免疫定性项目性能验证

1、临床免疫定性检测临床免疫定性检测的性能验证的性能验证高速列车性能验证高速列车性能验证n空气动力学空气动力学n速度速度n车体转向架运行车体转向架运行n固定、悬挂的零部件强度固定、悬挂的零部件强度n稳定性稳定性n舒适感舒适感n故障率故障率n第第3页页测定系统测定系统方法学方法学操作程序操作程序校准品校准品仪器仪器试剂试剂测定系统的关键要素测定系统的关键要素医学检验为什么需要医学检验为什么需要“性能验证性能验证”？n评价检测系统是否满足临床检测和认评价检测系统是否满足临床检测和认可组织的要求（可组织的要求（ISO15189）；）；n验证厂家提供的试剂参数能否在本实验证厂家提供的试剂参数能否在本实验室

2、得到重现。验室得到重现。什么时候进行性能验证什么时候进行性能验证n使用新的检测试剂或系统时；使用新的检测试剂或系统时；n更换检测试剂或系统时。更换检测试剂或系统时。更换新的试剂或系统意义：更换新的试剂或系统意义：n更易于操作更易于操作n更高的检测性能更高的检测性能n更经济更经济n更能满足实验室测定要求更能满足实验室测定要求 一一. . 定性临床应用与分类定性临床应用与分类1 1、定性测定的临床应用、定性测定的临床应用免疫学测定免疫学测定：感染性疾病、肿瘤标志物：感染性疾病、肿瘤标志物核酸和基因检测核酸和基因检测微生物检验微生物检验细胞学检验细胞学检验寄生虫检验寄生虫检验2 2、定性实验的临床分

3、类、定性实验的临床分类筛查实验：如便潜血、筛查实验：如便潜血、TPTP诊断实验：如微生物学培养与细菌鉴定诊断实验：如微生物学培养与细菌鉴定确认实验：对以上已做出的检验结果进行验确认实验：对以上已做出的检验结果进行验证和确认证和确认3.3.几个重要概念几个重要概念n筛查试验筛查试验：临床上筛查方法通常用于检测整个人临床上筛查方法通常用于检测整个人群（或者人群中的特定群（或者人群中的特定部分部分）中）中特定指标特定指标的情况。的情况。例如对例如对需输血患者需输血患者样本做样本做HIV血清学试验血清学试验。 一般来说，这些用于筛查的定性试验必须具有一般来说，这些用于筛查的定性试验必须具有高敏感性以高

4、敏感性以确保真阳性确保真阳性结果的结果的检出检出。如果筛查试。如果筛查试验的假阳性结果所造成的社会及经济后果不是非验的假阳性结果所造成的社会及经济后果不是非常严重，这种低特异性可通过特异性较好的确认常严重，这种低特异性可通过特异性较好的确认试验加以弥补。试验加以弥补。CLSI EP12-A2 User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline3.3.几个重要概念几个重要概念n诊断试验诊断试验：通常用于临床怀疑某种特定疾病或通常用于临床怀疑某种特定疾病或状况是否存在的诊断状况是否存在的诊

5、断性性定性试验。例如各种微定性试验。例如各种微生物培养就是用于检查感染情况的诊断试验。生物培养就是用于检查感染情况的诊断试验。 临床上临床上对治疗的要求，对治疗的要求，诊断试验诊断试验应应具有很具有很好的敏感性和特异性好的敏感性和特异性。如果诊断试验后还进行。如果诊断试验后还进行确认试验，那么诊断试验的特异性要求可以稍确认试验，那么诊断试验的特异性要求可以稍微降低。微降低。CLSI EP12-A2 User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline3.3.几个重要概念几个重要概念n确认

6、试验确认试验：确认试验用于验证筛查试验或者诊确认试验用于验证筛查试验或者诊断试验结果。如果确诊试验证实了之前的检测断试验结果。如果确诊试验证实了之前的检测结果，临床医生即可作出诊断。确认试验通过结果，临床医生即可作出诊断。确认试验通过设计使其具有设计使其具有较高的特异性较高的特异性（有时甚至以牺牲（有时甚至以牺牲敏感性为代价）以及敏感性为代价）以及高阳性预测值高阳性预测值。免疫印迹免疫印迹试验就是一种用于试验就是一种用于HIV血清学试验等筛查试验血清学试验等筛查试验之后的确认试验。之后的确认试验。 3.3.几个重要概念几个重要概念n敏感性敏感性或阳性测定能力指数（或阳性测定能力指数（DI（）：

