合物ML与细胞膜外表反

39、响，生成三元外表配合物ML-X。这样，生物响应与配合物ML的活性相关，而并不与M的活性相关。如果M也引起生物响应，那么总的生物响应是M和ML的加权作用。但对高等植物而言，似无实验可以证明三元配合物的存在。但是，不符合FIAM模型的研究也有报导。当在污染土壤中参加50和100 mg/kg EDTA时，镉在植物中的浓度增加11倍和63倍。所以这个例子是FIAM的一个例外77。当印第安娜芥菜(Brassica juncea)暴露于铅和过量EDTA时，干叶中的铅可达1.1(W/W)。同时，在叶中EDTA的积累是与铅的积累有正相相关关系。所以，人们推测EDTA首先在植物体外是与铅结合，然后以Pb-EDT

40、A配合物的形式被植物吸收，并通过木质部输送，储存在叶中78。离子色谱电喷雾质谱证明土壤溶液和植物木质部中均检出Mn-、Zn-、Al-图8-6 表示EDTA处理对L值的(CdL, )和镉溶解性的影响。图示为几个化学实验对土壤镉溶解性的比拟：硝酸提取 Cdtotal， E值CdE和0.05 M EDTA或1 M CaCl2Cdcl萃取。EDTA萃取的悬浮液比例是0.2 g mL-1，EDTA量是与盆载实验中的处理相当0, 0.1, 1, 5, and 10 mmol EDTA kg-1引自文献81.图8-7镉的L/E与被芸苔Brassica juncea吸收镉的关系(引自文献81.和Cd-EDTA

41、配合物79。但Vassil78认为金属-EDTA配合物的吸收机理可能不同于金属离子的吸收机理，可能由于高浓度配合物的存在，使细胞膜的正常生理功能受到破坏。8. 同位素稀释交换同位素稀释(isotope dilution exchange)用于生物可给性的原理是当放射性同位素参加到已平衡的土壤悬浮液时，同位素就会很快地(数小时到数天)在固相和溶液相之间进行分配。这种分配过程如同土壤外表吸附的稳定元素与液相到达平衡时一样。可移动性放射性局部通常认为是放射性可交换库或E值。E值可以用放射性同位素在土壤固相和溶液相间的分配系数(Kd)和稳定元素在溶液相中的浓度(M)进行测定80：E (mg/kg) =

42、 M (mg/L) Kd (L/kg 土) (8-9)同样，这个概念可以将植物从土壤溶液中吸收金属元素看作为放射性同位素和稳定元素在土壤固相和溶液相间到达平衡时的分配过程。不过植物可给性是用L值代替E值。Stanhope等81应用同位素稀释技术评论植物修复技术。当参加EDTA(0-10 mmol/kg土)能增加植物从污泥处置后的土壤中吸收Cd、Zn、Pb、Ni和Cu。实验结果指出，E值和L值很相近图8-6和图8-7。因此，作者认为L值可以作为土壤的根本特性，它与生物试验和植物生长条件无关。但污染土壤中镉的生物可利用性并不是只决定于土壤外表过程82。镉的L值和E值的差异可能是由于植物根际同位素交

43、换与中性盐的萃取的条件有差异所引起的。按照同样的思路，土壤溶液中镉的比放射性总是要比植物中的比放射性高。这说明，根际溶液中的镉的比放射性比本体土壤的镉的比放射性高。L值和E值的差异也意味着与植物有关的同位素会影响同位素交换83。由于土壤pH， 可溶性有机物质和离子活度等的影响。植物根际金属的移动性与本体土壤的移动性是有差异的。 薄层梯度扩散(diffusive gradients in thin films, DGT)薄层梯度扩散的概念是由Hamilton-Taylor84，Hunt 85, Zhang 和Davison86-88 等人提出来的。它的原理是Fick第一扩散定律。一个厚度为g的离

44、子渗透水凝胶膜将溶液本身与离子交换树脂层分开(图8-8)。金属离子通过凝胶膜扩散，很快与树脂键合。假设树脂的键合容量没有超过的话，树脂外表的金属浓度即可假定为零，从而为水凝胶层创造一个浓度梯度。如果在水凝胶层设置时间(t)，这个浓度梯度保持常数(图8-8 中条件(i)，那么通过水凝胶层扩散的离子通量(F)可以用方程(10)计算，溶液本身中离子的浓度(C)可以用方程(11)计算：F = DC/g (8-10)C = Mg/(DtA) (8-11) 这里D是金属离子的扩散系数，A是暴露于溶液本身凝胶膜的面积，M是积累在树脂层的金属量。应用DGT可以直接测量在时间(t)内通过膜(面积为A)积累金属量

