相对定量分析学习教案

1、会计学1第一页，共49页。2第1页/共50页第二页，共49页。3绝对定量绝对定量典型应用领域典型应用领域: : 特定物种鉴定(e.g. bacteria, virus)特定核酸样本检测(e.g. oncology research)检测病原体载量(e.g. legionella, anthrax)筛选抗生素抗性基因(e.g. MRSA, VRE)水质监测Relative QuantificationRelative Quantification典型应用领域典型应用领域: :mRNA 表达水平的检测(e.g. 细胞因子, 肿瘤)基因定量 (e.g. 染色体缺失) 研究疾病的微小残留病灶(MRD)

2、GMO 检测相对相对(xingdu)(xingdu)定量定量第2页/共50页第三页，共49页。4目标目标需要进行研究的核酸需要进行研究的核酸 (特定的特定的RNA或或DNA序列序列)内参内参在研究的所有样本中，拷贝数恒定不变的核酸序列在研究的所有样本中，拷贝数恒定不变的核酸序列 (内源性对照内源性对照)第3页/共50页第四页，共49页。5Step 1: Step 1: 相同样品中的目标基因和参比基因的浓度相同样品中的目标基因和参比基因的浓度Step 2: Step 2: 不同样品中目的不同样品中目的(md)(md)基因的含量差别由参比基因校正基因的含量差别由参比基因校正参比基因可以修正：参比基

3、因可以修正：样品起始量的差别样品中核酸回收率的差别样品中可能的RNA降解不同样品中核酸质量的差别加样差（目标基因浓度）（目标基因浓度）（参比基因浓度）（参比基因浓度）T = 100T = 100 T = 10 T = 10 T = 10T = 10 = 2 = 2 = 2 = 2 = 0.2= 0.2 R = 50 R = 5 R = 50 R = 5 R = 50R = 50 = = calibratorcalibratortreated cell 2treated cell 2第4页/共50页第五页，共49页。-actinmultigene family; 20 genes; 1 acti

4、ve locus: hormones of tyroid gland20 pseudogenes: stomach tumorg-actinmultigene family; pseudogenesGAPDHmultigene family; 10-30 genes; 200 in mouse: lung, pancreatic, colon cancermostly pseudogenes: insulin, EGF5.8S,18S, 28S RNApseudogenes2-microglobulinno pseudogenes : Non-Hodgkin lymhoma abnormal

5、expression in tumorsG6PDHno pseudogenes: kidney, stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factorsPBGDno pseudogenesaldolasepseudogenesHPRTpseudogenesU3, U8, .Pseudogenesornithin: tumorsdecarboxylase.GeneGenomic structure / pseudogenesRegulation e.g.第5页/共50页第六页，共49页。7第6页/共50页第七页，共49页。校准品样本：未处

6、理的细胞系起始时间(shjin)点的样本 正常组织样本第7页/共50页第八页，共49页。9第8页/共50页第九页，共49页。相对定量相对定量常规常规(chnggu)的两种分析模式的两种分析模式相对定量相对定量(以校正以校正(jiozhng)样本归一化处理样本归一化处理)精确值精确值= 带扩增效率带扩增效率(xio l)校正校正 -method 近似值近似值 = 没有扩增效率校正没有扩增效率校正 CT 法法全部假设: E = 2相对定量计算公式相对定量计算公式 = 2 -CT 相对定量计算公式相对定量计算公式 =ET CpT (C) - CpT (S) X ER CpR (S) - CpR (C

7、)校正目标基因和内参基因 实际上不同的扩增效率第9页/共50页第十页，共49页。11N = N0 x 2nNnumber of amplified molecules N0initial number of moleculesnnumber of amplification cyclesE第10页/共50页第十一页，共49页。EFFICIENCY 扩增效率扩增效率(xio l)ET = ER = 2 ?第11页/共50页第十二页，共49页。默认扩增效率默认扩增效率(xio l) E=2， (-Cp)方法方法Calibrator Normalized Ratio = 2CpT(C) CpT(S)

