微生物的培养与应用

1、1课题课题1 1 微生物的实验室培养微生物的实验室培养2 了解有关培养基的基础知识，进行无了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。菌技术的操作，进行微生物的培养。 一、课题目标：一、课题目标： 掌握掌握培养基的制备培养基的制备、高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌和和平板划线法平板划线法等基本操作技术，熟练、规范等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：二、课题重点和难点：三、技能目标：三、技能目标：课题课题1 1 微生物的实验室培养微生物的实验室培养3一、基础知识 微生物微生物

2、: :1.1.特点：结构都相当简单特点：结构都相当简单, ,个体多数十分微小个体多数十分微小. .通常要通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构有细胞结构. .且体内一般不含有叶绿素且体内一般不含有叶绿素. .不能进行光不能进行光合作用合作用. .2.微生物包括五类微生物包括五类病病 毒毒细细 菌菌放线菌放线菌真真 菌菌原生动物原生动物4菌落： 单个或少数细菌在固体培养单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫形态结构的子细胞群体

3、，叫做菌落做菌落。 不同的细菌的菌落特征不同不同的细菌的菌落特征不同 菌落是鉴定菌种的重要依据菌落是鉴定菌种的重要依据5固体培养基：菌落，菌苔固体培养基：菌落，菌苔61、定义、定义 为人工培养微生物而制备的、提供适合为人工培养微生物而制备的、提供适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。质。2、分类、分类 天然培养基天然培养基培养基中化学成分分：培养基中化学成分分： 合成培养基合成培养基 半合成培养基半合成培养基(二二)、培养基、培养基7 液体培养基液体培养基按物理形态分：按物理形态分： 固体培养基固体培养基 半固体培养基半固体培养基 、常用的固体培养

4、基、常用的固体培养基: 琼脂固体培养基琼脂固体培养基. 、微生物在固体培微生物在固体培养基表面生长养基表面生长,可以形可以形成成 肉眼可见的肉眼可见的菌落菌落. 基础培养基基础培养基按培养基功能分：按培养基功能分： 选择培养基选择培养基 鉴别培养基鉴别培养基 8选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基: : 分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基: : 分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基: : 分离固氮菌分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基: : 分离自养型微生物分离自

5、养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基: : 分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因的受体细胞 加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的核苷的培养基培养基: : 分离杂交瘤细胞分离杂交瘤细胞93、培养基内所含的基本物质、培养基内所含的基本物质(1)、水(2)、碳源 (3)、氮源(4)、无机盐10(2)碳源碳源可作为碳源的物质有可作为碳源的物质有:含碳无机物含碳无机物: 、 、含碳有机物：含碳有机物：蛋白蛋白质质 脂肪酸脂肪酸返回返回 不同微生物所利用的碳源不同不同微生物所利用的碳源不同 异养型微生物的碳源为异养型微生物的碳源为 自

6、养型微生物的碳源为自养型微生物的碳源为碳酸盐碳酸盐碳酸氢盐碳酸氢盐二氧化碳二氧化碳糖类（主要）糖类（主要）含碳有机物（有机碳）含碳有机物（有机碳）含碳无机物（无机碳）含碳无机物（无机碳）11(3)氮源氮源可作为氮源的物质有可作为氮源的物质有:含氮无机物：含氮无机物： 、 、 、含氮有机物：含氮有机物：蛋白胨蛋白胨牛肉膏牛肉膏尿素尿素返回返回 固氮微生物所利用的氮源是固氮微生物所利用的氮源是氮气氮气 氨气氨气硝酸盐硝酸盐氨盐氨盐氮气氮气12(1)、pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性(2)、特殊营养物质- ?如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素(3)、氧气的含量如:培养厌氧微生物

7、时需要提供无氧的条件4、培养基内所需的其他条、培养基内所需的其他条件件生长因子生长因子13无菌技术包括的四大方面无菌技术包括的四大方面1、对实验操作的空间、操作者的衣着和手，、对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。进行清洁和消毒。2、将用于微生物培养的器皿、接种用具和培、将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。养基等器具进行灭菌。3、为避免周围环境中微生物的污染，实验操、为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。作应在酒精灯火焰附近进行。4、实验操作时应避免已经灭菌处理的饿材料、实验操作时应避免已经灭菌处理的饿材料用具与周围的物品相接触。用具与

8、周围的物品相接触。返回返回14(三三)、无菌技术、无菌技术1、获得纯净培养物的关键、获得纯净培养物的关键: 2、无菌技术包括的四大方面无菌技术包括的四大方面3、消毒与灭菌、消毒与灭菌(1)消毒：消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢和孢子吗？和孢子吗？方法方法:煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒如牛奶的消毒化学药剂消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等 紫外线消毒紫外线消毒(不包括芽孢和孢