45、M时的扩散通量：FDGT = M/(tA) (8-12)图8-8 DGT实验中与溶液接触的离子浓度梯度示意图，溶液中离子从土壤固相中被重新补充：情况1表示溶液中金属离子浓度完全保持恒定；情况2表示溶液中金属离子的浓度没有保持不变；情况3表示溶液中金属离子的浓度局部得到补充引自文献86。当金属离子从溶液中通过DGT而去掉时，那么金属离子就可能从土壤的固相向溶液相重新补充。这样DGT装置就会形成一个从土壤到溶液之间的净通量。这种DGT诱导产生的土壤到溶液的通量(Fss)不一定与从土壤到溶液的最大通量(Fpm)相同。根据DGT装置的性质，Fss可能是Fpm的一个分量，故曰分通量。直接测定的DGT通量

46、(FDGT)与Fss和Fpm有关，可能是以下三种情况之一(图8-8)：(1) 溶液中金属离子浓度完全保持恒定：当金属离子被DGT装置去掉以后，金属离子可以从土壤固相中迅速得到补充，从而使溶液中的金属离子浓度实际上得到缓冲而保持在一个定值。如果在时间内在树脂层中积累的金属量加以测定以后，那么在土壤溶液中金属离子的原位浓度就可以用方程(11)进行计算，FDGT就可以用方程(12)得到。这就表示金属离子从土壤到溶液的分通量小于原位点的可能通量FSS = FDGT Fpm。(2) 溶液中金属离子的浓度没有保持不变：这就表示金属离子的浓度从土壤中没有得到补充(Fpm = 0)。金属离子向DGT装置的补充

47、完全依靠溶液中离子的扩散，这样金属离子首先在DGT装置附近被逐渐去掉，然后向溶液延伸。DGT通量随着时间的延长而逐渐下降。但是溶液中的起始浓度可以假设干个时间相关扩散方程所测定的DGT而计算得到。(3) 溶液中金属离子的浓度局部得到补充：溶液中金属离子的浓度能从土壤中能得到局部补充，但缺乏以保持起始浓度，也不能完全满足DGT的需要。应用DGT装置测量的通量可以等于由DGT装置诱导产生的从土壤到溶液原位点的通量(FSS = FDGTFpm)。Zhang等人88应用DGT测定土壤溶液中有效浓度(CE)，并与植物(Lepidium heterophyllun)中铜的浓度进行相关分析。实验结果证明CE

48、是与植物中铜的浓度有很好的线性相关关系。但植物中铜的浓度与铜的FIAM或EDTA萃取的铜没有相关关系。从而证明DGT土壤系统能够较好地模拟土壤铜的扩散和淋溶过程。相关性分析比拟常用的预测评估土壤中金属元素的生物可给性的方法是相关性分析方法，即将单一萃取方法或分级萃取方法所得到的土壤萃取液中金属的浓度与植物中金属的含量进行相关性分析。如果好的线性相关成立，那么认为土壤溶液中那局部金属是生物可给的。相关分析用于生物可给性的评估。其原理是金属元素不管是生物必需元素或有毒元素总是与土壤或沉积物的某个些特定的地球矿物相结合一起的。与不同的相结合的金属元素的形态转化、移动性、生物可给性与生物毒性是不同的。

49、因此，人们企图使用不同的萃取方法将金属元素从不同的相中别离出来。这里需要指出的是，大局部萃取剂缺少选择性和专一性。考虑到这种情况，似乎不能非常严格地认为某一萃取剂能够将金属元素从土壤的某个地球化学相中萃取下来。因此，我们应当认为土壤的不同库中的金属元素有不同的“溶解度，不同的萃取剂可以将不同库中的金属元素萃取出来。常用于生物可给性的单一萃取方法如表8-4 89： 表8-4 常用于生物可给性研究的单一萃取方法萃取剂元素植物水Cd、 Cu、 Zn小麦、莴苣0.05 mol/L EDTACd、 Cu、 Zn、Ni、Pb可食作物0.05 mol/L EDTASe、Mo温室作物DTPACd、 Cu、Fe

