基因工程(跨课程)综合性实验

1、基因工程（跨课程）综合性实验基因工程（跨课程）综合性实验基因工程·发酵工艺原理·生物技术药物药剂与药动学生命科学与生物制药学院基因工程（跨课程）综合性实验教学小组2007年5月（非正式出版物，请莫外传）目 录前言3一、实验项目4二、实验日程7三、实验分组9四、实验要求与质量控制10五、重组蛋白质药物12（一）重组蛋白药物背景知识12（二）重组蛋白药物实验流程161、工程菌构建.192、工程菌表达筛选.213、甘油种制备.254、生长曲线分析.275、表达影响因素实验.306、表达进程分析.327、工程菌发酵工艺.348、表达产物分离纯化.37附录一：SDS-PAGE.42六

2、、重组DNA药物.44（一）重组DNA药物背景知识.45（二）重组DNA药物实验1、 质粒DNA大规模制备.482、 质粒-脂质体复合物制备523、 TCR体外基因转染、表达检测和活性检测.534、 TCR体内给药试验.60附录二1、 紫外吸收测定.612、 可见光吸收测定.63前 言生命科学与生物技术的最主要任务之一是利用其理论与技术研究成果为人类的健康服务，生物技术制药则是其最主要的应用领域，且在重大传染性疾病、恶性肿瘤及其它疑难杂症防治方面具有巨大的潜力。药品的研究开发是一项庞大的系统工程，实验室研究发现的任何候选药物要开发成新药都需要经过生产工艺和质量控制研究、有效性评价和安全性评价等

3、过程。需要特别指出的是，生产工艺和质量控制研究的内容和任务还会始终贯穿于产品投产上市的过程中，相应的技术手段也是作为企业生产或质量控制人员必备的技能。因此，作为生命科学与生物制药学院的本科生，了解生物技术药物研究、开发和生产的过程、掌握与生产工艺和质量控制研究密切相关的技术手段是非常必要的。以蛋白质为基础的基因工程药物和基因工程抗体是当今最主要的生物技术药物形式，以DNA为基础的基因治疗制剂和DNA疫苗是未来生物制药的主要发展方向之一。基因工程、发酵工艺原理和生物技术药物药剂与药动学是与重组蛋白质和重组DNA类药物的生产工艺与质量控制研究、以及安全性与有效性评价方面关系最为密切的专业课程，且相

4、互构成了基因工程制药的上、下游关系。本综合性实验即为上述三门课程的跨课程综合性实验，其目的在于培养学生理论联系实际的能力，对重组蛋白质和重组DNA等当今和未来最主要的二大类生物技术药物的研究、开发和生产有一个系统的了解，使所学课程的理论知识和实践技能系统化，为以后从事生物技术药物方面的工作打下较好的基础。本综合性实验分为“重组蛋白质类药物”和“重组DNA类药物”二个单元。“重组蛋白质药物”单元设置了包括工程菌构建、发酵和分离纯化工艺等基因工程药物主要工艺研究内容在内的实验项目；“重组DNA药物”单元设置了包括质粒DNA大规模制备、质粒-脂质体复合物制备、体外基因转染和体内给药试验等DNA药物主

5、要研究内容在内的实验项目。在具体实验内容设置时，综合考虑了前修课程分子生物学和生物工程下游技术的实验课已学内容、本综合实验总学时数（108学时）和实验室现有条件等因素。II 重组DNA类药物1、TCR工程菌构建3、TCR质粒-脂质体复合物制备4、TCR体外基因转染I 重组蛋白质类药物1、工程菌构建5、表达进程与影响因素分析4、工程菌生长曲线分析综合实验2、工程菌表达筛选6、工程菌发酵7、表达产物分离纯化2、TCR质粒DNA大规模制备5、TCR转染基因表达检测6、TCR转染体外活性检测7、TCR转染体内试验（药代、药效）一、 综合实验项目（见图1和表1）图1 综合实验单元与项目3、工程菌甘油种制

6、备表1 基因工程（跨课程）综合性实验项目说明序号实验项目学时说 明公开课4介绍综合实验设计思路、内容、流程、实施计划、要求等。I重组蛋白质药物501工程菌构建2已完成。回顾工程菌hIL-18（PR/PL控制下的hIL-18，42诱导）和GST（Ptac控制下的GST，IPTG诱导）的构建。2工程菌表达筛选10从pVB220-hIL-18转化子中随机选取8株，温控表达，SDS-PAGE分析表达结果，选取一高表达菌株作为hIL-18的工程菌。3工程菌甘油种制备2将选定的hIL-18工程菌制成甘油种保存于-70。4工程菌生长分析6利用工程菌生长过程中的菌体密度测定绘制生长曲线、了解生长特性。5诱导时

