高效液相色谱在制药行业中的应用

1、会计学1高效液相色谱在制药行业中的应用高效液相色谱在制药行业中的应用第1页/共76页第2页/共76页 北京创新通恒科技有限公司是一家面向全球的专业HPLC企业，主要致力于高效液相色谱系统研制、开发、生产和销售。 创建于2000年，公司总部位于北京市海淀区中关村高科技园区上地信息产业基地，是一家极具创造力的国家级高新技术企业。十年来一直秉承“精益求精，追求品质，值得信赖”传统，根据用户需求，在用户关键领域进行持续的技术研发。 我们拥有卓越的技术团队和专家级的一流研发人才，“CXTH DAC800工业化生产型HPLC系统”研发投产，将中国工业化色谱系统推向世界前列，这是中国大型纯化分离研发领域的一

2、座里程碑；“CXTH Kilotide500 DNA合成仪”投入使用，弥补中国大型合成设备领域的空白。 第3页/共76页第4页/共76页第5页/共76页第6页/共76页北京创新通恒科技有限公司北京创新通恒科技有限公司北京钢臣科技有限公司总经理办公室开发部财务部营销事业部中小设备加工中心应用技术发展部工业化设备加工中心上海办事处成都办事处广州办事处售后技术支持中心第7页/共76页第8页/共76页第9页/共76页第10页/共76页第11页/共76页第12页/共76页21.858 125.957 253.634 3-20020406080100120140160180mV71421283542495

3、6637077min第13页/共76页19.79820.73821.61822.99124.07225.65526.91333.38842.358020406080100120140mV6121824303642485460min第14页/共76页 第15页/共76页 第16页/共76页 第17页/共76页第18页/共76页DISCOVERY ACTIVE COMPONENT发现活性发现活性第19页/共76页中药提取物或发酵液等的分析谱图0.5862.4182.9283.7824.0684.5365.2366.6636.9947.9338.77510.11211.33013.36315.658

4、17.61618.78820.04220.89422.70824.17626.54228.57729.74030.97832.93534.88337.24438.25439.30940.51842.35744.26846.96248.88449.74851.37454.71857.30058.94659.833-5051015202530354045mV510152025303540455055min第20页/共76页0.5862.4182.9283.7824.0684.5365.2366.6636.9947.9338.77510.11211.33013.36315.65817.61618.7

5、8820.04220.89422.70824.17626.54228.57729.74030.97832.93534.88337.24438.25439.30940.51842.35744.26846.96248.88449.74851.37454.71857.30058.94659.833-5051015202530354045mV510152025303540455055min用半制备色谱系统，对可能具有生物活性的组分，多次进样，分段制备几十毫克做活性研究，最终确定活性组分第21页/共76页第22页/共76页第23页/共76页0.6280.9201.0891.3221.5311.6591.

6、9112.2132.3342.4822.7282.8433.0873.7293.9134.1825.0135.4526.0017.0427.5208.5788.8029.68010.35811.33812.89514.28615.86116.89720.63222.31854.02372.02578.5460200400600800100012001400mV8162432404856647280min第24页/共76页 小试级制备色谱系统：小试级制备色谱系统：方法的放大及标准品、对照品的制备。方法的放大及标准品、对照品的制备。第25页/共76页中试级制备色谱系统：中试级制备色谱系统：年产公斤

7、级至百公斤级年产公斤级至百公斤级第26页/共76页DAC800 型工业化色谱：型工业化色谱：年产吨级年产吨级第27页/共76页第28页/共76页第29页/共76页第30页/共76页第31页/共76页色谱柱的选择色谱柱的选择第32页/共76页第33页/共76页1.ODS（C18）应用范围最广的填料，大部分小分子有机化合物都可进行分析2.C8、C4保留要比C18弱，适合用于大分子的多肽和蛋白类的分离纯化3.氨基柱正反双模式，主要用于小分子糖类化合物4.苯基柱通常用于分离含苯环的化合物5.氰基柱正反双模式，和ODS基不同的色谱间作用力，因而氰基柱拥有独特的选择性6.正向硅胶7.环糊精根据物质光学性质

