工科硕士答辩学术汇报PPT

1、xxxxxxxxx菌菌菌菌菌菌XXXXXX酶酶酶酶酶酶基因工程菌的构建与发酵优化基因工程菌的构建与发酵优化基因工程菌的构建与发酵优化基因工程菌的构建与发酵优化基因工程菌的构建与发酵优化基因工程菌的构建与发酵优化硕士学位论文答辩硕士学位论文答辩硕士学位论文答辩硕士学位论文答辩硕士学位论文答辩硕士学位论文答辩碱性果胶酶碱性果胶酶 (PGL,E.C. 4.2.2.2)可在高可在高pH条件下以反式消去作用断条件下以反式消去作用断开果胶聚合物主链开果胶聚合物主链,裂解产物为裂解产物为4:5不饱和的寡聚半乳糖醛酸不饱和的寡聚半乳糖醛酸碱性果胶酶概述碱性果胶酶概述碱性果胶酯裂解酶主要来源于细菌和霉菌碱性果胶

2、酯裂解酶主要来源于细菌和霉菌,其其中细菌以中细菌以Bacillus和和Erwinia为主为主纺织行业纺织行业不同来源的不同来源的PGL分子量差别较大分子量差别较大,范围为范围为23-74kDa,最适最适pH 为为8-11,其生化特性的差异可其生化特性的差异可能是多种形式果胶存在的原因能是多种形式果胶存在的原因其他领域其他领域食品行业食品行业纺织品前处理的酶法工艺流程纺织品前处理的酶法工艺流程l 生物法节能、水,低污染l 提高产品质量l 环境污染和能源危机l 纺织工业高污染、高能耗SingeingDesizing ScouringBleaching退浆退浆 精练精练角质和果胶质角质和果胶质漂白漂

3、白淀粉酶淀粉酶/PVA降解酶降解酶角质酶角质酶/碱性果胶酶碱性果胶酶过氧化氢酶过氧化氢酶上浆上浆碱性果胶酶概述碱性果胶酶概述国内外碱性果胶酶基因工程菌研究情况国内外碱性果胶酶基因工程菌研究情况宿主宿主载体载体培养策略培养策略发酵发酵时间时间(h)DCW(g L-1)PGL 酶活酶活(U ml-1)生产生产强度强度(U L-1h-1)参考文献参考文献P. pastoris X-33Invitrogen摇瓶发酵120N.S.20 to0.2(Liu et al., 2006)P. pastoris GS 115 Invitrogen山梨醇和甲醇混合流加低温诱导 961431593 to16.7(W

4、ang et al., 2010)E. coli BL21 (DE3)pET22b(+)DO-stat 甘油流加培养温度37 oC13837 a,b, ex2.8(Matsumoto et al., 2002)E. coli Turner (DE3) plac IpET28a(+)摇瓶发酵诱导温度20 oC60N.S.360 b,in6.0(Zhao et al., 2007)E. coli JM109pHsh分批发酵温度诱导型菌株252022 ex0.9(Zhuge et al., 2007)毕赤酵母毕赤酵母 发酵周期长 工艺流程复杂 低温诱导能耗高原核表达体系原核表达体系 酶活水平高 工艺

5、流程简单 发酵周期短异源蛋白异源蛋白分泌表达分泌表达目的蛋白目的蛋白自身特性自身特性过程过程控制控制策略策略表达表达系统系统特性特性培养基组成培养基组成流加策略流加策略诱导方法诱导方法重组大肠杆菌的分泌表达重组大肠杆菌的分泌表达异源蛋白异源蛋白分泌表达分泌表达目的蛋白目的蛋白自身特性自身特性过程过程控制控制策略策略表达表达系统系统特性特性培养基组成培养基组成流加策略流加策略诱导方法诱导方法重组大肠杆菌的分泌表达重组大肠杆菌的分泌表达生物量比产率分泌比率After胞外胞外PGL胞内胞内PGL包涵体包涵体胞外胞外PGL胞内胞内PGL包涵体包涵体Before研究思路研究思路大肠杆菌大肠杆菌枯草芽孢杆