7、机对工程菌生长与表达的影响10观察生长曲线中的早、中、晚期对菌体生长与目的基因表达水平的影响，以决定表达诱导最佳时机。6工程菌表达进程分析10观察工程菌表达诱导过程中目的产物积累进程。以GST菌株进行。7工程菌发酵2菌种活化起始的发酵工艺全过程及全自控发酵设备与单元操作演示8表达产物分离纯化6超声波法破碎菌体，包涵体分离、纯化，变性与复性、柱层析纯化（示教)。II 重组DNA药物501工程菌构建2已完成，回顾目的基因克隆、表达载体（pDNA3.1-TCR V7.1）构建。2质粒DNA大规模制备10工程菌培养、碱法裂解、阴离子交换柱层析纯化、琼脂糖电泳鉴定、DNA纯度测定。3质粒-脂质体复合物制

8、备6以脂质体包被纯化所获重组质粒，以紫外吸收法测定包封率。4T淋巴细胞体外转染8以质粒-脂质体复合物转染T细胞5转染T细胞目的基因表达检测4以流式细胞仪分析转染T细胞中目的基因的表达情况（学生制备样品、老师操作流式细胞仪）。6转染T细胞体外活性检测10以转染的T细胞攻击肝癌细胞，以流式细胞仪分析杀瘤活性（学生制备样品、老师操作流式细胞仪）。7转染T细胞体内给药试验10荷瘤鼠建模、目的基因体内转染与表达分析（部分内容示教）。实验总结暨试验技能知识竞赛4对综合实验性实验进行总结，讲解实验报告要求，并据情况组织相关知识竞赛。二、实验日程（日期：07/6/407/6/22；作息时间：9:00-21:3

9、0）班级日程04（1）班（先做重组蛋白质药物单元）04（2）班（先做重组DNA药物单元）第1天4日/6月星期一Am：综合实验公开课（课室：B2-314，8:30准时开始）Pm：单元讨论、IL-18工程菌构建、IL-18菌种活化接种和平板划线接种Pm：单元讨论、TCR工程菌构建、TCR菌种活化接种第2天5日/6月星期二工程菌表达筛选（温控表达诱导）工程菌生长曲线分析 质粒DNA大规模制备：碱法裂解、中和、异丙醇沉淀、洗盐第3天6日/6月星期三工程菌表达筛选SDSPAGE（凝胶保存备用），选定菌株，接种 质粒DNA大规模制备：层析纯化、电泳鉴定、紫外吸收法测定质粒纯品纯度和浓度第4天7日/6月星期

10、四工程菌甘油种制备表达影响因素试验（诱导时机的影响）表达进程试验接种（GST菌种）质粒-脂质体复合物制备、包封率测定、T细胞体外基因转染第5天8日/6月星期五表达影响因素试验SDS-PAGE（胶保存备用）表达进程试验（IPTG诱导、不同时间点取样）转染T细胞体外活性检测之一：肿瘤细胞接种，培养第6天9日/6月星期六准备转染T细胞目的基因表达检测：T细胞-肿瘤细胞共培养、流式样品制备和检测第7天10日/6月星期日准备转染T细胞体外活性检测之二：流式细胞仪分析细胞凋亡第8天11日/6月星期一表达进程分析SDS-PAGE（胶保存备用）转染T细胞体内给药实验试验结果讨论与分析、看病理与免疫组化照片第9

11、天12日/6月星期二SDS-PAGE凝胶扫描分析（三次电泳胶）发酵罐观摩（418室）准备第10天13日/6月星期三表达产物产物的分离纯化（示教）试验结果分析与讨论重组DNA药物单元开始，TCR菌种接种准备第11天14日/6月星期四质粒DNA大规模制备：碱法裂解、中和、异丙醇沉淀、洗盐工程菌表达筛选（温控表达诱导）（前一天下午IL-18接试管与平板划线）工程菌生长曲线分析第12天15日/6月星期五 质粒DNA大规模制备：离子交换层析纯化、电泳鉴定、紫外吸收法测定质粒纯品纯度和浓度工程菌表达筛选SDSPAGE（凝胶保存备用），选定菌株。第13天16日/6月星期六准备准备第14天17日/6月星期日下

12、午接种（每组派1个代表）下午接种（每组派1个代表）第15天18日/6月星期一质粒-脂质体复合物制备、包封率测定、T细胞体外基因转染工程菌甘油种制备表达影响因素试验（诱导时机的影响）表达进程试验接种（GST菌种）第16天19日/6月星期二转染T细胞体外活性检测：肿瘤细胞接种，培养表达影响因素试验SDS-PAGE（胶保存备用）表达进程试验（IPTG诱导、不同时间点取样）第17天20日/6月星期三转染T细胞体外活性检测：T细胞与肿瘤细胞共培养表达进程分析SDS-PAGE（胶保存备用）第18天21日/6月星期四转染T细胞体外活性检测与目的基因表达检测：流式细胞仪分析SDS-PAGE凝胶扫描分析（三次电

