第五章单倍体细胞培养

1、第一节第一节 单倍体培养的意义单倍体培养的意义第二节第二节 离体培养条件下的小孢子发育离体培养条件下的小孢子发育第三节第三节 花药培养花药培养第四节第四节 花粉培养花粉培养一、单倍体的概念及发生一、单倍体的概念及发生（一）概念（一）概念1单倍体单倍体 单倍体指具有配子染色体数目的个体单倍体指具有配子染色体数目的个体，即体细胞染色体数目为n。单倍体包括一倍单倍体一倍单倍体和多倍多倍单倍体。单倍体。前者起源于二倍体物种，后者起源于多倍体（如（如4x、6x等）等）。2单倍体培养单倍体培养 将单倍体个体接种到人工培养基上培养，并获将单倍体个体接种到人工培养基上培养，并获得再生单倍体植株得再生单倍体植株

2、。包括花药培养花药培养、小孢子培养小孢子培养、未受精子房及卵细胞培养未受精子房及卵细胞培养等方面。l单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点：个明显的特点：1 1、体细胞染色体数减半；、体细胞染色体数减半；2 2、生长发育弱，体形小、各器官明显减小；、生长发育弱，体形小、各器官明显减小；3 3、雌、雄配子严重败育，有的甚至不能进入、雌、雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。有性世代。 （二）（二）诱发植物产生单倍体主要有四种方法：诱发植物产生单倍体主要有四种方法：1 1、种间和属间杂交。、种间和属间杂交。远缘花粉的的诱导，卵细胞在花粉的刺激下远缘

3、花粉的的诱导，卵细胞在花粉的刺激下进行孤雌发育，生成单倍体。进行孤雌发育，生成单倍体。2 2、物理照射和化学诱变。、物理照射和化学诱变。花粉用射线处理后失去受精能力，然后花粉用射线处理后失去受精能力，然后与母株授粉，卵细胞在花粉的刺激下进行孤雌发育，生成单倍体。与母株授粉，卵细胞在花粉的刺激下进行孤雌发育，生成单倍体。3 3、双生苗的筛选。、双生苗的筛选。有些植物可产生多胚的种子，两个或多个胚有些植物可产生多胚的种子，两个或多个胚被共同的种皮包着，可产生单倍体被共同的种皮包着，可产生单倍体- -单倍体，二倍体单倍体，二倍体- -二倍体，二倍体，单倍体单倍体- -二倍体植株。二倍体植株。4 4、

4、花药和花粉培养。、花药和花粉培养。可产生单倍体胚，或者先诱导单体愈伤组织可产生单倍体胚，或者先诱导单体愈伤组织再经适当途径产生单倍体植株。再经适当途径产生单倍体植株。第五章第五章 1、在植物育种中使后代迅速纯合，缩短育种年限、在植物育种中使后代迅速纯合，缩短育种年限母本母本 父本父本 F2F1品系比较试验品系比较试验区域试验区域试验品种品种花药培养花药培养花粉植株花粉植株加倍加倍选择鉴定选择鉴定5-8代代第五章第五章 2、可以提高选择效率、可以提高选择效率AAbb(母本）母本）aaBB(父本）父本）Ab(雌配子）雌配子）aB(雄配子）雄配子）AaBb(F1）常规杂交育种常规杂交育种不同类型卵不

5、同类型卵ABAbaBab精精子子ABAbaBab单倍体育种单倍体育种AABB AABb AaBB AaBbAABb AAbb AaBb AabbAaBB AaBbaaBbaaBBAaBb Aabb aaBb aabbAABBAAbbAAbbaaBBaabb第五章第五章3、排除杂种优势对后代选择的干扰、排除杂种优势对后代选择的干扰4、突变体的筛选、突变体的筛选5、消除致死基因、消除致死基因6、选育新型自交系、选育新型自交系7、遗传转化的受体材料、遗传转化的受体材料8、基因表达研究的良好实验材料、基因表达研究的良好实验材料一、一、 活体小孢子的正常发育活体小孢子的正常发育二、离体培养条件下的小孢子

6、发育二、离体培养条件下的小孢子发育离体条件下，改变了花粉原来的生活环境，花粉第二次分裂不再像花粉发育离体条件下，改变了花粉原来的生活环境，花粉第二次分裂不再像花粉发育那样由生殖核再分裂一次形成两个精子核，而是像胚细胞一样持续分裂。那样由生殖核再分裂一次形成两个精子核，而是像胚细胞一样持续分裂。离体条件下离体条件下花粉分裂方式有四种类型：花粉分裂方式有四种类型：1 1、营养细胞发展育途径。、营养细胞发展育途径。花粉第一次有丝分裂形成不等的营养核和生殖核，花粉第一次有丝分裂形成不等的营养核和生殖核，生殖核较小，退化，而较大的营养核多次分裂形成细胞团，形成胚状体或者生殖核较小，退化，而较大的营养核多