9、子不包括芽孢和孢子)防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵15（2）灭菌）灭菌概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。微生物，包括芽孢和孢子。方法：方法：a 灼烧灭菌灼烧灭菌 b 干热灭菌干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 灼烧灭菌灼烧灭菌微生物的接种工具微生物的接种工具 (接接种环、接种针种环、接种针)或其或其他金属用具直接在火他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧焰的充分燃烧层灼烧注意适用范围注意适用范围16 干热灭菌干热灭菌 160170 ；12h能耐高温的需要保持干能耐高温的需要保持干燥的物品燥的物品( 玻璃器皿玻璃器

10、皿) 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min通常用于培养基的灭通常用于培养基的灭以手提式灭菌锅最为常用以手提式灭菌锅最为常用 .171.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。如果需要，请选择合适的方法。（1 1） 培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3） 实验操作者

11、的双手实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。18思考:1)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？生物污染外，还有什么目的？ 2)消毒和灭菌有何不同？消毒和灭菌有何不同？3)为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?4)请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。需要，请选择合

12、适的方法。培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管实验操作者的双手实验操作者的双手消毒消毒灭菌灭菌条件条件温和温和强烈强烈作用作用范围范围物体表面或内部一部物体表面或内部一部分分,不包括芽孢和孢子不包括芽孢和孢子物体内外所有微生物物体内外所有微生物,包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。灭菌灭菌 灭菌灭菌 消毒消毒营养成分不被破坏营养成分不被破坏19 二、实 验 操 作 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏蛋白胨固体培养基配方物质物

13、质牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨NaClNaCl琼脂琼脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定溶至定溶至1000mL1000mL2.2.称量称量 按比例称取各种物质。按比例称取各种物质。注意：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨注意：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。203.3.溶化：溶化：4.4.灭菌：灭菌：5.5.倒平板：倒平板： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻

14、璃水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加水拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加水定溶至定溶至100mL100mL。 将配制好培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，将配制好培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（包上牛皮纸），连同培养皿（3 35 5套，用几层报纸套，用几层报纸包好）一起放到高压锅内灭菌。包好）一起放到高压锅内灭菌。 待培养基冷却到待培养基冷却到5050左右时倒平板。左右时倒平板。2122倒平板操作的讨论 1. 1.培养基灭菌后

15、要冷却到培养基灭菌后要冷却到5050时倒平板。时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？用什么办法来估计培养基的温度？ 2. 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。时即可开始倒平板。 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。养基。23 3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培

16、养微生皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？物吗？为什么？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。微生物。倒平板操作的讨论24 纯化大肠杆菌

17、微生物接种方法常见的有平板划线法和稀微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。释涂布平板法。1.1.平板划线法平板划线法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。基的表面。 在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落菌落。261、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？环？在划线操作结束

18、时，仍然需要灼烧接种环？ 第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；的微生物污染培养物；平板划线法的讨论 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。便得到菌落。 划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种划线

19、结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。272.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？进行划线？平板划线法的讨论3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？总是从上一次划线的末端开始划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。 划线后，线条末端细菌数比线条起始处划线后，线条末端细菌数比线条起始处要少，每次从上一次划线末端开始，能使细要少，每次从上一次划线末端开

20、始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.2.稀释涂布平板法稀释涂布平板法292.2.稀释涂布平板法稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。表面进行培养。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。面形成单个的

21、菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤稀释涂布平板法操作过程分两个步骤: :系列稀释操作系列稀释操作涂布平板操作涂布平板操作系列稀释操作系列稀释操作101102103104105106(1)(1)将分别盛有将分别盛有9mL9mL水的试管灭菌并编号。水的试管灭菌并编号。(2)(2)用移液管吸取用移液管吸取1mL1mL培养的菌液，注入第二支试管中，培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。(3)(3)从从10101 1倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL1mL稀释液，注入第三支稀释液，注入第三支试管中，重复步骤试管中，重复步骤2 2，直

22、至到第六支试管。，直至到第六支试管。32涂布平板操作涂布平板操作(1)(1)将涂布器浸在盛有将涂布器浸在盛有7070的酒精的烧杯中。的酒精的烧杯中。(2)(2)取少量菌液（不超取少量菌液（不超0.1mL0.1mL），滴加到培养基表），滴加到培养基表面。面。(3)(3)将沾有酒精的涂布器将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄在火焰上引燃，火熄后冷却后冷却8 810s10s。(4)(4)用涂布器将菌液均匀用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。地涂布在培养基表面。2.2.稀释涂布平板法稀释涂布平板法34涂布平板操作讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平

23、板划线与系列稀释的无菌操作要求，想结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第二步应如何进行无菌操作？一想，第二步应如何进行无菌操作？ 将接种后和未接种（作为对照组）的培养基将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到均放到3737的恒温箱中，培养的恒温箱中，培养121224h24h后观察并后观察并记录结果。记录结果。 应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。如。如: :酒酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。35 1.1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？菌落生长，说明了什么？ 2.2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似？的菌落？它们的大小、形状、颜色相似？ 未接种