13、泳胶）发酵罐观摩（418室）第19天22日/6月星期五转染T细胞体内给药实验试验结果讨论与分析表达产物产物的分离纯化（示教）试验结果分析与讨论备注：1）带有阴影字体所述实验的菌株为GST菌株（Tac启动子，IPTG诱导）。2）综合实验公开课安排（第一天，6月4，星期一）8：309：00 黄院长讲话（开设实验的背景、对学生的要求）9：0010：30 全体实验教师亮相，然后由李黄金做综合实验整体介绍10：3010：40 休息十分钟10：5012：00 就实验安排和内容等提问和答疑（双向） （请安排有经验学生摄影)13：30 分班按所进行的实验单元进行工程菌构建回顾与讨论（以实验室分班和小组为单位）

14、三、实验分组1 、分组 每个班按学号顺序分为8组，组号按序依次为18组，每组人数分别为9、9、9、8、8、8、8、8。涉及到排序的实验项目，如在超净工作台上的接种步骤，一律按1到8组顺序进行。2 、编号实验过程中必需对试管、摇瓶等进行标记，故统一进行编号。编号规则为：班代表字母+组号-成员号，A代表1班，B代表2班。举例：04（1）班1组1号同学挑取的转化子标记为A1-1； 04（1）班8组8号同学挑取的转化子标记为A8-8；04（2）班1组1号同学挑取的转化子标记为B1-1；04（2）班8组8号同学挑取的转化子标记为B8-8； 其余以此类推。3 、实验安排 生物制药04（1）班先进行“重组蛋

15、白质药物”单元的实验，然后进行“重组DNA药物”单元的实验。生物制药04（2）班先进行“重组DNA药物”单元的实验，然后进行“重组蛋白质药物”单元的实验。具体教室见实验中心的通知。 4、 注意事项由于综合实验内容比较多，希望各位同学精诚合作，特别是分光光度计、离心机等仪器的使用，由于数量有限，请发扬团队精神，尽量按顺序或同步进行以节约时间。四、实验要求与质量控制 综合实验涉及的知识点和实验技术众多，为了培养学生严谨求实、科学求真之精神，并达到综合实验之最大成效，以下对本综合实验过程的要求进行说明，且纳入实验考核成绩。1、预习 实验前须充分预习，要求随机抽查时，每一位同学能够清晰的阐述整体实验思

16、路和具体的实验项目、原理。2、实验过程除了遵守学校与学院一般实验纪律与要求外，还必须做到主动性、能动性与团队精神相接合，利用有限的资源与时间得到最好的培训与实验结果。为此，本综合实验将能否在规定时间内完成实验内容作为衡量学生动手能力的关键指标之一，并作为考核结果记入实验成绩中。要达到此目的，同学们必须提前仔细阅读实验讲义，全面了解实验内容，透彻理解实验原理，熟悉各个操作步骤，并在实验过程中合理安排时间。3、实验原始记录与结果整理 每天必须及时、真实、完整地记录当天所做实验情况，记录实验过程中的异常情况，分析其原因，并将下述关键性实验结果整理于实验报告纸： I 重组蛋白质药物单元：1）表达筛选与

17、甘油种制备：随机挑选转化子表达诱导SDS-PAGE凝胶扫描照片、筛选确定的工程菌株株号及其表达水平（%）。2）生长曲线分析：选定工程菌培养过程中的OD600测定结果表及生长曲线图。3）表达影响因素试验：不同诱导时机表达诱导实验诱导前、后样品的SDS-PAGE凝胶扫描照片、表达水平、OD600值。4）表达进程试验：工程菌（GST）表达诱导过程不同时间点样品SDS-PAGE凝胶扫描照片、表达水平。5）表达产物分离纯化：示教分析与讨论II 重组DNA药物单元：3） 质粒DNA大规模制备：阴离子交换纯化层析图、提取和纯化过程中样品琼脂糖电泳图、质粒纯品纯度和浓度测定结果。3） 质粒-脂质体复合物制备：

18、包封率测定结果3） 基因转染、体外表达、体外活性、体内给药：示教分析与讨论4、综合实验报告 须按基因工程（跨课程）综合实验论文撰写规范撰写、并提交综合实验报告（电子打印版及电子版）。1）封面：标题： 基因工程（跨课程）综合性实验论文姓名： 班级： 学号： 指导教师：李黄金、周林、胡海梅、赵林、陈伟、段涛、张玲、袁茵薄华本、王金全、吴凤麟广东药学院生命科学与生物制药学院 生物制药研究所2)知识产权申明本综合性实验所采用的工程菌株与工艺技术参数主要来源于广东药学院生物制药研究所的相关课题与研究成果，相关知识产权归广东药学院生物制药研究所所有，未经许可不得擅自影印相关讲义和使用相关工程菌株与工艺技术