8、 x 2CpR(S) CpR(C) = 2CpT(C)-CpR(C) - CpT(S)-CpR(S) = 2Cp(C)- Cp(S) = 2- Cp第12页/共50页第十三页，共49页。第13页/共50页第十四页，共49页。实际上实际上不是所有的不是所有的PCR反应都能达到反应都能达到E2的理想扩增效率的理想扩增效率(xio l)不是所有的不是所有的PCR反应在整个过程中的扩增效率反应在整个过程中的扩增效率(xio l)都保持恒定都保持恒定第14页/共50页第十五页，共49页。nN = No x En, E = 2?n理想情况下扩增理想情况下扩增效率效率2Crossing Point Log

9、Concentration样品 1 样品 2效率2 的标准曲线效率偏离2的标准曲线E =10 -1/slope第15页/共50页第十六页，共49页。17E = 10 -1/slope E = 10 -1/-3.703 E = 10 0.27 E = 1.86E =10 E =10 -1/slope-1/slope第16页/共50页第十七页，共49页。最为准确最为准确(zhnqu)的相的相对定量结果对定量结果第17页/共50页第十八页，共49页。校准样本校准样本(yngbn)(yngbn)校准后的浓度比校准后的浓度比 = = ET CpT (C) - CpT (S) X ER CpR (S) -

10、 CpR (C) ET CpT (C) - CpT (S) X ER CpR (S) - CpR (C) 第18页/共50页第十九页，共49页。20第19页/共50页第二十页，共49页。21第20页/共50页第二十一页，共49页。22Select appropriate run protocole.g., for detection of FAM “Mono Color Hydrolysis Probe - UPL Probe” 第21页/共50页第二十二页，共49页。23CombinationnStep 2:Select SamplesnStep 3:Enter properties and

11、define identifiers第22页/共50页第二十三页，共49页。24PropertyPropertyValid ValuesValid ValuesDescriptionDescriptionSample NameAlphanumeric value (25 characters)Default value is “Sample #”Name of material of interestSample Type Unknown PositiveControl/Calibrator Negative Control Standardmandatorymandatory Type of

12、 sampleTarget Type Target Reference UnassignedmandatorymandatoryType of targetUnassigned: excluded from calculationsTarget NameAlphanumeric value (25 characters)Default value is blankName of the gene target第23页/共50页第二十四页，共49页。25第24页/共50页第二十五页，共49页。26点选 Target Name:激活所指定的 target点击(din j)Show Abs Quan

13、t调整 Noise Band点击(din j) Calculate点击(din j) Back to Rel Quant第25页/共50页第二十六页，共49页。27第26页/共50页第二十七页，共49页。28第27页/共50页第二十八页，共49页。29第28页/共50页第二十九页，共49页。30第29页/共50页第三十页，共49页。31选中目的基因的名字(mng zi)然后点击Show Abs Quant 查看并调整相关基因的扩增结果Crossing Points ResultsReplicate StatisticsDisplayEfficiency第30页/共50页第三十一页，共49页。3

14、2第31页/共50页第三十二页，共49页。33第32页/共50页第三十三页，共49页。34第33页/共50页第三十四页，共49页。35BasicBasicAdvancedAdvancedmultiple target and reference genes?YYT/R pairing rulesAll to Meanall 4calibrator allowed?YYT and R genes on different plate?NYsubset allowed?NYCp analysis methodsFit pointFit point and 2nd Der. Maxstandard

15、curve samples allowed?YYefficiency correction?YYmultiplex possible?YY第34页/共50页第三十五页，共49页。36第35页/共50页第三十六页，共49页。37相对定量相对定量(dngling) 实验设计实验设计- 主要因素主要因素1. 实验实验(shyn)设计设计确定研究的目的基因确定研究的目的基因 选定合适的内参基因（最好能多选取几个）选定合适的内参基因（最好能多选取几个）优化反应条件优化反应条件 选择合适的样本及样本制备方法选择合适的样本及样本制备方法(包括对照样本的选取包括对照样本的选取)2. 实验实验(shyn)验证验