7、次分裂形成细胞团，形成胚状体或者愈伤组织，最后形成单倍体。愈伤组织，最后形成单倍体。2 2、生殖细胞发育途径。、生殖细胞发育途径。营养核分裂几次退化，生殖核形成细胞团。营养核分裂几次退化，生殖核形成细胞团。3 3、营养细胞和生殖细胞并进发育途径。、营养细胞和生殖细胞并进发育途径。一种情况各自形成愈伤组织或者是一种情况各自形成愈伤组织或者是胚状体，另一种情况为融合后再分裂胚状体，另一种情况为融合后再分裂4 4、花粉均等分裂途径。、花粉均等分裂途径。花粉均等分裂形成花粉均等分裂形成2 2个均等子核，以后形成个均等子核，以后形成2 2个子个子细胞，最后形成胚状体或者愈伤组织。细胞，最后形成胚状体或者

8、愈伤组织。途径一途径二小孢子正常发育途径和培养条件下胚胎发育途径比较小孢子正常发育途径和培养条件下胚胎发育途径比较l途径一途径一 lA A 途径：途径：自然下小孢子第二次分裂及萌发形成花粉自然下小孢子第二次分裂及萌发形成花粉管。管。lB B 途径：途径：营养核重复分裂生殖核败育营养核重复分裂生殖核败育lC C 途径：途径：生殖细胞重复分裂，营养细胞败育。生殖细胞重复分裂，营养细胞败育。l途径二途径二 D D 途径：途径：两个核共同分裂形成单倍体胚。两个核共同分裂形成单倍体胚。 E E 途径：途径：两个核融合后分裂形成纯合的二倍体。两个核融合后分裂形成纯合的二倍体。l花药花药(anther)(a

9、nther)：植物植物花的雄性生殖器官，花的雄性生殖器官，包括二倍体的花药壁、包括二倍体的花药壁、药隔和单倍体的雄性药隔和单倍体的雄性性细胞（花粉粒）培性细胞（花粉粒）培养前要用醋酸洋红压养前要用醋酸洋红压片镜检确定发育时期。片镜检确定发育时期。花药培养花药培养: :将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，( (先先暗培养，愈伤形成后移到光下促进分化暗培养，愈伤形成后移到光下促进分化) )诱导其花粉粒改变发育进诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。（器官培养）程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。（器官培

10、养）A：从裂开的花药中长出胚状体：从裂开的花药中长出胚状体; B、C：从药室中直接长出的幼苗：从药室中直接长出的幼苗;D、E：具有根、茎、叶的小苗：具有根、茎、叶的小苗; F：小苗发达的根系：小苗发达的根系l花药和花粉培养实质：花药和花粉培养实质：把发育到一定阶段的花药（或花把发育到一定阶段的花药（或花粉）接种在人工培养基上，改变花粉的发育途径，使其粉）接种在人工培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化，最终发不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化，最终发育成完整植株的过程。育成完整植株的过程。l 广义的花粉培养，孤雄生殖。广义的花粉培养，孤雄生殖。l 培养

11、类型：花药培养类型：花药-器官培养器官培养l 培养类型：花粉培养类型：花粉-单细胞培养单细胞培养l两者目的一致：诱导花粉细胞发育成单倍体植株两者目的一致：诱导花粉细胞发育成单倍体植株。再生植株途径有再生植株途径有2种：种：1、经由成愈伤组织再生植株、经由成愈伤组织再生植株2、经由胚状体再生植株、经由胚状体再生植株 花药培养的步骤花药培养的步骤1. 取材取材 供体植株最好栽种在温光可控条件下，以保证花的发育条件稳定，试验具有可重复性。花药应取自幼年植株，多数植物以单核中央期单核中央期或单核靠边期单核靠边期为宜。以花的外观形状来确定采花标准，用醋酸洋红压片法或者碘-碘化钾压片法四分体时期单核靠边期

12、花药切片显微观察2. 灭菌及预处理灭菌及预处理 未开放的花蕾，常规灭菌后直接取出花药在45条件下冷处理24d，易产生胚状体。3. 接种接种 尽量不使花药损伤并去除花丝，排除二倍体组织对单倍体植株再生的影响。4. 培养培养 常用培养基有MS、B5、White等，38周后花粉中形成了胚状体或愈伤组织。先暗培养诱导愈伤组织，再转至25，光照2000lx/14h条件下促进分化。影响花药培养的因素：影响花药培养的因素：1 1、供体植株的生长条件：不同的生长季节、环境、供体植株的生长条件：不同的生长季节、环境、不同部位的花蕾，其花粉的生理状态也不同，培养不同部位的花蕾，其花粉的生理状态也不同，培养效果也会