19、参数。3)论文内容中英文摘要英文摘要前言材料与方法结果与讨论参考文献致谢五、重组蛋白质类药物重组蛋白质类药物统称基因工程药物，该类药物通用名常冠以“重组”前缀，因采用基因工程或重组DNA技术手段生产而得名。该类药物在化学和生物学本质上属于人源或其它动植物和微生物来源的、具有高度生物学活性的蛋白质或多肽，它们在自然界的含量极微，传统的天然提取工艺常难以达到工业规模和质控要求，而基因工程则为此类活性物质的工业规模高效生产提供了手段。利用基因工程手段生产的最终目的是在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而生产有重要价值的蛋白质产品。广义的基因工程包括外源基因的克隆、表达载体和表达系统的构建、表达

20、生产（发酵）和分离纯化等过程。外源基因表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。目前用于基因工程药物生产的原核表达系统主要是大肠杆菌系统，真核表达系统主要有毕赤酵母（Pichia pastoris）系统和哺乳动物细胞CHO系统。大肠杆菌系统因具有操作简单、表达水平高、生产成本低等优点而在基因工程制药中具有不可替代的地位。本综合实验以hIL-18的大肠杆菌表达系统为例，全面介绍和学习工程菌构建、表达筛选、甘油种制备、生长与表达分析、发酵工艺单元操作和表达产物分离纯等基因工程药物研发与生产实践中最常用的技术与工艺过程。（一）、背景知识1、工程菌及工程菌构建工程菌在基因工程产业中是特指经基因工程手

21、段构建的、用于生产的菌种。工程菌构建包括目的基因的获得、表达载体的构建、转化、转化子表达筛选、传代稳定性分析、鉴定和种子库建立等内容。2、 基因工程药物工艺与质控基因工程药物工艺研究包括工程菌构建与分析、发酵工艺（上游工艺）研究、分离纯化工艺（下游工艺）研究和制剂工艺研究等内容，质控研究则贯穿于工程菌构建和上、下游工艺研究的全过程，并以工程菌菌种库、半成品原液和成品为主要质控点。生产菌种菌种活化种子液制备发酵离心收菌粗提精纯除菌原液稀释、配制冷冻干燥成品图2 基因工程制药最常见工艺流程3、 目的基因在大肠杆菌中的表达形式根据表达产物使用目的的不同和操作方法的差异，目的基因（外源基因）在大肠杆菌

22、内可以以不同形式进行表达。根据表达产物定位可分为胞内表达和分泌表达二种基本形式；根据表达产物多肽链的N端或C端有无其它氨基酸序列可分为融合表达和非融合蛋白等二种基本类型；另外，在胞内表达方式下，根据表达产物的可溶与否，还可分为包涵体方式表达和可溶方式表达。在大多数情况下，非融合蛋白和融合蛋白的胞内高效表达（非分泌表达）产物常以不溶的包涵体形式存在。非融合表达：指目的蛋白的N端和C端均不带有目的蛋白以外的氨基酸残基。为了表达非融合蛋白，使用的外源基因必须具有从起始密码子到终止密码子的完整读码框架。非融合蛋白的一级结构和天然蛋白质相同，是一些体内应用基因工程产品的必要条件，但是小分子非融合蛋白在原

23、核细胞内不稳定，易被降解，而且不易纯化。融合表达：即在目的蛋白的N端或C端带有其它的氨基酸序列。为了表达N端融合蛋白，一般在表达载体的SD序列之后加上起始密码子，其后为一段原核读码框架，接着是克隆位点。外源基因经处理后克隆到该位点，其读码框架必须和上游的原核读码框架符合。表达C端融合蛋白的载体，在SD序列之后为克隆位点，其后是一段带有终止密码子的原核读码框架，将只有起始密码子而没有终止密码子的外源基因插入到克隆位点，必须保持外源基因的读码框架和载体上原核读码框架相符合。融合蛋白在大肠杆菌细胞内较稳定，不易被细胞内的蛋白酶降解。作为融合蛋白一部分的原核多肽往往可以利用来纯化、检测该融合蛋白，这种

24、多肽又称作“标签”（Tag）或受体蛋白，目前最常用的标签有His6和GST。分泌表达：所谓原核细胞的“分泌型表达”是指在细菌胞浆内合成的多肽进入内膜和外膜的周间质，而不是指合成的多肽分泌到细胞外。将一段原核或真核细胞的信号肽序列连接到欲表达基因的上游，在表达的蛋白进入细胞周间质时，信号肽被信号肽切割酶系统（各类蛋白酶）水解，产生游离的表达产物。分泌型表达可以保护外源蛋白不被细胞内的蛋白酶降解，增加表达产物的稳定性。由于表达的蛋白可以在周间隙进行折叠，具有天然蛋白的构象，所以分泌型表达的蛋白一般具有生物活性。分泌型表达的缺点是表达量较低，有时会产生信号肽不完全切割的融合蛋白，有时会发生非特异性切

25、割，应慎使用。4、原核表达载体的基本组成元件启动子：启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达的“发动机”，是基因表达最关键的调控元件。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所应用的启动子必须是原核启动子。将外源基因克隆在其下游，原核RNA聚合酶识别该启动子后，带动真核基因在原核细胞中转录。原核表达系统中常采用可调控的强启动子，基于乳糖操纵子调控模型的启动子是最常用的启动子，包括Lac(乳糖启动子)、LacUV5（突变型乳糖启动子，不受葡萄糖阻遏）、Tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）和T7启动子(来自T7噬菌体的强启动子和RNA聚