50、、Mn、Ni、Zn豆类、莴苣、玉米、小麦2.5%(V/V)乙酸Cd、Co、Cr、Ni、Pb、Zn可食作物、草本植物1 mol/L NH4OAc, pH7Mo、Ni、Pb、Zn0.05 mol/L CaCl2Cd、Pb蔬菜0.1 mol/L NaNO3Cd、Pb蔬菜1 mol/L NH4NO3Cd、Pb蔬菜最初，人们开展分级萃取方法是为了研究元素在土壤不同矿物相的分配情况，但以后慢慢地应用到生物可给性研究。目前最重要的分级萃取方法是欧盟BCR方法(表8-5)90： 表8-5 BCR分级萃取方法(1g土壤)步骤元素分级试剂体积(ml)温度()萃取时间1水溶态、可交换态、碳酸盐结合态0.11 mol

51、/L CH3COOH40225震荡16 h (过夜)2Fe-Mn氧化物结合态 mol/LNH2OHHCl用2mol/L HNO3酸化40225震荡16 h (过夜)3有机物和硫化物结合态8.8 mol/L H2O2,1 mol/L NH4OAc(pH2)101050225852852225消解1 h(偶尔震荡)消解1 h消解1 h震荡16 h (过夜)4残渣态王水大局部已发表的一步萃取和分级萃取方法所得到的生物可给性数据都是针对特定的实验条件和特定的植物种类，不能进行互相比拟，很多结论都难以验证。由于生物可给性受很多因素的影响，特别是土壤性质、植物种类以及土壤/植物相互之间作用的影响。因此，很

52、多相关分析数据是不一致的，也很难作出合理的解释91。 基于植物根际过程的生物可给性方法上述生物可给性方法学的根本出发点是寻找元素的化学性质(金属离子活性模型)，在土壤中存在的物理形态或不同矿物相之间的分配(同位素稀释和相关性分析)或金属元素在土壤溶液中的扩散行为(DGT)与生物可给性的关系。因此，这些方法都基于土壤中金属元素的物理化学性质。其共同的局限性是忽略了植物根际微环境对生物可给性的影响。在过去20多年中，越来越多的证据说明，植物根际分泌的低分子量有机酸不仅是碳代谢的中间产物，而且是某些植物克服营养缺乏、耐金属中毒和土壤/植物界面反响的关键性因素92。植物分泌的低分子量有机酸也极大地改善

53、生物可给性93-95。植物分泌的低分子量有机酸可能与土壤中的重金属生成金属有机配合物，从而增加土壤中金属的溶解度。由于释放H+或HCO3-，植物根必然影响土壤pH，从而也会影响土壤主体元素钾和磷的生物可给性。植物根际微环境中的微生物的浓度也会比本体土壤高得多。土壤微生物可以促进螯合基团的释放、矿物和有机物质的降解或分解，从而促进根际环境中生物必需或非必需的痕量金属的移动性。所以可以说，根际微环境中根/微生物相互作用的综合结果对生物可给性的影响是必需考虑的96。植物吸收和传输机理是生物可给性的速率限制性步骤。土壤植物系统中痕量重金属与土壤主体成份之间竞争反响和抑制反响控制痕量金属离子配合物在土壤

54、溶液中的浓度和植物根的吸收以及植物细胞膜的传输。目前的知识还不能定量地描述植物根际环境中复杂反响过程对生物可给性的影响。但是已经取得的研究进展无疑给人以启示，生物可给性方法应当建立在植物根际过程的根底上。为了探索基于植物根际反响的生物可给性方法学，我们围绕着土壤/植物系统的某些过程作了研究，得到了假设干有益的结果。.1 有机酸对吸附的影响土壤中的低分子量有机酸的含量一般为10-7-10-4mol/L，植物根系附近的含量更高些。这些低分子量有机酸不仅严重影响了土壤中的重金属的吸附解吸行为，而且对元素的淋溶能力和生物可给性有很大影响。我们研究了柠檬酸、苹果酸、酒石酸和醋酸对稀土元素在黑龙江的黑土和

55、江西红壤中的吸附行为的影响97。当平衡溶液中的稀土元素浓度增加时，稀土元素的总吸附量增加, 但吸附百分比降低。在黑龙江的黑土中，在Ca(NO3)2和醋酸条件下和pH 2-8的范围时，近100%的稀土元素都能够被土壤吸附，似乎pH值对稀土元素的吸附行为影响不大。但对于江西的红壤，在Ca(NO3)2存在的条件下，随着pH值的增加，稀士元素的吸附百分比由40%增加到90%。这说明黑土的吸附能力大于红壤。在柠檬酸、苹果酸、酒石酸存在的条件下，所有土壤对稀土元素的吸附能力都有明显降低。同时随着pH值的降低，黑土的吸附量也逐渐减小。在这些低分子量有机酸中，柠檬酸对吸附量的影响最大，醋酸最小。其吸附量降低的