6、菌枯草芽孢杆菌摇瓶水平摇瓶水平发酵罐水平发酵罐水平摇瓶水平摇瓶水平1. 碱性果胶酶基因在大碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达肠杆菌中的克隆与表达2. 影响重组大肠杆菌胞影响重组大肠杆菌胞外生产外生产PGL的关键因素的关键因素3.1 重组大肠杆菌两阶重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究段甘油流加策略的研究3.2 流加培养过程诱导流加培养过程诱导时机的研究时机的研究4. 碱性果胶酶基因在碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达枯草芽孢杆菌中的表达5. 重组碱性果胶酶重组碱性果胶酶粗酶性质的初步研究粗酶性质的初步研究原核宿主表达体系原核宿主表达体系菌体量菌体量比生产比生产分泌比率分泌比率1. 碱性果

7、胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达Digestion and ligationATGpET20b(+)/pglpglFnew-S/Fnew-APCRATGTAABacillus sp. WSHB04-02 genomic DNApgl 1.2 KbPGL基因PCR扩增片段鉴定 重组质粒酶切验证(bp)20001000750 1 M 26371208(bp)20001000750 1 M 1. 小结小结发酵上清SDS-PAGE电泳分析PL(43kDa)116.043 kDa PGL(kDa)66.245.035.025.018.41 M 将PGL-1638序列

8、进行测序,得到Bacillus sp. WSHB04-02的PGL相关1638 bp的基因,将其CDS部分(1263 bp)在NCBI进行BALST分析,表明本研究克隆到的PGL基因与Bacillus subtilis SO113(NCBI Accession NO. X74880)的该基因同源性为98%,具有14个差别核苷酸. 将载体pET-20b(+)/pgl转化E. coli BL21(DE3),得到基因工程菌E. coli BL21(DE3) (pET-20b(+)/pgl) ,且测序结果和SDS-PAGE结果证实了该表达载体中所插入基因编码的氨基酸序列完全正确 .研究思路研究思路大肠

9、杆菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌摇瓶水平摇瓶水平发酵罐水平发酵罐水平摇瓶水平摇瓶水平1. 碱性果胶酶基因在大碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达肠杆菌中的克隆与表达2. 影响重组大肠杆菌胞影响重组大肠杆菌胞外生产外生产PGL的关键因素的关键因素3.1 重组大肠杆菌两阶重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究段甘油流加策略的研究3.2 流加培养过程诱导流加培养过程诱导时机的研究时机的研究4. 碱性果胶酶基因在碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达枯草芽孢杆菌中的表达5. 重组碱性果胶酶重组碱性果胶酶粗酶性质的初步研究粗酶性质的初步研究原核宿主表达体系原核宿主表达体系菌体生长菌体生长目的蛋白表达量

10、目的蛋白表达量分泌比率分泌比率2.1 初始培养基的选择Culture mediaDCW(gcell L-1)Extracellular activity (U ml-1)Specific productivity (U gcell-1)Secretion capability (%)LB4.87.91.637.92YT5.810.41.732.6SOC7.413.71.842.6TB11.528.72.554.8SB12.125.92.153.9l 采用在TB培养基作为发酵培养基,胞外PGL酶活到达28.75 U ml-1,分别是LB培养基的3.6倍和SB培养基的1.1倍.TB培养基和SB培养

11、基中,比生产率(胞外酶活/DCW)和分泌率(胞外酶活/总酶活)基本相当,LB、2YT和SOC培养基稍低 .2. 影响重组大肠杆菌胞外生产影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素的关键因素酵母粉:蛋白胨安琪酵母粉(g)蛋白胨试剂(g)DCW (gcell L-1)PGL酶活(U ml-1)1 : 036018.18.73 : 1278.223.79.32 : 12410.927.512.71 : 11816.422.914.21 : 21221.819.713.91 : 3924.516.511.90 : 103213.89.9氮源含氮量添加克数(g)干重 (gcell L-1)PGL酶活 (U

