EGFR详解学习教案

1、会计学1EGFR详解详解(xin ji)第一页，共36页。Sample & Assay Technologies- 2 -第1页/共36页第二页，共36页。Sample & Assay Technologies- 3 -第2页/共36页第三页，共36页。n非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的肺癌种类。目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌临床治疗的重要手段。易瑞沙和特罗凯作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs），是目前批准用于非小细胞肺癌靶向治疗的主要药物。大量研究和临床试验证明易瑞沙和特罗凯对EGFR基因突变的患者有效率显著(xinzh)优于化疗。nEGFR基因可

2、编码表皮生长因子受体（EGFR）蛋白。EGFR基因酪氨酸激酶结构域的突变能够促进肿瘤的生长和增殖。在美国有近10%的非小细胞肺癌患者发现了EGFR基因突变，在东亚该比例达到35%。除此之外，6%的脑瘤患者也发现了EGFR突变。nEGFR RGQ PCR Kit可检测EGFR基因的29种体细胞突变，用于辅助临床医生筛选可受益于易瑞沙（吉非替尼）、特罗凯（厄洛替尼）和凯美纳（埃克替尼）等靶向药物的非小细胞肺癌患者 。- 4 -第3页/共36页第四页，共36页。Sample & Assay Technologies- 5 -第4页/共36页第五页，共36页。Sample & Assa

3、y Technologies试剂反复试剂反复(fnf)冻融不超过冻融不超过7次次 - 6 -第5页/共36页第六页，共36页。nEGFR positive control（PC）n 阳性对照，包含所有(suyu)分析使用的模板nInternal control（IC）n 用来检测体系中是否存在抑制剂，是一段合成的非人类序列nNo Template Control（NTC）n 无酶水nControl Assayn 评估样本DNA质量，检测EGFR基因外显子2区域nMutation Assay(s)n 检测EGFR基因中的已知突变第6页/共36页第七页，共36页。Sample & Assa

4、y Technologies- 8 -第7页/共36页第八页，共36页。n外显子19缺失突变（检测19个可能存在(cnzi)的任何一个缺失突变，但不加以区分）nT790MnL858RnL861QnG719X（检测G719S，G719A或者G719C但是不加以区分）nS768In外显子20插入突变（检测3个可能存在(cnzi)的任何一个插入突变，但不加以区分）第8页/共36页第九页，共36页。Sample & Assay Technologies- 10 -第9页/共36页第十页，共36页。PCRTechnologyFunctionIdentifies the presence of a

5、 mutationAmplifies the sample to detectable levelsSignals the presence of the mutation第10页/共36页第十一页，共36页。(ppi)时，扩增会继续进行。当时，扩增会继续进行。当3端碱基端碱基不匹配不匹配(ppi)时，只会出现较少的背景时，只会出现较少的背景扩增。扩增。技术技术(jsh)原理原理第11页/共36页第十二页，共36页。Scorpions （蝎型探针）（蝎型探针）使用使用(shyng)Scorpions技术可检测扩增。技术可检测扩增。Scorpions分分子具有两种功能，并且含有与探针以共价键相连

6、的子具有两种功能，并且含有与探针以共价键相连的PCR引引物。探针中的荧光集团与淬灭基团反应，与探针结合，荧物。探针中的荧光集团与淬灭基团反应，与探针结合，荧光强度减小。在光强度减小。在PCR反应过程中，当探针与扩增子结合，反应过程中，当探针与扩增子结合，荧光基团和淬灭基团分离。因此反应离心管中的荧光强度荧光基团和淬灭基团分离。因此反应离心管中的荧光强度增加。增加。技术技术(jsh)原理原理第12页/共36页第十三页，共36页。探针组成(z chn)元件技术技术(jsh)原理原理第13页/共36页第十四页，共36页。Scorpions引物退火在探针(tn zhn)目标区上游技术技术(jsh)原理

7、原理第14页/共36页第十五页，共36页。Scorpions引物被DNA聚合酶延伸，扩增目标区域新扩增的区域和探针末端互补blocker使得(sh de)DNA聚合酶不会扩增探针区技术技术(jsh)原理原理第15页/共36页第十六页，共36页。温度(wnd)升高后，扩增的Scorpions引物和目标DNA变性技术技术(jsh)原理原理第16页/共36页第十七页，共36页。没有扩增产物的引物自退火没有荧光信号，而有扩增的产物引物由于(yuy)探针和探针和扩增区域退火，荧光集团远离淬灭集团，发出荧光技术技术(jsh)原理原理第17页/共36页第十八页，共36页。技术优势技术优势灵敏度高灵敏度高能够