8、的不同进行手性分离第34页/共76页六通阀的构造六通阀的构造a. a. Load状态状态b. b. Inject状态状态 自动进样器自动进样器第35页/共76页为保证重现性以及峰形为保证重现性以及峰形等，很多情况下需要使等，很多情况下需要使用柱温箱来控制柱温。用柱温箱来控制柱温。第36页/共76页第37页/共76页第38页/共76页分析型色谱：线性色谱指组分在固定性和流动相中的平衡浓度呈正比例关系，即吸附（分配）等温线为一条直线。用于分离和鉴别样品中的组分，为此希望能在尽可能小的进样量下，提供尽可能高的组分分辨率。制备色谱：非线性色谱在制备色谱中，进样量一般都比较大，例如在克量级范围，这时样品

9、在流动相和固定相中的比例不再是正比例的关系，相对应的吸附（分配）等温线将发生弯曲。用于分离、富集或纯化混合物中的某一或某些组分，为此需要一定的处理量，一般进样量比分析型色谱大得多。能有适当的分离度，并要考虑层析分离过程的规模、速率和分离成本。第39页/共76页线性色谱线性色谱分析分析制备制备非线性色谱非线性色谱理论的放大：非线性色谱第40页/共76页制制备备色色谱谱峰峰型型第41页/共76页色谱峰型不再对称色谱峰型不再对称色谱峰的保留时间随着进样浓度而变化色谱峰的保留时间随着进样浓度而变化色谱峰高度（峰面积）与色谱峰高度（峰面积）与进样浓度不成正比进样浓度不成正比非非线线性性色色谱谱的的特特点

10、点第42页/共76页浓度超载进样体积超载进样PKLangmuir型容量因子降低，峰形从高斯曲线变为三角形提高样品的浓度，保持进样体积不变；取决于组分在流动相中的溶解度峰高不变，峰变宽并呈矩形取决于进样体积，生产效率决定于制备柱直径，需要小颗粒填料理论的放大：过载进样第43页/共76页第44页/共76页此法时需很谨慎。第45页/共76页分析制备应用范围定性、定量检测样品的组成定性分析：检测的灵敏度定量分析：分离度、再现性 从混合物中提取、分离、纯化样品样品中特定成分的高纯度获取，大量、廉价的制备 填料粒径5um10um流速0.001-9.999ml/min10080000ml/min进样量0.0

11、1-2mg1-500000mg管路1/16”1/8”1/4进样方式进样阀进样阀或进样泵流动相不回收回收分离方式线性非线性第46页/共76页第47页/共76页更大的容更大的容器：储罐器：储罐流量更大的流量更大的输液泵输液泵50ml定量管定量管1ml进样泵进样泵50ml10mm法兰柱法兰柱DAC大体积流大体积流通池通池接溶剂回接溶剂回收系统收系统制备系统制备系统第48页/共76页分析制备放放大大优化分析方法的选择性优化分析方法的选择性在分析柱上进行在分析柱上进行超量载样超量载样放大到制备柱放大到制备柱设备的放大：过程第49页/共76页原料分析分析柱模拟制备放大至半制备（50DAC）中试放大（150

12、 or 200DAC)工业化制备（300- 800DAC)完全线性放大第50页/共76页可完全线性放大原因：可达到3000030000每米的塔板数，几乎与10um10um填料的分析柱柱效相当800DAC800DAC柱效测试结果图第51页/共76页上样量的调整：上样量的调整：mp/ma=lp/la * rp /raL:柱长；柱长；m：进样量；：进样量；r：色谱柱内径：色谱柱内径 p: 制备柱；制备柱；a：分析柱：分析柱重点122设备的放大：公式第52页/共76页流速的调整：流速的调整：Fp/Fa = Vp/Va = Lp/La * rp /raF ：流速：流速 ；V:柱体积；柱体积；L:柱长；柱

