猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查分析6000

1、华中农业大学本科学生毕业论文 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查分析 姓 名： 专 业： 指导教师： 分 数： 华中农业大学二O一六年四月猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查分析学生姓名、年级专业、指导教师摘要：繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是猪“高热综合症”的主要病原之一，它能引起机体免疫抑制、导致继发感染，造成免疫失败等，对养猪业造成了巨大的经济损失。本研究通过对2013年-2015年间*省部分地区发生疑似高致病性PRRSV的猪场进行流行病学调查，一记录发病猪临床症状和解剖症

2、状，采集肺、脾、淋巴结等临床样本，利用RT-PCR对PRRSV阳性病料中的Nsp2，并经特异性试验、敏感性试验、多重RT PCR检测，以此分析*省近年来PRRSV的流行情况。关键词：猪；繁殖与呼吸综合征病毒；流行病学前言猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRS)又称“猪蓝耳病”(Blue ear disease)。PRRS主要引起怀孕母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍，仔猪和育肥猪出现呼吸道症状，感染猪出现免疫抑制和亚临床感染并对其它致病因子的易感性增加，给养猪业造成巨大的经济损失，被列为我国二类传染病。猪是

3、PRRSV主要的自然宿主，不同性别、年龄、品种的猪都可被该病毒感染，但以感染的妊娠母猪和初生仔猪表现的临床症状最为明显。PRRSV在猪体内能形成持续性感染，感染时间可达数月甚至更长。感染猪可在80-100天内排毒并感染同一猪群。对持续感染的带毒猪进行病毒分离，发现6-9周龄仔猪分离率最高。PRRSV在猪群中的持续性感染，给PRRS的控帘和净化带来巨大挑战。故本研究通过对2013年-2015年间*省部分地区发生疑似高致病性PRRSV的猪场进行流行病学调查，为更好的控制该病提供科学依据。1、实验材料1.1 研究对象1.1.1无临床症状猪。无临床症状猪血样样品采集时间为2013年至2015年，采集*

4、省*市中区6个乡镇及周边地区的12个兔疫猪场。这些猪场猪群表现正常，未见明显的PRRSI陆床症状。采集完血样常温或放置40C冰箱，待212h后，30004000 rpm, 40C离心5 min。取上清置-200C冰箱保存。1.1.2发病猪病。发病猪病料采集时间为2013年至2015年，采集*省*市畜牧兽医局兽医试验室化验门诊病历，分别来自*市8个乡镇及周边地区的48个不同规模猪场及农村散养户“疑似猪高热病”病猪或血样。“疑似猪高热病”临床症状有:可疑病猪主要有体温升高，多在39.242之间，呈稽留热，若用抗生素和解热药治疗后，体温恢复正常，停药后马上反弹。精神倦怠，少食或不食。有的表现喘气或呈

5、不规则呼吸，部分患猪流鼻涕、打喷嚏、咳嗽、眼分泌物增多、眼睑肿胀，出现结膜炎症状，部分猪伴有腹泻，有时便秘。初期全身皮肤发红，后转为耳部、胸腹部、背部及四肢皮肤有紫红色斑点。怀孕母猪出现流产、早产、产弱胎、死胎及木乃伊胎等现象。共调查、收集48个不同规模猪场及农村散养户172份病料，包括病猪心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、胎儿组织、胎盘等脏器或血液样品。每一病例取部分病变组织3.0g左右，加少量灭菌PBS，用灭菌研磨器研磨至糊状，再加灭菌PBS释成乳剂，置-70 0C冰箱反复冻融3次(血清样品无需研磨反复冻融)，30004000 rpm, 4离心5 min，取上清置-20 0C冰箱保存。1.2主要

6、试剂及仪器Taq DNA聚合酶、鼠源反转录酶（M-MLV)，RNA酶抑制剂(Rnase Inhibitor )，dNTP，pMD 18-T载体均购白大连宝生物工程有限公司；Trizol Reagent购白invitrogen公司；DEPC购白Amresco公司；琼脂糖购白Sigma公司。其他化学试剂（如：氯仿、异丙醇、无水乙醇等）均为国产分析纯产品；PRRSV抗体检测试剂盒(购自北京爱德士元亨生物科技有限公司)。TGL-16G型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；80-2B型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；HH.B 11型电热恒温培养箱(潍坊医疗器械厂)；SW-TC-2A型超净工作台(