12、 ml-1)氮源种类对照-112.2526.38分子级对照-213%2810.215.8分子级胰蛋白胨12%307.83.7试剂级工业级蛋白胨10%368.44.3工业级蛋白胨试剂11%329.913.8试剂级大豆蛋白胨9%4011.110.3试剂级安琪酵母10%368.718.1工业级酵母浸膏7%519.19.7试剂级牛肉浸膏8%4511.37.32试剂级2.2 氮源对工程菌生长与产酶情况的影响2. 影响重组大肠杆菌胞外生产影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素的关键因素l 以安琪酵母粉和大豆蛋白胨为组合碳源,维持总氮量不变,考察不同配比对菌体生长与PGL合成的影响.确定氮源组成为:安琪酵

13、母粉24 g L-1 、蛋白胨试剂11 g L-1. Optimal carbon source :glycerol Optimal optical concentration :10 g L-1 2. 影响重组大肠杆菌胞外生产影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素的关键因素2.4 碳源对工程菌生长与产酶情况的影响Extracellular PGL activity , DCW , Specific productivity .l 以甘油、葡萄糖为碳源时,菌体干重分别达到11.5 和13.1 g L-1,胞外酶活分别为28.1和 28.8 U ml-1,显著高于其他三种碳源.l 但以葡萄糖为

14、碳源时工程菌产酶不稳定.l 10 g L-1甘油较适合菌体生长和PGL的胞外分泌,胞外PGL酶活与DCW分别为34.2 U mL-1 和13.6 g L-1.l 继续增加甘油含量对菌体生长和PGL合成影响不明显.Metal ionsAdding Mode(OD600)Concentration (mM)Extracelullar PGL(U ml-1)Intracelullar PGL(U ml-1)Biomass(OD600)Con-trol00113.53.625.4 Ca2+00.197.93.214.410.61114.510.920.4 5128.813.419.920142.514

15、.820.1Fe3+00.195.93.018.80.61107.211.323.55110.710.821.620130.913.121.2Mg2+00.183.94.710.20.61101.310.614.95105.911.013.120120.612.610.52. 影响重组大肠杆菌胞外生产影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素的关键因素2.3 金属离子对重组大肠杆菌生长与PGL合成的影响 在接种同时加入Ca2+ 等微量金属元素(0.1 mM),对菌体生长造成明显影响,PGL产量也随之降低. 在OD=0.6时, 加入20 mM的Fe3+ 或Mg2+对PGL胞外积累具有促进作用,与对

16、照相比分别提高15.4%和6.2%,但菌浓分别下降16.5%与19.7%. Ca2+的促进作用最为明显, 浓度升高作用越为显著,添加1mM、5mM和20mM ,PGL胞外酶活分别提升0.17%、13.5%和25.5%.2.4 诱导条件重组PGL胞外生产的影响2. 影响重组大肠杆菌胞外生产影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素的关键因素 PGL productivity was the highest at around 50 M of IPTGExtracellular PGL activity , intracellular PGL activity , DCW . 22 oC诱导时 ,P

17、GL胞外酶活仅8.5 U ml-1,分泌率为47.7%,均为5者中最低. 30 oC时,细胞干重13.6 g L-1,分别是22 oC和26 oC 诱导的1.57倍和1.22倍. 然而,高生物量并没有带来高产量. 26 oC诱导达到蛋白合成与转运最佳平衡,胞外酶活65.8U ml-1,是 30 oC时的1.39倍,胞外分泌率达66.4%. IPTG对菌体生长有一定抑制作用,与对照相比,菌体干重下降约15%. 当IPTG浓度超过20 M,PGL总酶活反而降低. 添加50 M IPTG时,PGL总酶活最高,达到165.82 U mL-1,胞外分泌率76.8%. Induction at 26 le