13、长；r：色谱柱内径；：色谱柱内径； p: 制备柱；制备柱；a：分析柱：分析柱重点222设备的放大：公式第53页/共76页梯度的调整方法：梯度的调整方法：tp/ta = Vp/Va * Fp/FaF ：流速：流速 ；V:柱体积；柱体积；t:梯度洗脱时间梯度洗脱时间； p: 制备柱制备柱；a：分析柱分析柱重点3第54页/共76页example样品：样品：粗品含量大约68%，白色粉末状固体，对热（能够耐受100摄氏度）和光稳定客户要求：客户要求：纯化后纯度大于99%，单杂小于0.8%，回收率达到70%1 step:了解客户需求从分析到制备的过程：案例第55页/共76页2 step:原始样品分析exa

14、mple用分析型HPLC（填料5u甚至更小）对样品进行分离，并对流动相进行改进，直到主峰和杂质完全分离，摸索好的条件用来对以后纯化后的样品进行纯度分析。从分析到制备的过程：案例第56页/共76页example分析条件：甲醇：乙腈：水=81：12：7检测波长：246nm流速：1.0mL/min柱子：C18，5m，4.6*250mm结果9.81610.50316.90319.79121.47623.96826.15230.58232.32134.92536.88838.57347.56748.37751.74565.05769.514-5051015202530354045m V918273645

15、5463728190m in从分析到制备的过程：案例第57页/共76页3 step:分析柱模拟制备填料粒径 10um，4.6*250mm的柱子不加非挥发性的酸碱盐，重新摸索制备条件主峰和杂质分离充分的条件下开始做过载实验将主峰分段收集，一般为分成10段左右分别测定纯度，计算回收率，进一步优化制备条件从分析到制备的过程：案例第58页/共76页example制备条件摸索流动相填料90%甲醇、75%甲醇、75%乙腈、70%乙腈、60%乙腈。 4种不同品牌的填料60%乙腈XX牌填料C18-10um-100A确定确定从分析到制备的过程：案例第59页/共76页example分析柱模拟制备谱图结果1.861

16、2.3042.4993.3103.6673.9774.4804.9765.2176.0836.4738.5079.0319.7229.99311.87312.30614.23715.71816.42917.70618.44019.64820.72821.27522.04322.73623.52324.63425.91527.63029.07737.47340.62750.56353.88357.57766.54269.26476.636-200020040060080010001200140016001800mV714212835424956637077min从分析到制备的过程：案例第60页/

17、共76页4 step:确定最大上样量不断增大上样量，直到回收率明显下降理论上样量：填料质量的3-8，可以从3逐渐增大来确定最大上样量第61页/共76页example60%乙腈，进样量4时，收率为36.3%60%乙腈，进样量3时，收率为78.9% 选择上样量为选择上样量为3 第62页/共76页最终确定的制备条件：最终确定的制备条件：流动相：60%乙腈-水上样量：填料质量的3填料：XX牌-C8-10um-100A样品溶剂：流动相从分析到制备的过程：案例第63页/共76页5step:放大分析柱模拟制备的条件及上样量等线性放大到制备柱上重复几次，至工艺成熟后，可以每次将主峰只分为4-6段将主峰分段收集

18、，一般为分成10段左右分别测定纯度，计算回收率，进一步优化制备条件公式见前面，制备柱规格根据实际样品量来决定从分析到制备的过程：案例第64页/共76页1.8942.9293.4754.8125.2725.7798.7079.50313.14817.82321.10222.76324.39630.10131.78138.44859.801-10001002003004005006007008009001000110012001300mV7142128354249566370min100DAC中试放大从分析到制备的过程：案例第65页/共76页2.3082.5194.1836.9327.2509.2

19、319.93711.01613.66020.77925.33333.22636.80347.14050.12958.49861.76766.42972.57293.867105.554111.164120.013150.434154.642160.709178.884193.359203.958224.722237.749247.848268.147281.174291.291311.088325.082335.198355.473369.472379.571402.282416.757421.099426.881444.226459.217468.851487.684497.334504.572514.188539.792554.269564.3861002003004005006007008009001000110012001300mV