7、上海博迅实业有限公司)；ELX800型酶标仪(美国BioTek公司)；TGL-16G型常温离心机(上海安亭科学仪器厂制造)；PCR仪、Centrifuge 54178台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，JA1003型电子天平(上海精科天平)；DYYIII-31 A/31 B型电泳槽(北京六一仪器厂)；Gdldoc EQ凝胶成像分析系统(美国BIO-RAD公司)；SUB28型恒温水浴水槽(英国Grant公司)；超净工作台(加拿大Canadian Cabinets公司)。1.3引物根据GeneBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA 1毒株，设计合成目的基因PRRSV Nsp2基因

8、片段引物PN 1, PN2和扩增ORFS基因的引物P51, P52，同时根据己发表的CSFV核酸序列，选择高度保守性的5端非编码区设计猪瘟引物CS 1, C52,引物由上海生工生物工程公司合成，使用前用灭菌超纯水配成浓度为25Pmol/L，-20 0C保存备用。经试验验证PN 1, PN2, CS 1, C52可以组合为多重RT PCR同时检测高致病性PRRSV与CSFV。(见表2)。表1.引物设计名称Name引物序列Primers引物位置Primer position片段大小/opFragment size/bp用途appticationPN15'-CGGTTTTGATGGGCGAC

9、A-3'27382755nt718/807多重RT-PCRPN25'-TGCAGGCGTGCGAGGTAA-3'34383456nt检测高致C515-AGACGGAGGGACTAGCCGT-3120138nt267病性 PRRSVC525-GATTCAACTCCATGTGCCATG-3366386nt与CSFVP515'-AAGCGGTGGGCAACCGTTT-31363713656nt697PRRSV ORFSP525'-TTTGTGAGCCGTGCTATCA-31431414333nt基因的扩增1.4主要缓冲溶液及相关试剂配制电泳缓冲液(SOXTAE

10、 ) : Tris base 242 g加入到700 mL ddH20中，再加入冰醋酸57.1 mL, 0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 100 mL，用ddH20定容至1000 mL。0.8%琼脂糖凝胶：2 mL 50×TAE缓冲液、98 mL ddHzO、琼脂糖0.8 g，加热溶解。琼脂糖凝胶上样缓冲液购自宝生物公司。TE缓冲液(pH8.0 )：1 mmol/L EDTA (pH8.0)，10 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)。质粒提取用缓冲溶液:溶液I（Solution I )，溶液II（Solution II ),溶液III (Solution III

11、)购自上海生工。DEPC处理水:0.1 % DEPC 。PBS:称取8 g NaCI，0.2 g KCI，1.44 g NaZHP04，0.24 g KHZP04，溶于800mL ddH20中，调pH至7.2，定容至1000 mL，高压蒸气灭菌，室温保存备用。1.5感受态细胞制备保存用试剂0.1 mol/L CaC12溶液:取27 g CaC126HZ0溶于ddH20中并定容至过滤除菌，分装后置一20保存，用于大肠杆菌感受态细胞的制备。20%甘油:取20m1甘油溶液无菌ddH20中并定容至100m1，摇匀，高压下蒸气灭菌20 min，置于4保存。2、研究内容与方法2.1样品采集与处理血液和组织

12、的采集处理。将采集的血液在常温条件下放置20min，等血清析出后，收集于1.5 m1EP管中，置于4条件下，5000 r/min离心30 min，收集上清于另取一干净无菌EP管中。采集的组织病料，加入3-5倍的DMEM培养基，置于无菌的匀浆器中研磨，将研磨好的组织匀浆-80冻融三次，然后于4条件下，8000 r/min离心15 min，收集上清。将收集的血清和组织匀浆上清用0.22 m的滤膜过滤后，冰冻在-80保存备用。2.2总RNA的提取 (1)取100l血清或组织匀浆液上清于一无菌1.5m1离心管中，加入1 mlTrizol ,充分混匀，室温静置35min。(2)向静置后混合液中加入200

13、1氯仿，混合均匀。(3)将离心管置于冰中冰浴10min 。(4)将离心管放入离心机中4条件下，12000rpm，离心l0min。(5)用移液器小心吸出上层水相，加入另一无RNA酶的干净离心管中，然后再向离心管中加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀。室温放置l0min 。(6)再将离心管置于离心机中4条件下，12000rpm，离心l0 min。(7)离心完后，取出离心管，吸弃上清，加入lml 75%乙醇洗涤。(8) 4条件下，7500rpm,离心5min。(9)小心吸弃上清，自然风干。(10)等乙醇全部散去，加入适量0.1 % DEPC充分溶解。2.3两步法RT PCR第一步:cDNA合成RT反应体系:

