体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证学习教案

1、会计学1体内药物分析常用体内药物分析常用(chn yn)生物样品生物样品处理方法和方法学验证处理方法和方法学验证第一页，共64页。2第2页/共64页第二页，共64页。3第3页/共64页第三页，共64页。460%60%以上精力和花费用在样品以上精力和花费用在样品(yngpn)(yngpn)前处理上前处理上第4页/共64页第四页，共64页。5第5页/共64页第五页，共64页。6第6页/共64页第六页，共64页。7第7页/共64页第七页，共64页。8血浆中含有血浆中含有(hn yu)(hn yu)的物质种类和比的物质种类和比例例第8页/共64页第八页，共64页。9第9页/共64页第九页，共64页。1

2、0第10页/共64页第十页，共64页。11第11页/共64页第十一页，共64页。12第12页/共64页第十二页，共64页。13第13页/共64页第十三页，共64页。141. 1.沉淀蛋白沉淀蛋白(dnbi) PPT(dnbi) PPT2.2.液液萃取液液萃取 LLE LLE3. 3.固相萃取固相萃取 SPE SPE第14页/共64页第十四页，共64页。15有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙睛、氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙睛、甲醇、乙

3、醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。 血浆或血清与有机溶剂的体积比为血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:31:3时，就可以将时，就可以将90%90%以上以上(yshng)(yshng)的蛋白质除去，采用低温高速速离心机的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min16000r/min离离心心10min 10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。便可将析出的蛋白质完全沉淀。第15页/共64页第十五页，共64页。16第16页/共64页第十六页，共64页。17第17页/共64页第十七页，共64页。加入加入(jir)(jir)中性盐中性盐18第18页/共64页第十八页，

4、共64页。1919加入加入(jir)(jir)强酸强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸等。血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去(ch q)蛋白质。在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。第19页/共64页第十九页，共64页。20加入加入(jir)(jir)锌盐或铜盐沉淀剂锌盐或铜盐沉淀剂第20页/共64页第二十页，共64页。21酶解法酶解法(ji f)(ji f)第21页/共64页第二十一页，共64页。22其他的一些去除其他的一些去除(q ch)蛋白质的方法：蛋白质的方法：第22页/共6

5、4页第二十二页，共64页。23第23页/共64页第二十三页，共64页。24第24页/共64页第二十四页，共64页。25第25页/共64页第二十五页，共64页。26第26页/共64页第二十六页，共64页。27第27页/共64页第二十七页，共64页。28第28页/共64页第二十八页，共64页。29第29页/共64页第二十九页，共64页。30第30页/共64页第三十页，共64页。31第31页/共64页第三十一页，共64页。32萃取小柱一次性使用萃取小柱一次性使用(shyng)(shyng)，防止交叉污染！，防止交叉污染！第32页/共64页第三十二页，共64页。33第33页/共64页第三十三页，共64

6、页。34根据根据(gnj)(gnj)原理分类：原理分类：第34页/共64页第三十四页，共64页。35第35页/共64页第三十五页，共64页。36SPESPE方法的优点：方法的优点：1.1.不会发生乳化；不会发生乳化；2.2.适用范围广；适用范围广；3.3.提取效率高；提取效率高；4.4.方便快速，可以一次提取分离多种化合物；方便快速，可以一次提取分离多种化合物；5.5.溶剂溶剂(rngj)(rngj)消耗少；消耗少；6.6.易于实现自动化；易于实现自动化；7.7.离子交换固相萃取利用离子交换原理，同色谱柱的离子交换固相萃取利用离子交换原理，同色谱柱的依据极性大小的分离原理不同，配合使用，可以最

7、大依据极性大小的分离原理不同，配合使用，可以最大限度的分离出药物，去除干扰。限度的分离出药物，去除干扰。目前商品化的固相萃取小柱（目前商品化的固相萃取小柱（cartridgecartridge）已经广泛）已经广泛应用。应用。第36页/共64页第三十六页，共64页。37三种方法三种方法(fngf)(fngf)的比较：的比较：第37页/共64页第三十七页，共64页。38第38页/共64页第三十八页，共64页。39第39页/共64页第三十九页，共64页。40第40页/共64页第四十页，共64页。41第41页/共64页第四十一页，共64页。42体内药物体内药物(yow)(yow)分析方法大致可归为一下

8、几类：分析方法大致可归为一下几类：第42页/共64页第四十二页，共64页。431.查阅相关文献资料，了解药物(yow)的理化性质，选定内标物质；2.使用标准品，扫描质谱条件；3.选择色谱柱和流动相，摸索合适的液相条件；4.依据样品基质，配制模拟生物样品，选择相应的样品处理 方法，处理后进样分析；5.调整样品处理方法或液相条件，并可进一步优化质谱参数；6.根据检测目的，设定定量范围，对方法进行考察。第43页/共64页第四十三页，共64页。方法学验证方法学验证(ynzhng)（validation） 生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究有别于其

9、它药理毒理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出(d ch)可靠的结果，因此必须对所建立的方法进行验证。并且在实际样品检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。 44第44页/共64页第四十四页，共64页。451. 特异性和灵敏度特异性和灵敏度2. 标准曲线和线性范围标准曲线和线性范围3. 批内精密度和准确度批内精密度和准确度4. 批间精密度和准确度批间精密度和准确度5. 稀释效应稀释效应6. 定量下限定量下限7. 回收率回收率 8. 基质效应基质效应9. 残留效应残留效应10. 稳定性（稳定性（

