实验五 还原糖-砷钼酸比色法

1、一、糖一、糖1. 1. 糖的生理功能糖的生理功能(1)(1)分布广泛的有机化合物分布广泛的有机化合物, ,它是某些植物种子它是某些植物种子、根、茎的重要组成部分，也是蔬菜、根、茎的重要组成部分，也是蔬菜、水果等水果等的重要组成部分。的重要组成部分。(2)(2)维持生命活动的主要能量来源。维持生命活动的主要能量来源。(3)(3)是许多植物和微生物细胞壁的重要组成部是许多植物和微生物细胞壁的重要组成部分。分。2.2.测定的意义测定的意义(1)(1)在植物组织中，糖含量可高达在植物组织中，糖含量可高达80%80%左右，在左右，在动物和人组织中，含量较少，约为干重的动物和人组织中，含量较少，约为干重的

2、2%2%。(2)(2)植物中糖的种类和含量分析，对于选种及植物中糖的种类和含量分析，对于选种及控制培育条件有重要的意义。控制培育条件有重要的意义。(3)(3)在微生物发酵中控制培养基中糖等物质的在微生物发酵中控制培养基中糖等物质的含量，对指导生产实践很重要。含量，对指导生产实践很重要。(4)(4)在医学方面根据血糖或尿糖含量的高低诊在医学方面根据血糖或尿糖含量的高低诊断某些疾病。断某些疾病。3.3.测定的方法测定的方法(1)(1)根据糖溶液的折射率、比重、旋光活性等根据糖溶液的折射率、比重、旋光活性等物理性质，可用折射仪、波美比重计、旋光物理性质，可用折射仪、波美比重计、旋光仪来测定糖含量。仪

3、来测定糖含量。(2)(2)根据糖的化学性质可用滴定法、比色法定根据糖的化学性质可用滴定法、比色法定量测定，此外还有氧电极、酶电极等快速微量测定，此外还有氧电极、酶电极等快速微量的定糖方法。量的定糖方法。二、实验目的二、实验目的1.1.了解还原糖的生理意义及作用。了解还原糖的生理意义及作用。2.2.掌握砷钼酸比色法测定还原糖的基本原掌握砷钼酸比色法测定还原糖的基本原理和操作方法。理和操作方法。三、实验原理三、实验原理还原糖还原糖：指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还

4、原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的利用糖的溶解度溶解度不同，可将植物样品中的单糖、不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。双糖和多糖分别提取出来。对没有还原性的双糖和多糖，可用对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法酸水解法使其使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。1、砷钼酸比色原理、砷钼酸比色原理（1 1）还原糖在碱性条件下加热，可以定量地还原）还原糖在碱性条件下加热，可以定量地还原二价铜离子为一

5、价铜离子，即产生砖红色地氧化亚二价铜离子为一价铜离子，即产生砖红色地氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。具体反应如下：铜沉淀，其本身被氧化。具体反应如下：（酒石酸钾钠）（酒石酸钾钠）砖红色砖红色（2 2）氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还）氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型地钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，原，还原型地钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅生成一种蓝色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖地含量在一定范围内与还原糖地含量( (即被还原的即被还原的CuCu2 2O)O)成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标

6、准，就可测得样品还原糖含量。比色后做标准，就可测得样品还原糖含量。2、测定还原糖其它方法、测定还原糖其它方法(1)(1)蒽酮比色法：蒽酮比色法： 强酸可使糖类脱水生成糠醛，糠醛与强酸可使糖类脱水生成糠醛，糠醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，其颜色的深浅与糖含量成正比关系，在色，其颜色的深浅与糖含量成正比关系，在620nm620nm波长下可测定其光密度值。波长下可测定其光密度值。(2) 3,5-(2) 3,5-二硝基水杨酸：二硝基水杨酸： 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，酸及其它产物，3,5-3,5-