14、MGC12 (25mM)2l10×RT Buffer1lRnase Free dH202.75ldNTP Mixture(10 mM)1lRNase Inhibitor(40 U/l)0.25lAMV Reverse Transeriptase(5U/l)0.5lOligo Dt(2.5pmol/l)0.5l实验样品RNA2lTotal10lRT的反应程序为42.0反转录30 min，95.0 5 min，5 5 min进行逆转录。将合成好的cDNA用于第二步PCR反应。第二步:特异性片段合成PCR反应体系:灭菌蒸馏水27.88l5×PCR Buffer10lTaKaPa

15、Ex Tap HS0.25lcDNA10 lTotal50 l上游特异性PCR引物（20 pmol/l）0.5l下游特异性PCR引物（20 pmol/l）0.5lNSP2-del-F/R检测引物反应条件:94.0预变性5 min， 94.0变性0.5 min,57.0 退火0.5 min，72.0延伸40 s，36个循环数，72.0延伸10 min，4保存，其扩增产物大小为508bp或418bp。NSP2F/R引物反应条件:94.0预变性5 min，94.0变性0.5 min，57.0退火0.5 min, 72.0延伸1.5 min，36个循环数，72.0延伸10 min，4 保存，其扩增产物

16、大小约lkb。ORFSF/R引物反应条件:94.0预变性5 min，94.00C变性0.5 min, 57.0退火0.5 min, 72.0 延伸1 min，35个循环数，72.0 延伸10 min，4 保存，其扩增产物大小约650 bp。2.4特异性试验分别取试验室保存的PRRSV SX-1变异毒株与CSFV疫苗毒株作为阳性对照，使用四对引物混合物，分别对阳性对照和阴性对照进行扩增试验，测试引物特异性。2.5敏感性试验核酸蛋白检测仪测定PRRSV SX-1株和CSFV疫苗毒株的混合RNA以确定其基因组RNA的浓度，并将提取的RNA依次做10倍梯度稀释，每个稀释度取3L作为模板，进行多重RT

17、PCR扩增以检测其敏感性。2.6临床病料的多重RT PCR检测利用建立的多重RT PCR方法对枣庄地区的不同规模猪场及农村散养户“疑似猪高热病”病猪或血样进行检测，同时以PRRSV SX-1株和CSFV疫苗株为阳性对照，以灭菌水作为阴性对照。3、实验结果与分析3.1无临床症状猪血清抗体检测结果3.1.1无临床症状猪不同疫苗血清抗体的检测结果结果显示，对所采集的2008-2010年间采集的12个免疫猪场的929份血清，4个未免猪场的126份血清进行ELISA抗体检测，未免疫PRRSV疫苗的无临床症状猪群抗体阳性率达53.2%（ 67/126 )，免疫灭活疫苗的无临床症状猪群免疫抗体抗体阳性率为7

18、1.1 % (404/568 )，免疫弱毒疫苗的无临床症状猪群免疫抗体阳性率为88.I% （318/361)。经ELISA检测，结果见表2。表2 本地区PRRS血清学调查结果猪群样品数阳性样品数阳性率（%）免疫弱毒苗猪群36131888.1免疫灭活苗猪群56840471.1未免疫猪群1266753.23.1.2 不同年龄段猪血清中PRRSV抗体的阳性率比较对所采集到861份血清进行PRRSV抗体检测，按仔猪、幼猪、成猪三个生长阶段分析结果见表3。从表格中可见，按不同生长阶段猪血清中PRRSV抗体的阳性率差异较大，仔猪的血清抗体阳性率最高，达到95.6%，成猪的血清抗体阳性率最低，为53.7%，

19、幼猪的血清阳性率居中，为88.0%，血清抗体阳性率仔猪与成猪之间差异显著(P<0.05)；幼猪与成猪之间差异显著(P<0.05 )；仔猪与幼猪之间差异不显著(P>0.05)。表3不同年龄段猪血清中PRRSV抗体的阳性率统计分析年龄段样品数阳性样品数阳性率（%）仔猪20319495.6幼猪27233688.0成年猪27214653.7合计85767678.93.2发病猪病料多重RT-PCR检测结果3.2.1特异性试验分别提取PRRSV SX-1变异毒株与CSFV疫苗毒株，利用表2中四对引物的混合物，对上述模板进行扩增。结果在PRRSV的模板中，扩增出了大小约为719bp的特异性