10、标准溶液稳定性、标准溶液稳定性、融解样品稳定性、长期稳定性、融解样品稳定性、长期稳定性、冻冻/融循环稳定性、进样器中样品融循环稳定性、进样器中样品稳定性等稳定性等）化学药物临床药代动力学研究技术指导原化学药物临床药代动力学研究技术指导原则则第45页/共64页第四十五页，共64页。46Guideline on bioanalytical method validation - EMEA考察方法：测定至少六份不同来源的合适的空白生物基质结果要求：在化合物出峰位置，干扰成分的信号大小不 得超过定量下限中分析物信号高度的20%；在 内标的出峰位置，杂质响应不得超过内标信 号的5%。第46页/共64页第

11、四十六页，共64页。47考察方法：跟在最高浓度的样品之后，连续进样三遍空 白样品 ULOQ - Blank - ULOQ - Blank - ULOQ - Blank结果要求：空白样品中分析物的信号应小于定量下限中分 析物信号的20%；内标的信号应小于5%。第47页/共64页第四十七页，共64页。48考察方法：连续测定六份定量下限浓度的样品，统计准 确度和精密度结果要求：准确度应在80% - 120%之间；精密度结果小 于20%；同时定量下限处信号响应值应至少 为空白样品的5倍。第48页/共64页第四十八页，共64页。49结果要求： 校正曲线应至少包括(boku)六个浓度点以及一个Matrix

12、 Blank 和一个 Control Zero 点（仅作参考，不纳入校正曲线的计算），必要时可以做双份测定；各个浓度点的准确度应在85% - 115%之间，精密度应小于15%，定量下限处为80% - 120%和20%；对不符合要求的浓度点可以排除计算，但至少有75%以上的浓度点符合要求；方法验证期间应至少提供三条以上的合格的标准曲线纳入统计。第49页/共64页第四十九页，共64页。50考察方法：测定四个浓度的QC样品，分别为LLOQ，low QC， medium QC，high QC，每个浓度至少测定5份；结果要求：每个浓度QC样品测定结果的均值应在理论 浓度的85% -115%之间，LLOQ

13、处在80%-120%之间； ：至少两天测定至少三批QC样品，每个浓度 QC样品测定结果的总平均值应在理论浓度的85% - 115%之间，LLOQ处在80%-120%之间。第50页/共64页第五十页，共64页。51 将标准品加入到生物基质中配制成的模拟生物样品，用作方法学验证中的考察样品和样品测定中的方法学质控。低浓度质控 (Low QC)浓度不超过LLOQ的3倍；中间浓度质控(Medium QC)浓度一般为定量范围的中间浓度；高浓度质控(High QC)浓度至少为ULOQ的75%。 质控样品推荐由独立人员一次性配制，进样分析合格后分装，冰冻储存，每次取足够(zgu)数量的样品使用，剩余丢弃。第

14、51页/共64页第五十一页，共64页。52考察方法：测定四个浓度的QC样品，分别为LLOQ，low QC， medium QC，high QC，每个浓度至少测定5份；结果要求：统计每个浓度QC样品测定结果间的CV%值 应小于15% ，LLOQ处小于20%； ：统计每个浓度所有QC样品测定结果间的 CV%值应小于15% ，LLOQ处小于20%。第52页/共64页第五十二页，共64页。53考察方法：将5倍于ULOQ浓度的QC样品，使用空白基质连 续稀释。每个浓度稀释，至少测定5份样品；结果要求：每个稀释浓度的准确度偏差和精密度应在15% 之内。第53页/共64页第五十三页，共64页。548.1分析

15、物和内标的标准贮备液(Stock)和标准工作液(Working)的稳定性8.2样品(yngpn)冰冻/融三次解稳定性，Freeze/Thaw，F/T8.3样品(yngpn)融解后短期稳定性，Thawed8.4样品(yngpn)冰冻的长期稳定性，Long-term8.5处理后样品(yngpn)溶液在进样器中的稳定性第54页/共64页第五十四页，共64页。55 稳定性考察内容和操作主要是根据样品(yngpn)的实际储存条件设计，所考察的冻/融循环数和储存时间均应相等或超过实际样品(yngpn)。 标准溶液稳定性考察应将stock solution稀释至合适的浓度范围之内，结果新/旧两份标准溶液的D

16、iff%值应在5%之内。 样品(yngpn)的稳定性应使用Low和High浓度的QC样品(yngpn)进行考察，每个浓度测定三份，结果的均值与理论浓度的DEV%值应在15%之内。第55页/共64页第五十五页，共64页。56考察方法：在LQC和HQC两个浓度基础上，取至少6份不 同来源的空白生物基质，提取后加入标准和内 标溶液做为考察组；对照组使用不含有基质的 纯溶液，浓度相当于加入的LQC和HQC的浓度； 计算基质效应因子MF和内标校正的MF。结果要求：内标校正的MF的CV%值应不大于15%。第56页/共64页第五十六页，共64页。57第57页/共64页第五十七页，共64页。58考察方法：a组

17、：使用配制三个浓度的QC样品，各 测定三份； b组：使用配制三个浓度的QC样品，各 测定三份；结果要求：绝对基质效应=响应值a/响应值b*100%； 各浓度质控的分析物和内标的绝对基质效应均 值在85% -115%之间，相对标准偏差小于15%。第58页/共64页第五十八页，共64页。59考察方法：使用6份不同来源的生物基质，测定LLOQ，每 份基质重复测定3份；结果要求：准确度应在80% - 120%之间；每个基质至少有 2个符合要求算合格；6批基质中，至少有5批 合格算通过。第59页/共64页第五十九页，共64页。60考察方法：a组：测定三个浓度的QC样品各六份，流动 相复溶； b组：使用等