56、顺序为柠檬酸苹果酸酒石酸醋酸。这个次序是与稀土元素和这些低分子量有机酸的络合常数从大到小的次序一致(logk1)。这说明溶液中稀土元素与低分子量有机酸的结合是吸附量降低的主要因素。在没有低分子量有机酸存在时，稀土元素的吸附行为主要由土壤性质控制。在低分子量有机酸存在条件下，溶液中的低分子量有机酸和土壤中的吸附位点间存在竞争效应。溶液中的低分子量有机酸引起吸附位的减少，其程度与低分子量有机酸同稀土元素的络合常数及低分子量有机酸的浓度有关。土壤是一个十分复杂的混合体系，有各种有机物，铁、锰、铝的氧化物以及各种黏土矿物。土壤中各种性质不同的化学成分都对稀土元素的吸附有作用。因此，对土壤中稀土元素之间

57、亲和力进行定量计算是很困难的，固-液外表的电荷明显影响金属元素的吸附行为。因此在一般条件下，土壤总是带负电荷，它对阴离子的吸附主要为静电吸引。对于江西的红壤，pH值对稀土元素吸附的影响更复杂些。在醋酸存在的条件下，稀土元素的吸附量随着pH值的增加而增加。在酒石酸存作的条件下，pH值2-6时，吸附量变化不大。pH值6-7时，吸附量明显增加。在苹果酸或柠檬酸存在的条件下，pH值2.5-4.5时，吸附量逐渐减少。但pH值超过4.5时，吸附量变化不大。这可能是由于红壤中较多的铁铝氧化物导致的较高的pHzpc。当pH5.2，反响(13)可能发生。而当pH3.2，反响(14)可能发生。这引起了土壤外表的正

58、电荷Al(OH)2+和Fe(OH)2+的形成。Al(OH)3Al(OH)2+ + OH-(8-13)Fe(OH)Fe(OH)2+ + OH- (8-14)土壤pH值越低，土壤所带正电荷越多。土壤中的正电荷会强烈地吸附溶液中的带负电荷的有机配体离子，导致土壤外表电荷变成负性。这种土壤外表电荷性质的转变进一步导致金属离子吸附量最的增加。.2 有机酸和溶液pH值对稀土元素解吸的影晌有机酸和溶液pH值对黑龙江、浙江、广东和江西四种土壤解吸稀土元素的影响见图8-9。在所控制的pH范围内，除了江西红壤以外，在NO3-和乙酸溶液中解吸出的稀土元素量很少。然而当参加其他有机酸之后，不同土壤对稀土解吸的行为显示

59、出很大的差异。几乎所有土壤对不同稀土解吸的大小顺序是江西广东浙江黑龙江。这些差异与土壤的CEC值有较好的相关性。在黑龙江、浙江和广东土壤中，在有机酸存在时，解吸的稀土随溶液pH的增加而减少。对江西红壤来说，相似的现象也可在NO3-、乙酸和酒石酸的溶液中观察到。这是因为溶液pH值可从两个方面影响重金属元素的解吸：一方面，通过改变和pH值有联系的土壤颗粒物外表电荷密度来改变土壤对稀土元素的亲和力，导致随着溶液pH的增加，重金属的解吸量减少。另一方面，改变了溶液的pH值也就改变了有机配体的形态分布，这反过来影响了稀土元素的解吸。由于不同的有机酸有着不同的解离常数，在同一pH值时，相同浓度的有机酸游离

60、离子的浓度是不相同的。10-2mol/L有机酸pH值的大小顺序是：酒石酸柠檬酸苹果酸乙酸。假设pH值是影响稀土从土壤解吸的主要原因，在每一固定的pH值时，图8-9 有机酸和pH对稀土元素从土壤中解吸的影响 (a) 黑龙江土壤; (b) 浙江土壤; (c)广东土壤; (d)江西土壤. 有机酸: () 柠檬酸; () 苹果酸; () 酒石酸; () 乙酸; () 硝酸盐.酒石酸离子的浓度最高，因而它解吸的稀土元素的量也应是最多的。可是上述假设现象在实验中并未观察到。事实上，从同一土壤解吸的稀土元素的大小顺序是柠檬酸苹果酸酒石酸乙酸。这一顺序和有机酸与稀土元素配合物稳定常数的顺序是相一致的。因而有机