18、d to a better coordination between protein synthesis and translocation IPTG添加浓度对PGL分布的影响 随IPTG浓度由0升至400 M,相同生物量对应的不溶性包涵体逐渐增加. 其浓度为50 M时,可溶目的蛋白比例较高. 条带1,2,3 (cs):胞外组分 条带5,6,7 (si):胞内与周质可溶组分 条带8,9,10 (ii):胞内与周质不溶组分2. 影响重组大肠杆菌胞外生产影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素的关键因素v 为提高重组为提高重组E. coli BL21(DE3)发酵生产碱性果胶酶的产量和胞发酵生产碱

19、性果胶酶的产量和胞外分泌率外分泌率,在摇瓶中优化了重组大肠杆菌生产碱性果胶酶的关在摇瓶中优化了重组大肠杆菌生产碱性果胶酶的关键因素键因素,确定了其胞外表达的最适条件确定了其胞外表达的最适条件.发酵结束时菌体干重达发酵结束时菌体干重达11.8 g L-1,PGL 胞外酶活达胞外酶活达165.8 U mL-1 ,胞外分泌率为胞外分泌率为76.8%.v 最适培养基为最适培养基为:安琪酵母粉安琪酵母粉24 g L-1、蛋白胨试剂、蛋白胨试剂11 g L-1、甘油、甘油 10 g L-1、K2HPO4 72 mM、KH2PO4 17 mM.v 最适诱导条件为最适诱导条件为:诱导温度为诱导温度为26 oC

20、,添加添加0.05 mM IPTG诱导表诱导表达达48 h.v 在在OD600=0.6时添加一定浓度时添加一定浓度Ca 2+、Fe 3+与与 Mg 2+,对对PGL的可的可溶表达具有促进作用溶表达具有促进作用.2. 小结小结研究思路研究思路大肠杆菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌摇瓶水平摇瓶水平发酵罐水平发酵罐水平摇瓶水平摇瓶水平1. 碱性果胶酶基因在大碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达肠杆菌中的克隆与表达2. 影响重组大肠杆菌胞影响重组大肠杆菌胞外生产外生产PGL的关键因素的关键因素3.1 重组大肠杆菌两阶重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究段甘油流加策略的研究3.2 流加培养过程诱导流

21、加培养过程诱导时机的研究时机的研究4. 碱性果胶酶基因在碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达枯草芽孢杆菌中的表达5. 重组碱性果胶酶重组碱性果胶酶粗酶性质的初步研究粗酶性质的初步研究原核宿主表达体系原核宿主表达体系菌体生长菌体生长目的蛋白表达量目的蛋白表达量分泌比率分泌比率3.1 重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究指数流加策略DCW () , glycerol feeding rate (), glycerol () ,acetate()7.7 g L-113.9 g L-1 指数流加9 h后甘油残留浓度达到13.9 g L-1.诱导期乙酸积累量高达7.7

22、 g L-1. 当其浓度高于2.0 g L-1时,会抑制细胞生长与重组蛋白的合成. 初始甘油浓度为10 g L-1 ,培养温度为37 oC. 当DO反弹甘油耗尽后, 进行指数流加, set=0.20 h-1. 当细胞干重达到15 g L-1,加入 0.05 mM IPTG,同时将培养温度降至26 oC,开始诱导PGL表达.set=0.2h146.2 g L-133.8 U mL-1 菌浓大幅提升，指数流加9小时菌体干重攀升至46.2 g L-1. 但PGL胞外酶活在18处达到峰值,仅为33.8 U mL-1.3.1 重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究指数流

23、加策略DCW () , glycerol feeding rate (), glycerol () ,acetate() 当诱导开始后,实际比生长速率(exp) 明显低于设定比生长速率(set).若在诱导期采用低速流加以减缓营养物质的累积,可能有助于提高重组PGL的胞外产量. 30 h时细胞干重达到峰值41.3g L-1,比指数流加降低10.5%. 诱导期甘油与乙酸积累水平显著降低,分别维持在1.0 g L-1 和 0.7 g L-1以下.DCW () , glycerol feeding rate (), glycerol () ,acetate()3.1 重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研