7、（）：可定义为一实验对阳性标本测定后给出阳性结果的能力。 DI（）=真阳性/（真阳性+假阴性）100% n特异性特异性或阴性测定能力指数（或阴性测定能力指数（DI（）：（）：则为对阴性样本测定给出阴性结果的能力 DI（）= 真阴性/（真阴性+假阳性）100% 3.3.几个重要概念几个重要概念n阳性预示值：阳性预示值：即测定为阳性的标本实际上为阳即测定为阳性的标本实际上为阳性的可能性。性的可能性。 =真阳性真阳性/（真阳性（真阳性+假阳性）假阳性）100%n阴性预示值阴性预示值:则为一份给出阴性结果的样本实则为一份给出阴性结果的样本实际上为阴性的可靠性。际上为阴性的可靠性。 = 真阴性真阴性/（

8、真阴性（真阴性+假阴性）假阴性）100%临床诊断（金标准）临床诊断（金标准）总计总计阳性阳性阴性阴性验证方法验证方法阳性阳性A AB BA+BA+B阴性阴性C CD DC+DC+D总计总计A+CA+CB+DB+DN N敏感度敏感度 = 100% = 100% A A/ /（A+CA+C） 特异性特异性 = 100% = 100% D D/ /（B+DB+D） 相关样本的患病率相关样本的患病率 = 100% = 100% （A+CA+C）/N/N阳性预测值（阳性预测值（PVPPVP） = 100% = 100% A A/ /（A+BA+B） 阴性预测值阴性预测值 （PVNPVN）= 100%=

9、100% D D/ /（C+DC+D） 方法效率（正确率）方法效率（正确率） = 100% = 100% （A+DA+D）/N/N “预示值”对临床检验结果影响预示值对一个有预示值对一个有95%敏感性和敏感性和95%特异性的特异性的试剂检测结果的影响（试剂检测结果的影响（100,000人）人） 结结 果果 10%感染率感染率 1%感染率感染率 检出检出 (+)未检出未检出 () 检出检出(+) 未检出未检出() + 9,500 500 950 50 4,500 85,500 4,950 94,050敏感性敏感性(TP/TP+FN) 95% 95%特异性特异性(TN/TN+FP) 95% 95%

10、阳性预示值阳性预示值TP/TP+FP 9500/9500+4500=67.9%950/950+4950=16%阴性预示值阴性预示值TN/TN+FN85500/85500+500=99.4%94050/94050+50=99.9%二二. .定性定性检测系统的性能验证检测系统的性能验证 验证的内容验证的内容: :1 1. .正确度（准确度）正确度（准确度）2.2.精密度精密度3.3.敏感性敏感性 4.4.特异性特异性 5.5.CUTOFFCUTOFF值验证值验证6.6.其他（需要时）其他（需要时）nEP15A2nEP17AnEP12nClinical Laboratory and Standard

11、s Institute (CLSI) 涉及免疫定性检测评价方法标准涉及免疫定性检测评价方法标准医学实验室精密度和准确度的确认医学实验室精密度和准确度的确认检出限与定量限的评价检出限与定量限的评价定性检测评价定性检测评价临床实验室标准化协会临床实验室标准化协会性能验证前的准备性能验证前的准备n应熟悉待验证的试剂或系统应熟悉待验证的试剂或系统n进行必要的培训，包括进行必要的培训，包括样本的处理和储存、样本的处理和储存、试剂的处理和储存、合理的检测方案、对结试剂的处理和储存、合理的检测方案、对结果合理的解释以及系统的质量控制果合理的解释以及系统的质量控制等。等。n制定质量保证计划制定质量保证计划n确

12、定患者样本的数量及强弱（评价重复性）确定患者样本的数量及强弱（评价重复性）n确定比较的方法确定比较的方法CLSI EP12-A2 User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline性能验证的合格标准从何而来？性能验证的合格标准从何而来？n试剂盒说明书试剂盒说明书n国际和或国际标准国际和或国际标准性能验证前样本的准备性能验证前样本的准备n质控品：使用商品化质控物进行，包括阴质控品：使用商品化质控物进行，包括阴性和阳性。性和阳性。n样本的采集和保存：采集时间、保存方式样本的采集和保存：采集

13、时间、保存方式等必须保证一致性。等必须保证一致性。CLSI EP12-A2 User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline方法比较方法比较用样本数量用样本数量n取决于评价者的目的。取决于评价者的目的。作为最低要求，检作为最低要求，检测要持续到至少用比较方法获得测要持续到至少用比较方法获得50个阳性个阳性样样本本。n并且至少用比较方法获得并且至少用比较方法获得50例阴性样例阴性样本本以以确定此种检测方法的特异性。确定此种检测方法的特异性。CLSI EP12-A2 User Proto