13、有明显的差异效果也会有明显的差异2 2、供体植株的年龄：多数情况下幼年的植株好于老、供体植株的年龄：多数情况下幼年的植株好于老年的植株，但是甘蓝型油菜相反。年的植株，但是甘蓝型油菜相反。3 3、花粉的发育时期：烟草中处于第一次有丝分裂期、花粉的发育时期：烟草中处于第一次有丝分裂期的花粉最好；而在禾本科和芸苔属中，单核早期最的花粉最好；而在禾本科和芸苔属中，单核早期最好。好。4 4、花蕾、花药的预处理：低温、花蕾、花药的预处理：低温5 5、供体植株的基因型、供体植株的基因型6 6、培养基、培养条件及活性碳、培养基、培养条件及活性碳 定义：定义：将发育至一定阶段花粉从花药中将发育至一定阶段花粉从花

14、药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。（类似单细胞培养）分化后再生成苗。（类似单细胞培养） l小孢子：处于四分体到单核早期的花粉小孢子：处于四分体到单核早期的花粉l习惯上，把处于四分体到单核早期的花粉称小孢子。进入单核以习惯上，把处于四分体到单核早期的花粉称小孢子。进入单核以后则称为花粉。后则称为花粉。l四分体四分体单核早期单核早期单核晚期单核晚期双核早期双核早期双核晚期双核晚期三核期三核期小孢子小孢子花粉粒花粉粒花粉发育时期：花粉发育时期：1、适宜时期：、适宜时期：单核期单核期,尤其是单核中、晚期尤其是单核中、晚期(单核单核靠边期靠边期)营养

15、细胞营养细胞生殖细胞生殖细胞精子精子 1 1）花粉漂浮自然释放法）花粉漂浮自然释放法: :将花药接种于液体培养中，使花将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放。粉自然释放。 2 2）人工挤压法）人工挤压法: :用玻璃棒捣碎花药使花粉释放。用玻璃棒捣碎花药使花粉释放。 3 3）机械法）机械法: :用磁力搅拌器打碎花药释放花粉。用磁力搅拌器打碎花药释放花粉。 释放的花粉粒释放的花粉粒 尼龙网（孔径尼龙网（孔径202060um60um）过滤，除）过滤，除去药壁等组织去药壁等组织 500-1000 500-1000转转/ /分离心分离心1-51-5分钟，收集花分钟，收集花粉。粉。花粉培养方法花粉培养方法

16、1. 1.平板培养：平板培养：直接取新鲜花药的花粉粒在平板培养基上进行培养的方法直接取新鲜花药的花粉粒在平板培养基上进行培养的方法2. 2. 液体培养：液体培养：比固体培养法效果好。将花药接种到液体培养基内，在摇床上比固体培养法效果好。将花药接种到液体培养基内，在摇床上振荡（振荡（100100转转/ /分钟），诱导产生胚状体或悬浮细胞培养。需要定期更换分钟），诱导产生胚状体或悬浮细胞培养。需要定期更换培养基（在超净工作台上静置沉淀，去上清，然后加入新培养基）。培养基（在超净工作台上静置沉淀，去上清，然后加入新培养基）。3. 3. 双层培养双层培养( (固固- -液培养）液培养）固相和液相双层培

17、养。固相和液相双层培养。4. 4. 看护培养看护培养：将花药水平放于固体培养基上，在其上覆盖小圆形滤纸，在滤将花药水平放于固体培养基上，在其上覆盖小圆形滤纸，在滤纸滴加纸滴加0.5ml0.5ml含含1010个花粉粒的悬浮液滴的培养方法。个花粉粒的悬浮液滴的培养方法。5. 5. 微室培养微室培养：将一滴花粉悬液滴在盖玻片上，在翻过来放在凹穴载玻片上，将一滴花粉悬液滴在盖玻片上，在翻过来放在凹穴载玻片上，盖玻片四周用石蜡密封。盖玻片四周用石蜡密封。6.6.预培养预培养：将花药先悬浮培养：将花药先悬浮培养2-42-4天（天（5050个花药个花药/5 ml/5 ml），再挤出花粉，经离），再挤出花粉，

18、经离心洗涤纯化后悬浮培养。心洗涤纯化后悬浮培养。7.7.哺育培养哺育培养：将在合适培养基上培养裂开的花药作为哺：将在合适培养基上培养裂开的花药作为哺 育组织，将预培养的花粉接种在其中的方法。育组织，将预培养的花粉接种在其中的方法。 l花粉植株弱小，移栽难。花粉植株弱小，移栽难。l关键关键-保持高空气湿度（保持高空气湿度（80-90% 80-90% ，1-21-2周）；周）；l低土壤湿度。低土壤湿度。l禾本科植株的花药培养中经常出现白花苗禾本科植株的花药培养中经常出现白花苗l原因很多原因很多-没有完好的叶绿体，缺乏叶绿没有完好的叶绿体，缺乏叶绿素，只能异养生长。素，只能异养生长。l内因内因-植株基因型、花药、花粉发育时期植株基因型、花药、花粉发育时期的影响最为明显。的影响最为明显。l外因外因-外部因素为高温、高浓度的外部因素为高温、高浓度的2 2，4-D4-D、延迟转分化培养时间等。但是机理目前还