24、究重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究两阶段流加策略set=0.2h112 ml h-10.7 g L-11.0 g L-143.1 g L-1 诱导前(菌体生长阶段),指数流加,set=0.20 h-1. 当细胞干重达到15 g L-1,加入 0.05 mM IPTG,同时将培养温度降至26 oC,开始诱导PGL表达. 诱导后(PGL表达阶段) ,甘油流加速率为恒定的12 ml h-1. 高密度诱导时,菌体生长没有受到明显影响,最大细胞干重为44.6 g L-1 . 生长后期诱导虽然对菌体生长没有显著影响,但胞外产酶能力却为三者中最低,胞外酶活仅为93.72 U mL-1. 菌体干重、胞外酶

25、活与胞内酶活分别为41.0 g L-1 、 257.8 U mL-1 和 114.1 U mL-1. 在中密度诱导时,PGL合成水平最高,总酶活在培养20 h至48 h的过程中大幅攀升,峰值为371.9U mL-1. 在细胞生长初期诱导,菌体生长受到明显抑制,发酵21h达到最高菌浓21.7 g L-1. 严重的生长抑制导致PGL合成水平大幅下降,发酵24小时胞外酶活为114.9U mL-1.257.8 U mL-141.0 g L-13.2 流加培养过程诱导时机的研究流加培养过程诱导时机的研究371.9 U mL-1BiomassExtracellular PGLTotal PGLlow ce

26、ll density ( 7.5 g L-1),intermediate (15 g L-1), high ( 30 g L-1)v 针对指数流加过程中出现的针对指数流加过程中出现的,诱导后甘油残留、乙酸大量积累现象诱导后甘油残留、乙酸大量积累现象,采用采用甘油两阶段流加策略甘油两阶段流加策略.v 为进一步缓解诱导对微生物产生的负面作用为进一步缓解诱导对微生物产生的负面作用,分别在重组菌生长的对数分别在重组菌生长的对数前期、中期与末期起始诱导前期、中期与末期起始诱导,考察了不同诱导时机对重组大肠杆菌分泌考察了不同诱导时机对重组大肠杆菌分泌表达表达PGL的影响的影响.v 诱导前诱导前(菌体生长阶

27、段菌体生长阶段),控制温度为控制温度为37 ,待甘油耗尽待甘油耗尽,开始指数流加甘油开始指数流加甘油(set=0.2 h-1), 直到菌体干重达到直到菌体干重达到15 g L-1;诱导后诱导后(PGL高表达阶段高表达阶段),将温将温度降低为度降低为26 ,同时加入同时加入0.05 mM IPTG,以以12 mL h-1的速率进行甘油流的速率进行甘油流加加,以通气量和搅拌转速控制以通气量和搅拌转速控制DO为为30%.v 发酵结束时发酵结束时PGL 总酶活达到总酶活达到371.86 U mL-1,生产强度达到生产强度达到7.1 U mL-1 h-1,胞外分泌比为胞外分泌比为69.3%.实现了实现了

28、PGL 的高产量和高生产强度分泌表达的高产量和高生产强度分泌表达,是大是大肠杆菌体系中已报道最高水平肠杆菌体系中已报道最高水平.3. 小结小结研究思路研究思路大肠杆菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌摇瓶水平摇瓶水平发酵罐水平发酵罐水平摇瓶水平摇瓶水平1. 碱性果胶酶基因在大碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达肠杆菌中的克隆与表达2. 影响重组大肠杆菌胞影响重组大肠杆菌胞外生产外生产PGL的关键因素的关键因素3.1 重组大肠杆菌两阶重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究段甘油流加策略的研究3.2 流加培养过程诱导流加培养过程诱导时机的研究时机的研究4. 碱性果胶酶基因在碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆

29、菌中的表达枯草芽孢杆菌中的表达5. 重组碱性果胶酶重组碱性果胶酶粗酶性质的初步研究粗酶性质的初步研究原核宿主表达体系原核宿主表达体系菌体生长菌体生长目的蛋白表达量目的蛋白表达量分泌比率分泌比率PlasmidPromoterCharacteristicsSignal PeptideReplicon(Bacillus)CopyNumberpMA0911 PHpaII from pUB110ConstitutiveSamyX from Bacillus amyloliquefasciensfrom pUB110 Rolling-circle 30-50pHT43Pgracconsisting of

30、groE & laO operator with lacInduced by IPTGSamyQ from Bacillus amyloliquefasciensfrom pBS72 ThetaLow pP43NMKPHpaII&P43 compoundConstitutiveSnprB gene from B.subtilis 168from pUB110Rolling-circle30-504. 碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 Nde I / Sal I digestion LigationNde ISal ISP of PGLpgl(sp)128

31、1 bpPGL8372 bppMAN-S/pMAN-APCRBacillus sp. WSHB04-02 genomic DNApMA/pgl(sp)4. 碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达Kpn I / Hind III digestionLigationKpn IHind IIIRBS from pP43NMKpgl(sp)1283 bppNMK-KHS/pNMK-KHAPCRBacillus sp. WSHB04-02 genomic DNApP43NMK/pgl(sp)4. 碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达P

32、st I / Hind III digestionLigationPst I Hind IIIRBS from pP43NMKpgl1247 bpRBSpP43NMK/pglpNMK-PHS/pNMK-PHAPCRBacillus sp. WSHB04-02 genomic DNA4. 碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达Linearized at Aat II+Fast PCR Clone Kit9274 bpAat IIBam HIpgl1241 bppHT43-S/pHT43-APCRBacillus sp. WSHB04-02 genomic DNA

33、4. 碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达4. 小结小结116.0 4 1 M 0 2 3(kDa)66.245.035.025.018.443 kDa PGLbp20001000750 1 2 3 4 M 1273 PGL基因琼脂糖凝胶电泳图700050040002000 1000 6672 1273 M1 1 2 3 4 M 21000750枯草芽孢杆菌表达载体酶切电泳验证0: B. subtilis WB600/pMA;1: B. subtilis WB600/pMA/pgl(sp);2: B. subtilis WB600/pP43NMK/pgl(s

34、p); 3: B. subtilis WB600/pP43NMK/pgl ;4: B. subtilis 168/pHT43/pgl; 枯草芽孢杆菌重菌株发酵上清SDS-PAGE分析4. 小结小结B. subtilis StrainPGL Activity(U mL-1)OD600(45h)WB600/pMA/pgl(sp)28.7 27.3168/pHT43/pgl1.7 8.4WB600/pP43NMK/pgl 0.610.1WB600/pP43NMK/pgl(sp)2.3 13.9WB600/pMA0.4 23.8 质粒pP43NMK含有PHpaII与P43复合启动子,具有较高的启动强度

35、,拷贝数较高,为30-50.但质粒自身可能存在隐性问题,本实验室采用该质粒进行其他蛋白表达时均未成功. 原因有待进一步探究,猜想可能的原有有: pHT43虽含有Theta复制子,具有较好的分离稳定性,但胞内拷贝数偏低,为10以下,目的蛋白不易大量表达. 该质粒含有氯霉素抗性,无法在宿主WB600中应用,本研究选择B. subtilis 168作为该质粒宿主,但与WB600相比,B. subtilis 168自身产生的蛋白酶种类与数量较多,外源蛋白可能受到了比较严重的蛋白酶降解,从而无法积累.研究思路研究思路大肠杆菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌摇瓶水平摇瓶水平发酵罐水平发酵罐水平摇瓶水平摇瓶水平1. 碱性果胶酶基因在大碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达肠杆菌中的克隆与表达2. 影响重组大肠杆菌胞影响重组大肠杆菌胞外生产外生产PG