14、col for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline 1. 准确度验证准确度验证1）检测已知值的检测已知值的参考物质参考物质 n室间质评材料室间质评材料 (卫生部或者卫生部或者CAP)n厂商提供的已赋值的参考材料厂商提供的已赋值的参考材料n分析用参考方法或决定方法定值的材料。分析用参考方法或决定方法定值的材料。2） 方法比较试验：样本数为方法比较试验：样本数为10-20个，两种方法个，两种方法同时测定同样的样品，用同时测定同样的样品，用KAPPA检验方法分析检验方法分析两种方法检测结果一致性两种方法检测结果

15、一致性.(比如比如HBV酶免法和发酶免法和发光法比对光法比对)选取选取4040份（份（2020份）样本份）样本, ,最好阴阳性各半最好阴阳性各半随机盲法重新分号随机盲法重新分号检测样本检测样本将所有检测结果汇总填表将所有检测结果汇总填表计算评价性能指标计算评价性能指标2. 精密度验证精密度验证1）批内精密度批内精密度:同一份样本在同一批次内平行重复检同一份样本在同一批次内平行重复检测测10次次.然后计算均值然后计算均值,SD和和CV.2）批间精密度批间精密度:同一份样本连续检测同一份样本连续检测10天天,每天平行每天平行检测双孔检测双孔.然后计算均值然后计算均值,SD和和CV. Note: N

16、ote: 用用S/COS/CO比值进行统计计算比值进行统计计算. . 最好选择临界值最好选择临界值, ,或弱阳性样本或弱阳性样本. .判断标准判断标准: :批内批内CVCV小于小于15%,15%,批间批间CVCV小于小于25%.25%.批内重复性的验证批内重复性的验证n高、中、低三个浓度的样本，在一批检测高、中、低三个浓度的样本，在一批检测内，重复检测内，重复检测20次（孔），计算所得次（孔），计算所得S/CO值的均值和值的均值和SD，计算批内，计算批内CV%。n判断结论：应判断结论：应试剂说明书所标明的批内变试剂说明书所标明的批内变异。异。ELISA的批内变异的批内变异CV%应应10%。批间

17、重复性批间重复性的验证的验证n高、中、低三个浓度的样本，在高、中、低三个浓度的样本，在10天以上时间天以上时间内单次（孔或管）重复进行内单次（孔或管）重复进行20批检测，计算所批检测，计算所得得S/CO值的均值和值的均值和SD，计算批间，计算批间CV%。n判断结论：应判断结论：应试剂说明书所标明的批间变异。试剂说明书所标明的批间变异。 ELISA的批间变异的批间变异CV%应应15%。3. 敏感性敏感性1）验证方法）验证方法: 取取10-20份已知真阳性的样本，用常规检测方法检测，计份已知真阳性的样本，用常规检测方法检测，计算检测阳性的样本占样本总数的比例。算检测阳性的样本占样本总数的比例。 2

18、）样本来源）样本来源:p临床诊断的阳性病人血清；临床诊断的阳性病人血清；p厂家提供的阳性对照；厂家提供的阳性对照；p决定性参考方法检测阳性的样本；决定性参考方法检测阳性的样本；以上阳性样本来源紧张时，可以进行稀释（如以上阳性样本来源紧张时，可以进行稀释（如2：3，3：4这样稀释）这样稀释） 4. 特异性特异性1）验证方法验证方法：选取选取20份正常健康人血清（一般取自份正常健康人血清（一般取自健康体检者），计算其检测阴性结果所占百分率健康体检者），计算其检测阴性结果所占百分率。 2）样本来源样本来源:体检样本体检样本,体检者确认符合要求后即可体检者确认符合要求后即可. NOTE:部分项目在健康

19、体检人群中阳性率也很高部分项目在健康体检人群中阳性率也很高,此此类项目特异性验证很难执行类项目特异性验证很难执行,建议引用厂家说明书建议引用厂家说明书. 比如麻疹病毒比如麻疹病毒IgG,CP-IgG,MP-IgG等一系列病毒抗体等一系列病毒抗体IgG.因为很难因为很难确认体检者既往是否有过感染史确认体检者既往是否有过感染史,而而IgG抗体在体内存留时间长抗体在体内存留时间长.因此很因此很难收集到真正意义上的阴性样本难收集到真正意义上的阴性样本.特异性验证（干扰）特异性验证（干扰）n特定病原体以外感染性疾病患者的样本。特定病原体以外感染性疾病患者的样本。n含有干扰性物质的样本：类风湿因子（含有干