20、片段;在含有CSFV的模板中，扩增出了大小约为267 by的特异性片段。同时对临床“疑似高热病料”进行检测，结果见图1，反应特异性良好。图1 引物特异性分析3.2.2敏感性试验用核酸蛋白检测仪测定得到PRRSV SX-I株与CSFV疫苗毒株的混合基因组RNA浓度为20g/mL。将提取的RNA依次做10倍梯度稀释，每个稀释度取10L模板，用引物PI和P2进行RT-PCR扩增，结果显示其敏感性为20 pg。3.2.3多重RT-PCR检测病料RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳司一见两条特异性扩增片段的条带，大小分别为750bp和260bp左右，与预期结果一致。多重RT-PCR方法检测部分样品的

21、电泳结果如图2所示。多重RT-PCR检测病料结果见表4。图2 多重RT-PCR检测结果表4 本地区病例多重RT-PCR检测结果抗原2013年阳性率2014年阳性率2015年阳性率合计PRRSV65.351.68.356.4CSFV36.724.78.331.4PRRSV+ CSFV14.311.3-12.2从表6结果显示，20132015年间本地区采集的172份疑似“猪高热病”样品高致病性PRRSV阳性占56.4%（97/172），CSFV阳性占31.4%(54/172)。PRRSV和CSFV的多重混合感染，阳性占12.2%（21/172)。4、讨论从2006年以来，枣庄地区许多中小规模猪场或

22、散养猪场开始爆发“猪高热病”，不同的是，到2008年之前的“猪高热病”主要感染仔猪和保育猪，最近发生的疫情对母猪和育成猪也有较高的发病率和死亡率。用ELISA检测未进行PRRSV疫苗免疫的猪场的血清中检测出阳性抗体，结果显示阳性率高达53.2%（67/126），表明调查猪场有PRRS自然感染。近年来，国内普遍采用疫苗免疫的方法控制PRRS的发生，本试验对枣庄免疫灭活疫苗和弱毒疫苗的12个无临床症状猪群场进行ELISA抗体检测，结果显示，免疫灭活疫苗的无临床症状猪群阳性率为71.1%（404/568），免疫弱毒疫苗的无临床症状猪群阳性率为88.1% (318/361)，这与杜兰荣报道的山东省7个

23、规模化猪场进行火活疫苗免疫后猪群的平均PRRS抗体阳性率为75.49%, 9个规模化猪场进行弱毒疫苗免疫后猪群的平均PRRS抗体阳性率达90.65%相一致。结果表明，不同疫苗引起的免疫应答存在一定差异，弱毒疫苗的抗体阳性率普遍高于灭活苗。同时进行PRRSV疫苗免疫的猪场的血清中检测出阳性抗体普遍高于70%，说明枣庄地区该猪场针对PRRS己进行相应的疫苗防治，并取得一定效果。不同年龄段猪相比，仔猪的抗体阳性率为95.6%，显著高于成年猪。结果表明:仔猪与其他日龄猪相比抗体水平最高，可能与母源抗体有关。本研究仅限于针对灭活疫苗和弱毒疫苗的抗体检测与分析，得出PRRSV弱毒疫苗产生免疫应答水平高于灭

24、活疫苗。但本研究未能对弱毒疫苗的安全性及抗体中和情况进行研究，而且本研究只用血清学方法对猪的PRRSV抗体进行检测，不能检测免疫猪与自然感染猪的抗体不同。在现实生产中，存在疫苗免疫后高抗体阳性率的猪群仍有感染发病的现象，因此对于PRRS疫苗的免疫效果的评价仍然需要进一步探讨。2006年6月份以来，我国爆发了从南到北几乎席卷全国的“猪高热病”疫情，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。其中高致病性PRRSV是导致猪“高热综合症”的主要病原之一，在有些病例也检测到CSFV。目前，很多猪场都存在有这两种传染病，并且CSFV和PRRSV常呈混合感染，每年都给养猪业造成了巨大的损失。通过对感染PRRSV的