26、合酶组合)等，它们可由乳糖诱导，在实践中主要采用不易被降解的乳糖类似物IPTG作诱导剂。PL和PR（噬菌体的左右启动子）是另一类较常用的强启动子，其诱导模式主要基于其阻遏蛋白的温敏型突变子，即高温（42）失活，启动目的基因转录。SD序列：在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3-10bp处的由3-9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA的3末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点，即为SD序列。SD序列与AUG的距离将显著地影响基因的表达水平。转录终止子：构建表达载体时，为了防止目的基因表达时转录过头和干扰载体的稳定性

27、，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的转录终止序列或采取双终止子串联。复制起点：载体自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定拷贝数的质粒。在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起点。标记基因：表达载体通常采用的标记基因是抗生素抗性基因，有利于重组表达载体转化子的筛选，常用的抗生素筛选标记基因为氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因。5、人白介素18（hIL-18）hIL-18又称IFN-诱生因子，由活化的巨噬细胞产生，主要生物学活性是诱导Th1细胞产生IFN-，诱导T细胞产生GM-CSF，促进T细胞和NK细胞增殖分化、促进Fas配体表达，抑制新血管形成，因此，在感染性疾病、恶性肿瘤和

28、免疫性疾病方面具有较大的潜在应用价值。成熟的hIL-18是由157个氨基酸残基组成的多肽，分子量约为18KD，不含信号肽和糖基化位点，内含4个半胱氨酸残基，但并不形成二硫键。 本实验单元即以hIL-18为重组蛋白质药物代表。（二） 重组蛋白药物模块实验流程1. 工程菌构建8株菌体+非诱导菌体+Marker接LB+AP试管（8株，编号）37振荡培养过夜转接LB+AP试管shi37培养2.5-4hrSDS-PAGE42诱导培养4hr 2.3 表达筛选SDS-PAGE从划线平板选择对应高表达菌株LB+AP平板划线（编号）shi平板4保存2.表达筛选2.1 菌种活化2th3th综合实验课公开课（上午）

29、绘制生长曲线分析转接LB+AP摇瓶37静置培养过夜37培养过夜37培养转接LB+AP摇瓶shi不同时间点取样shi测OD值shi1th 工程菌构建回顾2.2 表达诱导4.生长曲线分析确定高表达菌株离心收菌，4保存 脱色凝胶置于10%甘油保存至第7天扫描，求表达水平3. 工程菌甘油种制备每人1支，-20保存5. 表达影响因素试验（诱导时机）脱色凝胶置于10%甘油保存至第7天扫描5th 4th早、中、晚期诱导4hr不同时间点取样SDS-PAGE测OD值3×2菌体样5.2 表达因素实验SDS-PAGESDS-PAGE 凝胶扫描分析6th 7发酵工艺（观摩）6. 表达进程分析转接LB+AP摇

30、瓶shiIPTG诱导5hr转接3×LB+AP（20-50ml）诱导前后取样取GST菌株接2 mlLB+AP37培养过夜5.2 表达诱导6.2 表达进程分析SDS-PAGE诱导0、1、2、3、4、5hr菌体样SDS-PAGE脱色凝胶置于10%甘油保存至第7天扫描7th 8、表达产物分离纯化工程菌破菌、包涵体纯化、变性、复性、纯化（示教）重组蛋白药物模块试验结果分析与讨论8th 实验一 工程菌构建（工程菌构建回顾）1. pBV220-hIL-18表达载体和工程菌构建在本综合性实验中目的基因的表达载体为pBV220，该载体的物理图谱见图2。该载体有一个氨苄青霉素抗性基因，在多克隆位点的上游

31、为噬菌体的PL 和PR启动子，PL 和PR启动子受噬菌体CI基因的负调控。CI阻遏蛋白是温度敏感蛋白，在28-37培养时，CI产生抑制作用，在温度升至42时，CI被破坏，这样就解除了对启动子的封闭，使PL 和PR启动子开始下游基因转录。目的基因为hIL-18的编码序列（cDNA），采用RT-PCR技术从外周血细胞中获得。首先据Genebank报道序列设计引物，并在引物的5端引入EcoR I位点和启始密码子ATG，在3端引入Hind 位点。IL-18基因的RT-PCR扩增产物经EcoR I和Hind 双酶切插入表达载体pBV220的相同位点即得hIL-18的表达载体pBV220-hIL-18。构