20、扰性物质的样本：类风湿因子（RF）阳性、含异嗜性抗体、溶血、脂血、高胆红阳性、含异嗜性抗体、溶血、脂血、高胆红素样本。素样本。n结果判断：非特定病原体感染患者样本均应结果判断：非特定病原体感染患者样本均应为阴性。含一定浓度干扰物质的样本检测应为阴性。含一定浓度干扰物质的样本检测应为阴性。为阴性。5. CUT-OFFCUT-OFF重复性重复性和测定下限验证和测定下限验证nCUT-OFF重复性验证：样本浓度应重复性验证：样本浓度应接近接近临临界值界值。不宜用阴性或强阳性样本不宜用阴性或强阳性样本。n批内和批间变异验证：高、中和低三个浓度批内和批间变异验证：高、中和低三个浓度（与试剂盒说明书中所述相

21、适应）（与试剂盒说明书中所述相适应）临界点临界点的定义的定义n同样一份样本，在多次重复实验中各有同样一份样本，在多次重复实验中各有50%的几率获得阳性或阴性的结果时该的几率获得阳性或阴性的结果时该分析物的浓度分析物的浓度。CLSI EP12-A2 User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline临界点（临界点（CUT-OFF)CUT-OFF)与试剂盒判断值与试剂盒判断值（CUT-OFFCUT-OFF值）的区别值）的区别n这里的这里的临界点临界点指的是一个处于试剂检测临界指的是一个处于

22、试剂检测临界点的点的样本浓度样本浓度，其一旦确定，是不变的。，其一旦确定，是不变的。n试剂盒试剂盒CUT-OFF值值指的是一个指的是一个判断判断某一次测某一次测定结果的由定结果的由阴性和阳性阴性和阳性对照信号值按一定公对照信号值按一定公式计算出来的式计算出来的信号值信号值，每次测定都会有所差，每次测定都会有所差异。异。(1) CUT-OFF重复性验证重复性验证nCUT-OFF的重复性（同时包含测定下限的重复性（同时包含测定下限 的验证）的验证）n批内变异的验证批内变异的验证n批间变异的验证批间变异的验证验证步骤验证步骤n制备足够制备足够40次重复检测的次重复检测的3份样本：份样本：分别分别为处

23、于临界浓度、高于临界浓度为处于临界浓度、高于临界浓度20%和低和低于临界浓度于临界浓度20%的样的样本本。n重复检测样重复检测样本本40次，确定每一份样次，确定每一份样本本结果结果为阳性和阴性的百分比。为阳性和阴性的百分比。n评价临界浓度是否准确？评价评价临界浓度是否准确？评价+20至至-20%的浓度范围的浓度范围是否是否包含于、位于或者超包含于、位于或者超出这种方法的出这种方法的95%区间区间？CLSI EP12-A2 User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved GuidelineC50C50是

24、否准确？是否准确？ 40次测试次测试 C501阳性结果阳性结果=27/40(67.5%)2阳性结果阳性结果（14-26）/40（35%-65%） 正确正确阳性结果阳性结果重复性重复性检测总检测总次数次数次数次数百分比百分比真正百分比真正百分比样本的实际样本的实际浓度浓度201050%30%-70%C30-C70402050%35%-65%1005050%40%-60%不同不同C50C50重复检测次数与检出重复检测次数与检出阳性数的关系阳性数的关系临界点（临界点（CUT-OFFCUT-OFF）的重复性指的是什么？）的重复性指的是什么？n是为正在是为正在评价评价的检测的检测试剂或系统试剂或系统建立

25、分建立分析物的临界浓度析物的临界浓度(C50)，并且确保临界，并且确保临界浓度浓度20%的范围处于的范围处于95%区间内。区间内。CLSI EP12-A2 User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline如何获得系统或试剂的如何获得系统或试剂的“临界点临界点”n检测试剂或系统的检测试剂或系统的说明书可能会注明分析说明书可能会注明分析物的临界浓度。物的临界浓度。n如果临界浓度如果临界浓度未知未知，则则可以将阳性样本进可以将阳性样本进行一系列稀释，然后将他们进行重复检测行一系列稀释，然后

26、将他们进行重复检测以确定能够获得以确定能够获得50%阳性和阳性和50%阴性结阴性结果的那个稀释度。这一稀释度的分析物浓果的那个稀释度。这一稀释度的分析物浓度度即为即为临界点临界点。CLSI EP12-A2 User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline(2) 测定下限的验证测定下限的验证n处于测定下限浓度（如临界点浓度处于测定下限浓度（如临界点浓度+20%）的样本，重复检测）的样本，重复检测20次，次，应至少有应至少有18次以上次以上(90%)为阳性为阳性反应。反应。重复性验证的质