7、二硝基水杨酸则被还原二硝基水杨酸则被还原为棕红色的为棕红色的3-3-氨基氨基-5-5-硝基水杨酸。在一定范硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在成正比关系，利用分光光度计，在540nm540nm波长波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。可求出样品中还原糖和总糖的含量。(3)(3)费林试剂滴定法费林试剂滴定法 费林试剂由甲乙两种溶液混合而成，甲费林试剂由甲乙两种溶液混合而成，甲液液( (硫酸铜硫酸铜) )与乙液与乙液( (氢氧化钠氢氧化

8、钠) )生成天蓝色沉生成天蓝色沉淀，在碱性溶液中，乙液淀，在碱性溶液中，乙液( (酒石酸钾钠酒石酸钾钠) )使氢使氢氧化铜溶解生成一种络合物，还原糖在碱性氧化铜溶解生成一种络合物，还原糖在碱性加热条件下，可以定量还原费林试剂中加热条件下，可以定量还原费林试剂中CuCu2 2+ +为为CuCu1+1+, ,使费林试剂脱色，其脱色的程度与还使费林试剂脱色，其脱色的程度与还原糖含量成正比关系。原糖含量成正比关系。四、实验材料、主要仪器和试剂四、实验材料、主要仪器和试剂 1 1实验材料实验材料 ：苹果2 2仪器仪器（1 1）恒温水浴锅）恒温水浴锅 （2 2）Spc22-Spc22-可见分光光度计可见分

9、光光度计（3 3）容量瓶（容量瓶（4 4）漏斗（）漏斗（5 5）研钵）研钵3 3试剂试剂（1）铜试剂：）铜试剂：CuSO4、酒石酸钾钠、酒石酸钾钠、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3（2）砷钼酸试剂：）砷钼酸试剂：（NH4)6Mo7O244H2O、Na2HAso47H2O（3） 200g/mL葡萄糖标准液葡萄糖标准液1 1、制作标准曲线、制作标准曲线: : 取取7 7支试管，按下表操作，然后以支试管，按下表操作，然后以标准葡萄糖浓度标准葡萄糖浓度为横坐标，为横坐标，对应的吸光值对应的吸光值为纵坐标绘为纵坐标绘制标准曲线。制标准曲线。管管号号葡萄糖葡萄糖标准液标准液mL蒸馏水蒸馏水mL铜试

10、剂铜试剂mL沸水沸水浴浴砷钼酸砷钼酸mLOD620nm葡萄糖浓度葡萄糖浓度（g/ml）0(参比参比)022 10min 冷却 2 mL 振荡振荡2min定定容容到到20 mL0 10.11.910 20.21.820 30.31.730 4 0.41.640 50.51.55060.61.460提取液提取液2ml五、实验步骤标准葡萄糖溶液浓度(ug/ml)OD值0样品ODC02 2、还原糖的提取、还原糖的提取 称取称取0.5g0.5g苹果于研钵中苹果于研钵中加约加约30ml30ml蒸馏水由蒸馏水由漏斗冲入漏斗冲入50ml50ml容量瓶，摇匀容量瓶，摇匀8080水浴浸提水浴浸提30min30mi

11、n冷却冷却加加3mlZnSO3mlZnSO4 4加加3ml0.3N3ml0.3N的的Ba(OH)Ba(OH)2 2振荡后静置振荡后静置上层出现清液后再加一滴上层出现清液后再加一滴Ba(OH)Ba(OH)2 2至无白色沉淀至无白色沉淀定容至定容至50ml50ml。 3 3、还原糖含量的测定、还原糖含量的测定 过滤提取液过滤提取液取滤液取滤液0.5ml0.5ml于于50ml50ml容量瓶中容量瓶中定容定容取稀释液取稀释液2ml2ml于刻度试管中于刻度试管中加铜试剂加铜试剂2ml2ml煮沸煮沸10min10min加砷钼酸试剂加砷钼酸试剂2ml2ml振荡振荡2min2min定容到定容到20ml620nm20ml620nm下比色测定下比色测定记录结果记录结果查标准曲线。查标准曲线。五、结果与计算五、结果与计算 在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖百分含量。按下式计算出样品中还原糖百分含量。还原糖还原糖(%)=(%)= W101