8、准确能够准确(zhnqu)检测出含量低至检测出含量低至1%的突变的突变DNA，而传统，而传统DNA测序只能检测测序只能检测到到25%可靠性高可靠性高带有内外控，排除假阴性、假阳性反应，扩增产物在带有内外控，排除假阴性、假阳性反应，扩增产物在100-150bp，FFPE样本成样本成功率可达功率可达95%操作性强操作性强流程简单，操作方便，仪器要求低流程简单，操作方便，仪器要求低技术技术(jsh)原理原理第18页/共36页第十九页，共36页。Sample & Assay Technologies- 20 -第19页/共36页第二十页，共36页。Sample & Assay Tech

9、nologies- 21 -样本样本(yngbn)提取提取第20页/共36页第二十一页，共36页。n使用新的手术刀削去石蜡层。n切取2片10m的切片，如果样本表面暴露在空气中，那么放弃前面2-3片。如果最后得到的DNA不够，可以适当增加片数。n使用新的手术刀快速转移切片到1.5ml或者(huzh)2ml离心管中，加入1ml二甲苯，涡旋振荡10s。n室温全速离心2min。n小心用枪头吸取上清，吸取上清的时候不要碰到沉淀物。n在沉淀中加入1ml乙醇(96-100%)，涡旋混匀(乙醇的作用是将样本中的二甲苯去除)。n室温全速离心2min。n小心用枪头吸取上清，吸取上清的时候不要碰到沉淀物。n开盖，在

10、室温下(15-25，最高不要超过37)静置10min至所有乙醇残液挥发。n加入180l Buffer ATL重悬，加入20l蛋白酶K，涡旋混匀。n56下温浴1h，直至所有样本完全裂解。n90下温浴1h，放入离心机轻甩（温度过高或时间过长都会造成DNA片段化严重）。根据根据(gnj)QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook第21页/共36页第二十二页，共36页。n加入200l Buffer AL，涡旋震荡，彻底混合溶解产物。加入200l乙醇（96-100%）至样本中，涡旋震荡。n瞬时(shn sh)离心。n小心的转移全部裂解物至离心柱中，尽量不打湿边缘

11、，盖紧盖子，6000g（8000rpm）离心1min，弃废液，更换收集管。n加入500l Buffer AW1，尽量不打湿边缘，盖紧盖子，6000g（8000rpm）离心1min，弃废液，更换收集管。n加入500l Buffer AW2，尽量不打湿边缘，盖紧盖子，6000g（8000rpm）离心1min，弃废液，更换收集管。n全速离心（20000g；14000rpm）3min，弃废液。n将离心柱置于一个新的1.5ml离心管中，加入200l平衡至室温的Buffer ATE到膜的中央。n室温(1525C)静置1min，全速离心（20000g；14000rpm）1min。n储存在15到25。根据根据

12、(gnj)QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook第22页/共36页第二十三页，共36页。Sample & Assay Technologies- 24 -第23页/共36页第二十四页，共36页。第24页/共36页第二十五页，共36页。n打开(d ki)运行结果文件n在原始曲线页面，点击“Options”，选择“Crop start cycles”n在“Remove data before cycle”页面输入15，点击“OK”第25页/共36页第二十六页，共36页。n选中“Dynamic Tube”，点击“Slope correct”和“L

13、inear scale”，设置threshold为0.075，观察FAM通道Ct值第26页/共36页第二十七页，共36页。Control assayHEXFAMResultNTC23.00-37.00 40 or no CtOKEGFR positive control23.00-37.0026.26-30.95OKSample23.00-37.00 30.69Re-extraction第27页/共36页第二十八页，共36页。Sample & Assay Technologies- 29 -第28页/共36页第二十九页，共36页。n反应体系n程序(chngx)设置第29页/共36页第三

14、十页，共36页。Sample & Assay Technologies- 31 -第30页/共36页第三十一页，共36页。n打开运行结果文件(wnjin)n在原始曲线页面，点击“Options”，选择“Crop start cycles”n在“Remove data before cycle”页面输入15，点击“OK”第31页/共36页第三十二页，共36页。n选中“Dynamic Tube”，点击“Slope correct”和“Linear scale”，设置threshold为0.075，观察FAM通道Ct值第32页/共36页第三十三页，共36页。Mutation assayHEXFAMNTC23.00-37.00 40 or no CtEGFR positive control23.00-37.0026.26-30.95mutation Ct control Ct = Ct第33页/共36页第三十四页