转基因植物筛选与检测PPT课件

1、转基因植物的筛选与检测 问题 1.进行转基因操作了，如何选出来已成功 导入基因的细胞？ 2. 转化体里的外源基因是否成功的表达了呢？1第1页/共17页一、筛选的方法与原理 通过特定基因在转化体内的表达，利用特定的试剂，选择出来转化细胞。 注：注： 1.1.特定基因又称特定基因又称“抗性基因抗性基因” 2.2.表达方式：蛋白质的合成、酶的失活等表达方式：蛋白质的合成、酶的失活等 表表“植物遗传转化中的选择试剂及其抗性基因植物遗传转化中的选择试剂及其抗性基因”2第2页/共17页3第3页/共17页二、检测的方法与原理 利用特定基因在转化体内的表达，对其表达产物进行检测。 不同分子水平上检测方法：不同

2、分子水平上检测方法：SouthernPCRNorthernqRT-PCRWestern4第4页/共17页 报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。 必须具有以下几个条件：必须具有以下几个条件： (1)已被克隆和全序列已测定；已被克隆和全序列已测定； (2)表达产物在受体细胞中原本不存在；表达产物在受体细胞中原本不存在； (3)其表达产物能进行定量测定。其表达产物能进行定量测定。 例如：例如：Kan 抗性基因、抗性基因、Gus 基因、基因、Bar 基因基因5第5页/共17页 Gus基因存在于E.coli等一些细菌

3、基因组内，编码-葡萄糖苷酸酶。 缺点： （1 1）染色不均匀）染色不均匀 （2 2）不能进行亚细胞定位）不能进行亚细胞定位 （3 3）不能进行活体染色）不能进行活体染色6第6页/共17页 Southern 印迹杂交是利用标记的探针（probe）与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。 特点： 可清除操作过程中的污染可清除操作过程中的污染 (如如 DNA 分离及植物分离及植物 DNA 分离过程中的交叉污染分离过程中的交叉污染) ，以及转化愈伤，以及转化愈伤胞间质粒残留所引起的假阳性信号，胞间质粒残留所引起的假阳性信号，准确度高准确度高。 Southern 杂

4、交程序杂交程序复杂复杂，成本高成本高 ，且对实验技，且对实验技术条件术条件要求较高要求较高。7第7页/共17页 Northern 杂交的主要原理是把变性 RNA 转移和固定在特定的薄膜上 , 用特定的 DNA 探针来检测 RNA。 特点： Northern 杂交与杂交与Southern 杂交相比杂交相比 , 更接近更接近于性于性 状表现状表现 , 更有现实意义更有现实意义 , 被广泛用于转基因植被广泛用于转基因植株株 的检测。但的检测。但RNA 提取条件严格提取条件严格 , 在材料内在材料内含含量少量少 , 不适于大批量样品的检测。不适于大批量样品的检测。8第8页/共17页 Western 印

5、迹是将蛋白质从 SDS-PAGE胶中电泳转移至固相支持体上 , 然后对固定化蛋白质进行免疫学测定的方法。 特点： Western 杂交杂交灵敏度极高灵敏度极高，可以测出粗蛋白提，可以测出粗蛋白提取取 物中小于物中小于 50ng 抗原，在较纯的制剂中抗原，在较纯的制剂中 ，可测，可测出出 15ng 抗原。能直接显示目的基因在转化体抗原。能直接显示目的基因在转化体中中 是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的的性状表现性状表现。9第9页/共17页 PCR/qRT-PCR PCR/qRT-PCR 是在体外快速特异地扩增目的基因DNADNA片段的有效方法。 特

6、点： 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳扩增产物经琼脂糖凝胶电泳 ，染色后很容易，染色后很容易观察，观察，不通过杂交不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。材料的一些顺序。材料用量少用量少，检测方便，可以在，检测方便，可以在试管苗阶段，甚至对愈伤组织进行检测，了解试管苗阶段，甚至对愈伤组织进行检测，了解转化早期的信息，便于及时优化试验方案。转化早期的信息，便于及时优化试验方案。DNA提取方便，适合于提取方便，适合于大批量样品分析大批量样品分析，又能，又能检测目的基因的完整性，是检测目的基因的完整性，是早期检测早期检测的一种较的一种较好方法。好方法。10第10页/共17页So

7、uthern杂交 1.提取DNA 2.电泳 3.变性 4.转膜 5.固定DNA 6.探针的标记 7.杂交与检测（NBT/BCIP显色）印迹印迹DNA膜膜转移转移11第11页/共17页Southern杂交转膜仪转膜仪把膜和胶片紧密结合，压！把膜和胶片紧密结合，压！12第12页/共17页转膜 注意： 此过程最重要的是保持各此过程最重要的是保持各DNA片段的相对片段的相对位置位置不变不变。故而称为。故而称为印迹（印迹（blotting）。 用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（素膜（NC膜）、尼龙膜（膜）、尼龙膜（Nylon） 、化学活化、化学活化膜和滤纸等。膜和滤纸等。 双链双链DNA变性变性单链单链DNA转移转移固相支持物固相支持物电泳槽、缓冲液、夹板电泳槽、缓冲液、夹板13第13页/共17页Western 1.1.制胶及上样 2.2.电泳 3.3.转膜 4.4.封闭 5.5.抗体孵育 6.6.曝光显影曝光显影后的条带曝光显影后的条带14第14页/共17页 总结：这些技术需要转膜、杂交，操作繁琐，费用高,可对转基因植株随机取样检测。 Southern 杂交