16、证确定实验确定实验(shyn)的效果的效果 (动态范围动态范围& 效率效率)3. 分析方法的选择分析方法的选择简单相对定量分析简单相对定量分析高级相对定量分析高级相对定量分析第36页/共50页第三十七页，共49页。38第37页/共50页第三十八页，共49页。39不同的检测模式不同的检测模式(e.g. SYBR Green I) and reference (e.g. HybProbe format)n目的基因和内参基因进行多重目的基因和内参基因进行多重PCR扩增扩增 (dual color) 多重荧光扩增会降低动多重荧光扩增会降低动力学范围力学范围比较单色扩增和双色扩比较单色扩增和双色

17、扩增时目的基因与内参基因的动增时目的基因与内参基因的动力学范围力学范围第38页/共50页第三十九页，共49页。40效率效率(xio l)(xio l)影响因子Determination of a correction factor and/or a multiplication factor单色 (目的基因和内参基因在不同的反应管或反应孔)双色 (目的基因和内参基因在同一个的反应管或反应孔)flexible Pairing“ of target and reference samples (multiple housekeeping genes)反应的设置反应的设置校准样本校准样本选择合适的校

18、准样本第39页/共50页第四十页，共49页。41Established LightCycler PCR for target and reference geneDetermination of a calibratorLC run with samples and calibrator (target/reference)AnalysisBasicAdvanced第40页/共50页第四十一页，共49页。421.1. ExperimentExperiment DesignDesign Identification of the target gene(s) of interest and su

19、itable reference gene(s)e.g.:target 1, target 2housekeeping gene (HK) 1, housekeeping gene (HK) 2Optimization of reaction conditionse.g.:use LightCycler 480 Probes Master together with UPL probe and primersselect the appropriate run protocol (make use of “New Experiment from Template”)Selection and

20、preparation of sample material, including a calibrator samplee.g.:untreated sample (= calibrator)5 samples treated with different agents always include a NTCstart with cDNA prepared by Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (2-step RT-PCR)Set up experimente.g.:monocolor reactiontarget and HK P

21、CR on one MWP第41页/共50页第四十二页，共49页。432.2. ExperimentExperiment ValidationValidationDetermination of assay quality (dynamic range & efficiency) for each target and each reference gene3.3. MethodMethod SelectionSelection forfor AnalysisAnalysisBasic Analysisfast tracking solution for well performing

22、 assaysconvenient CT MethodAdvanced Analysishigh confidence solution for most challenging assays! particular E-Method benefit of standard curves (linear, non-linear standard curve fitting; fixed dynamic range)benefit of in-run standard (inter-assay calibration)第42页/共50页第四十三页，共49页。44第43页/共50页第四十四页，共4

23、9页。45第44页/共50页第四十五页，共49页。46Basic Analysisone clickFinal ResultAdvanced AnalysisFinal Resultdefine analysis settingsselect various parameters like quant type,standard curves pairing rule,reference runsubset editing adjustmentscombinable as templateadjustments第45页/共50页第四十六页，共49页。47Basic AnalysisAdvanc

24、ed Analysistarget and reference on same platefull plate analyzedAssay Set Uptarget and reference on same plateor on different plates full plate and/or subsets analyzedfixed pairing rulePairingflexible, editable pairing rulesin run or external standardsno standardsStandards(target / reference)in run

25、or external standardsno standardsstandard curves (linear, non-linear, fixed dynamic range); E = 2, or editable efficiency valuesEfficiencystandard curves (linear, non-linear, fixed dynamic range)E = 2, or editable efficiency valuesFit Points MethodCp Analysis2nd Derivative Max Method or Fit Pointsused & accepted approach Definitionscientifically sound approacheasy access to relative quantification data for routine applicationsCharacteristicshighest flexibility and reliability for most demanding applicationsunmatched fast tracking