25、猪仔细观察、分析发现，PRRS感染猪常伴随着混合感染或继发感染，各个猪场的感染情况又不尽相同，所以在临床症状和剖解病变上的表现也不同。有的PRRSV发病猪场由于混合感染了附红细胞体，还会有以下症状:尿的颜色呈浓茶样，胸部、腹部、肛门等处皮肤发给，解剖可见皮下脂肪和组织浆膜黄染以及皮下出血点等特征;有的猪场由于混合感染胸膜肺炎，会出现明显的纤维素性胸膜肺炎病变，肺脏与胸膜粘连，心包膜与心脏粘连，胸腔和腹腔有纤维蛋白的渗出;有的猪场混合感染猪瘟，可见脾脏边缘有出血性梗死灶，肾脏和膀肤粘膜有出血点等病变。总之每个猪场发病猪所表现的症状和病变多种多样，但是高致病性PRRSV作为最重要的致病性特征是感染

26、猪后，导致猪体免疫抑制，机体抵抗力下降，从而出现激发或混合感染，最后导致较高的发病率和死亡率。本研究通过建立的多重RT PCR，对2013-2015年从*市8个乡镇及周边地区的48个不同规模猪场及散户所采集的172份临床疑似“猪高热病”样品进行了检测，检测方法灵敏，结果可信度较高。枣庄地区采集的172份临床疑似“猪高热病”样品，PRRSV阳性占56.4% (97/172 )，CSFV阳性占31.4%( 54/ 172)。这与王仕荣等在广西“猪高热综合征”主要病原调查中，检出率最高的为PRRSV变异株毒株占59. 59%(87/ 146)相似，李维华(2008)等报道的CSFV感染的阳性率较低，

27、仅为3.13%，与本结果不完全一致。本试验结果表明，虽然枣庄地区已经进行了相应的疫苗预防，但是从疑似“猪高热病”样品上检测到PRRSV和CSFV的感染仍然存在。王义桂等(2007)报道近几年山东养猪业存在CSFV和PRRSV及PRV等多种病毒的混合感染。本试验进一步对采集的172份样品进行了多重RT PCR检测，结果显示，本地区也均存在PRRSV和CSFV的混合感染，阳性占12.2% (21/172)。由于PRRSV能引起免疫抑制，促进CSFV等病毒的感染，造成细菌大量继发感染，可能加重猪发病并导致死亡。因此，在今后的疾病防控中，如何提高猪体的免疫力值得重视。5、结论5.1 通过对203年一2

28、015年*省多个地区发生可疑猪繁殖与呼吸障碍综合征的猪场进行流行病学调查，结果表明各种日龄的猪群均可感染发病，且发病率和死亡率均较高。5.2 PRRSV发病猪临床症状典型，母猪流产，小猪高热；同时解剖症状表明，从疑似“猪高热病”样品上检测到PRRSV和CSFV的感染仍然存在，并且存在PRRSV和CSFV混合感染的状况。5.3通过几年来对PRRS防控措施的实施，效果显著，免疫接种、科学管理、药物防治等是控制该病发生和流行的重要措施。致 谢本论文是在导师*教授的悉心指导下完成的，老师在百忙之中抽出时间帮助我，为我解疑答惑，开阔了我的思路，同时还引导我不断创新，让我的论文更加的题文结合，在此我向我的

29、指导老师表达我诚挚的谢意！从论文选题到现在的完成，老师、学长、学姐、同学、朋友们都帮助了我很多，千言万语只能说一句感谢！正是要谢谢大家的无私帮助，这篇论文才会完成，在这里，谨向*老师致以最崇高的谢意！参考文献1 张玉德，王光祥，吴锦艳，等.2007-2010年间我国西北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查J.中国兽医科学，2012(10)：1081-1088.2 李冰，高慎阳，卢赫，等.欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒辽宁分离株全基因测序与遗传演化分析J.畜牧与兽医，2015，47(2)：755-757.3 Li Y，Wang X，Bo K，et al. Emergence of a hi

30、ghly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in the Mid-Eastern region of ChinaJ. The Veterinary Journal，2007，174(3)：577-584.4 安同庆，田志军，李冉，等.我国高致病性猪蓝耳病病毒的潜在起源与演变轨迹.中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集，2010: 377.5 Shi M, Lam T T Y, Hon C C, et al. P坷logeny-based evolutionary, demographical, and geographical dissection of North American type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virusesJ. Journal of virology，2010，84(17)：8700-8711.6 周铁忠.辽宁