32、建的表达载体pBV220-hIL-18按常规方法转化大肠杆菌DH5株后即得“重组hIL-18”的工程菌。图3 pBV220的物理图谱2. pGEX-GST表达载体和工程菌构建pGEX-GST为商品化融合表达载体，主要用于外源基因的可溶性融合表达。GST（谷胱甘肽转移酶）为大肠杆菌宿主细胞的天然高效、可溶性表达的蛋白。以其作为融合表达“标签”有二点优势：a) GST可以促进二硫键的形成，使目的基因融合表达产物能正确折叠，因而常以可溶的表达产物存在；b)GST属于大肠杆菌高效表达的天然产物，其mRNA的5端具有最适的结构，有利于融合基因mRNA的翻译，因此可大大提高融合基因表达水平。在pGEX-G

33、ST中，GST处于复合启动子Tac的控制之下，因此可采用IPTG诱导。其载体如图4所示，图中所示载体中还有一个特殊设计，即GST与目的蛋白的融合位点位PreScission蛋白酶识别位点，融合蛋白可在4下进行酶切反应，可避免其它蛋白酶类37那样的高温条件对目的产物的破坏。本综合实验中采取的是无外源基因的载体，即只表达GST，主要用于给同学们展示与pVB220-hIL-18不同的另一种启动子和表达诱导方式（PL/PR vs Tac；温控vs IPTG诱导），并便于“表达进程分析”。图4 pGEX-GST的物理图谱实验二 工程菌表达筛选一、实验目的学习与掌握大肠杆菌系统工程菌表达筛选的方法。二、实

34、验原理含目的基因的表达载体转化宿主细胞后，会得到很多含有重组子的克隆，但这些含有重组子的不同克隆表达目的蛋白的能力是不相同的。首先诱导不同克隆进行目的基因表达，然后利用SDSPAGE对菌体总蛋白进行分离，再通过凝胶扫描分析各克隆的目的产物表达水平差异即可筛选到高表达菌株。三、实验试剂1、 pBV220-hIL-18转化平板2、 LB培养基：胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，定容至1L，用5M NaOH调PH值至7.0。15psi（1.05Kg/cm2）高压蒸汽灭菌20min。3、 琼脂粉4、 氨苄青霉素：储存液浓度50mg/ml，用水溶，保存于20。工作浓度：松弛型质粒5

35、0ug/ml，严紧型质粒20ug/ml。5、 2×SDS上样缓冲液：0.1mol/LTris（pH6.8）、4SDS、20甘油、0. 2溴酚篮、200mmol/L DTT（或10巯基乙醇），4保存。6、 10APS，TEMED和DTT存放在4冰箱。7、 10×电泳缓冲液：Tris 6g、glycine 28.8g、SDS 10g，pH调至8.3，定容至1L。8、 30胶母液（AcrBis）：30acrylamide、0.8bis（即acrylamide 30g、bis 0.8g 定容至100ml），可在4存放数月。9、 分离胶缓冲液（pH8.8）：1.5M TrsiHCl。

36、10、 浓缩胶缓冲液（pH6.8）：1.0M TrsiHCl。11、10SDS12、考马斯亮篮染色液：1.25g考马斯亮篮R250、450ml甲醇、50ml冰醋酸、500ml水。13、脱色液：450ml甲醇、50ml冰醋酸、500ml水。14、10%（V/V）甘油四、实验用具无菌竹签、微量移液器、平皿、10-15ml带螺口或带塞试管、恒温摇床、4冰箱、离心机、EP管、电炉、电泳仪、垂直电泳装置、台式脱色摇床、凝胶成像系统。五、实验方法（一）目的蛋白的诱导表达1、转化（已完成）：转化后的细胞在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，培养过夜后，在平板上会长出许多抗性菌落（转化子）。2、菌种活化

37、和平板划线接种在无菌操作条件下，用无菌竹签随机挑取中等大小菌落的克隆，先在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB平板上轻轻划线接种，线长约为1cm，随后用带有残余菌体的牙签接种含有2ml LB培养基（含50ug/ml氨苄青霉素）的带盖螺口试管，如此类推。每个学生接种1株，共接种8个转化子单克隆，每个小组共用一个平板；及时、准确做好划线平板与试管的对应编号和平板编号标记。平板和试管种分别置于37培养箱和摇床培养过夜。3、把培养过夜的画线平板保存于4冰箱。4、取2步骤所得支试管的菌液（20ul）按1：100的接种比例分别接种到8支含有2ml LB培养基（含50ug/ml氨苄青霉素）的试管中， 37培养

38、2.5hr，42诱导培养4hr。每个小组设一非诱导对照，即以该组编号排首位的过夜活化菌种接种一支试管，标记为CK1，37培养2.5hr收菌，不做42表达诱导。5、离心收菌 表达诱导至4hr后，将试管收集、并置于4保存备用。（二）工程菌表达筛选SDSPAGE1、样品组成： 每小组共用一胶，每胶10孔，1号孔为非诱导菌体蛋白（对照CK1），2-9号孔为自小至大编号的菌株诱导菌体蛋白，10号孔为蛋白质分子量标准（MM）。2、菌体样品处理取培养物100ul于EP管，5000g×5min离心，弃上清，菌体加入40ul上样缓冲液，100水浴3min，待冷却后10000g×10min离心