27、量控制重复性验证的质量控制n质控品：如方法学比较在质控品：如方法学比较在10天内完成，天内完成，则每一批次都要则每一批次都要进行质控进行质控样本检测，样本检测，如出现失控，则当次检测结果无效。如出现失控，则当次检测结果无效。安排安排重新重新检测以替换不合格的批次。实验室要分析检测以替换不合格的批次。实验室要分析失失控的控的原因。不合格批次在原因。不合格批次在10天内天内不应超过不应超过1次或次或20天内不超天内不超过两次过两次。如若超出，所在实验室应中止检测工作并咨询试。如若超出，所在实验室应中止检测工作并咨询试剂制造商以确定原因并采取纠正措施。剂制造商以确定原因并采取纠正措施。n得出得出20

28、次重复次重复检测检测结果。如果方法比较研究超过结果。如果方法比较研究超过20天，天，则每一批次对每份对照样本进行单次检测，总计也提供则每一批次对每份对照样本进行单次检测，总计也提供20次结果。次结果。 CLSI EP12-A2 User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline6.其他其他（1）同一项目不同检测方法或仪器的比对）同一项目不同检测方法或仪器的比对 适用范围适用范围:一个项目有两种以上的方法或者两一个项目有两种以上的方法或者两台以上的仪器台以上的仪器(包括同一型号的仪器包括

29、同一型号的仪器)同时检同时检测测,需要进行一致性比对。需要进行一致性比对。 （注：定量检测中（注：定量检测中,报告单位不同的不需要比报告单位不同的不需要比对）对）首次比对选取首次比对选取40份份(20)样本样本,最好阴阳性各半最好阴阳性各半随机每随机每8份分成一组份分成一组两种方法两种方法(或两台仪器或两台仪器)每天平行检测一组样本每天平行检测一组样本将所有检测结果汇总将所有检测结果汇总Kappa检验检验,评价一致性评价一致性 新鲜患者血清阴性新鲜患者血清阴性2 2例，阳性例，阳性3 3例，阳性例，阳性包含有包含有S/COS/CO高、中、低值，用新旧批号试高、中、低值，用新旧批号试剂检测。剂检

30、测。 低值避开低值避开“灰区灰区” 夹心法：夹心法：S/COS/CO低值低值1.21.23 3 竞争法：竞争法：S/COS/CO低值低值0.40.40.60.6 判断标准：符合率为判断标准：符合率为100%100%为可接受。为可接受。（2）更换批号的简易比对：）更换批号的简易比对：（3）编制性能验证的）编制性能验证的SOP理想的操作方法：理想的操作方法：操作中影响测定结果的关键环节已知；操作中影响测定结果的关键环节已知；具有可操作性的具有可操作性的SOP。怎样编写怎样编写 SOP？XXX单位XXX实验室XXX标准操作程序编号：启用日期：版本：第 页 共 页一目的：二适用范围：三职责或责任人：四

31、（方法原理）五（检测设备和试剂）六（所需的环境条件）七操作步骤： 1 2 3 。 八、本操作程序变动程序：九、相关的文件十、相关的记录表格和报告编写人审核人批准人 （4）试剂的性能验证）试剂的性能验证 （定性）（定性）n重复性和准确性重复性和准确性n测定下限测定下限(Detection limit) （定性）（定性）n批内变异批内变异(10%)和批间变异和批间变异( 15-25%)n “钩状钩状”效应效应(Hook effect)n变异体的检测能力变异体的检测能力(如：如：HBsAg)n临床敏感性和特异性临床敏感性和特异性n抗干扰能力抗干扰能力三三. 性能验证的注意事项性能验证的注意事项1.方

32、法比较方法比较持续时间持续时间n1020天。CLSI EP12-A2 User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline2.数据收集的检查数据收集的检查 n每次实验，应立即记录所有原始检测数据每次实验，应立即记录所有原始检测数据并复核，以早期发现分析系统及人为误差并复核，以早期发现分析系统及人为误差的来源。的来源。n一旦发现某些结果是由可解释的误差引起一旦发现某些结果是由可解释的误差引起的，则应将其记录下来，同时，这些结果的，则应将其记录下来，同时，这些结果不能用于数据分析。不能用于数据分析。n如不能确定误差产生的原因，则保留原始如不能确定误差产生的原因，则保留原始结果结果。3.不一致结果的处理不一致结果的处理n如果如果比较方法不是比较方法不是100%准确，可以准确，可以用用“金标准金标准”“”“参考方法参考方法”来检测在来检测在检测和比较方法间产生差异的样本检测和比较方法间产生差异的样本。CLSI