39、，小心吸取上清，转入另一标记好的EP管，室温保存备用（如长期放置，则置于4保存，电泳前再煮沸2分钟）。3、SDS-PAGE参照附件所述详细方法进行。胶浓度：分离胶浓度12%；浓缩胶5%；上样量：15 ul恒流: 浓缩20mA，分离30mA；染色、脱色：甲醇/冰醋酸系统凝胶保存：10%甘油，室温，至凝胶扫描分析。（三）凝胶扫描分析参照附件所述详细方法进行。六、注意事项1、转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素的LB平板上进行培养，接种到试管中的菌落必需是单菌落，并且要同时进行划线培养。2、进行划线培养时各条线之间不能太密集，防止交叉污染。3、样品加上上样缓冲液煮沸后，一定要进行离心，以除去颗粒物质

40、。4、电泳上样时要小心，不要污染旁边的泳道。七、评议1、过夜培养所得菌体按1：100接入到新的培养基中后，37培养2.5hr一般能达到OD6000.6，此时即为对数中期。但是各菌株间生长速度常有较大差异，所以菌体密度常不相同，但以相同时间和条件培养、诱导能基本反映出菌株生长速度和表达水平差异，因此，各试管（菌株）之间的培养时间一定要相同。2、电泳中出现不规则的蛋白迁移带是因为电泳不稳定，其它原因还包括样品加量太多、样品中的盐浓度太高、边缘效应。如果在凝胶边缘电泳条带出现“微笑”状的样品（运动速度减慢），可能是因为凝胶的中间比两侧更热，应降低电流。八、思考题1、单克隆接种到试管中培养时，为什么同

41、时进行划线培养？2、SDSPAGE中蛋白质样品上样前，加入上样缓冲液的目的是什么？为什么还要在100沸水中，加热3-5min？实验三 工程菌甘油种的制备一、 实验目的 将高表达的工程菌制备成可中、长期保藏的菌种，掌握甘油种的制备方法。二、 实验原理菌种保存是工程菌研究和生产应用的基础，为了避免长期传代可能引起的菌种变异，应建立适合长期保藏的工程菌菌种并进行保藏。菌种保藏的方法主要有固体斜面法、甘油冻存法、冷冻干燥法。本实验采用甘油种结合超低温（-70）保存的方法，即用无菌甘油悬浮工程菌，并使甘油终浓度为30%（V/V），所获物即为工程菌的甘油种。低温可使工程菌的生命活动处于非活跃状态而能较长时

42、间保存细胞活力、减少基因变异，而30%的甘油可保护菌种的细胞膜系统在冷冻与解冻循环中不被破坏而起到保护作用。 三、 实验试剂和实验用具1. pBV220-hIL-18转化子划线平板2. 抗性LB液体培养基3. 抗性LB平皿4. 60甘油 121，30分钟高温灭菌5. 菌种保存管（EP管） 121，30分钟高温灭菌6. 10ml螺口试管 121，30分钟高温灭菌 7. 恒温培养箱8. 恒温振荡器9. 无菌工作台10. 灭菌牙签与酒精灯四、 实验方法1. 在实验二中所获平板上确定高效表达的转化子所对应的菌株，并用灭菌竹签接种于一个含2ml抗性LB培养基的试管中。2. 37振荡培养过夜（10-15小

43、时）。3. 按1：1（V/V）的比例加入无菌的60甘油，混匀后分装至事先灭菌的菌种保存管（1ml/管），-70保存。五、 实验注意事项 此过程全部在无菌工作台中操作，注意操作保持始终无菌。实验四 工程菌生长曲线分析一、实验目的 学习用比浊法测定工程菌的生长曲线并了解其特点，掌握工程菌生长曲线的绘制方法及测定原理，理解生长曲线在研究和生产中的应用。二、实验原理 将工程菌按一定比例接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌体量，以菌体量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规

44、律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。 三、实验材料3.1菌种 IL-18工程菌3.2培养基 LB培养基（Amp+）3.3试剂

45、去离子水四、实验仪器与器具可见光分光光度计（配1cm光程的比色杯），恒温摇床，超净工作台，移液器，Tip头，EP管，玻璃试管，500mL的三角瓶，擦镜纸。五、实验步骤与方法实验流程为：种子液接种培养测定 5.1种子液制备 取IL-18工程菌的甘油菌种1管，按1%的接种量在超净工作台取20uL，接入2mL LB(Amp+)中，然后倾斜地置于摇床中，37，170rpm摇床培养过夜。5.2接种培养并取样 按1%的接种量，在超净工作台将过夜培养的2mL IL-18工程菌种子液，接入到200mL LB(Amp+)中，摇匀后取出3mL置于EP管中，用于测0小时的OD值。将摇瓶放在摇床中，37，170rpm

46、振摇培养。此时开始计时，然后每培养1小时将三角瓶取出置于超净工作台中，取样测定其OD值，共测定8小时。其中，前3小时每次取样3mL，之后每次取样1mL。5.3生物量测定 开启可见光分光光度计电源，调节波长至600nm，将光标移至T处，打开样品室的盖子，预热30min。取3mL未接种的LB(Amp+)培养基装入1cm光程的比色杯中，置于样品室中第一个样品槽中，使可见光射入此比色杯中，作为空白对照，仪器将自动调零。将待测样品加入比色杯中（前3个样品由于OD值低可直接加入，后续的样品由于OD值高需用2mL LB稀释后再加入。），盖上盖子，将光标调至A处，空白样品的OD值自动调整为0。拉动拉杆，依次对

47、样品读数，并记录。5.4生长曲线绘制将测定的OD值填入下表： 时间0h1h2h3h4h5h6h7h8hOD以上述表格中的时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制IL-18工程菌的生长曲线。 六、实验注意事项用可见光分光光度计测量菌液OD600值时，该值在0.300.80以内时，OD600与菌液浓度成正比，超过此范围，就不成正比了。对浓度大的菌悬液用未接种的LB液体培养基适当稀释后测定，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。七、评议 在本实验中，通过从同一培养物中每隔一小时取相同量的样来测其OD600，从而绘制生长曲线。也可用相同的菌种，同时培养若干瓶菌液，每一小时取出一瓶

48、停止培养来测其OD600值，下一小时再取出一瓶，一直到培养的最后一小时只剩下一瓶，通过此方法可以避免取样对微生物生长培养造成的影响。八、思考题1用本实验方法测定微生物生长曲线，有何优点？ 2若同时用平板计数法测定，所绘出的生长曲线与用比浊法测定绘出的生长曲线有何差异？为什么？ 实验五 工程菌表达影响因素实验一、实验目的 了解和掌握诱导时机对工程菌表达的影响，进一步理解工程菌生长和表达的矛盾关系，通过实验确定出IL-18工程菌最佳的诱导时机。二、实验原理基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。加入诱导因子的时间被称为诱导时机。对于基因工程菌一般选择

49、其对数生长期作为菌体的诱导时机。如果在对数生长早期进行诱导，由于菌体量较少，蛋白的表达量不高。在对数生长中期进行诱导，工程菌的生长速度比较快，这时蛋白的积累加快，蛋白表达水平较高。而菌体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，氧气的缺乏及代谢产物的积累，使菌体的生长速度明显受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受到影响。三、实验试剂3.1菌种 IL-18工程菌3.2培养基 LB培养基（Amp+）3.3试剂 去离子水四、实验仪器与器具恒温摇床，超净工作台，移液器，台式高速离心机，Tip头，EP管，玻璃试管，100mL的三角瓶，SDS-PAGE电泳设备。五、实验步骤与方法5.1种子液制备 取IL-18

50、工程菌的甘油菌种1管，按1%的接种量分别接入3管2mL LB(Amp+)液体培养基中，然后倾斜地置于摇床中，37，170rpm摇床培养过夜。5.2接种培养并诱导表达按1%的接种量，将3管过夜培养的IL-18工程菌种子液，分别接入到30mL LB(Amp+)中，同时置于摇床中37，170rpm振摇培养。培养至2.5h时，取出一瓶，在超净工作台中取出3mL测其生物量，然后做好标记，转移至42进行诱导表达。当培养至4h时，再取出一瓶，同样地取出3mL测生物量、标记、转移至42诱导表达。当培养至6h时，取出最后一瓶，如前取样、标记、诱导表达。三瓶菌体均诱导表达4h。5.3诱导表达结束菌体处理三瓶菌体经

51、过4h诱导表达后，从摇床中取出，掏匀后吸取1mL用于测定生物量，另取1mL置于-20冻存。5.4 SDS-PAGE检测不同诱导时机的表达量将-20冻存的菌体解冻后，取出100uL，10000rpm离心3min，弃掉上清，用40uL 2×上样缓冲液悬浮起来，按实验一和附录一进行SDS-PAGE电泳。六、思考题根据结果中的OD值和SDS-PAGE电泳的结果，分析工程菌生长和表达的关系。实验六 工程菌表达进程分析（GST）一、实验目的 通过研究GST工程菌蛋白表达随时间的变化关系，了解和掌握诱导时间对菌体表达量的影响，确定GST工程菌的最佳诱导时间。二、实验原理 诱导时间是指加入诱导剂后的培养时间。随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。理论上足够长时间里，菌体的表达随时间呈“S”曲线型。三、实验试剂三、实验试剂3.1菌种 GST工程菌3.2培养基 LB培养基（Amp+）3.3试剂 去离子水、0.2g/mL IPTG四、实验仪器与器具恒温摇床，超净工作台，移液器，台式高速离心机，Tip头，EP管，玻璃试管，100mL的三角瓶，SDS-PAGE电泳设备。五、实验步骤与方法5.1种子液制备 取GST工程菌的甘油菌种1管，按1%的接种量分别接入1管2mL LB(Amp+)液体培养基中，然后倾斜地置于摇