药理实验方法学

1、药理实验方法学 肝纤维化南京中医药大学药学院南京中医药大学药学院 郑仕中郑仕中 教授、博导教授、博导 2009年AASLD (American association for the study of liver diseases)主席、美国西奈山医学院肝病研究中心主任弗里德曼（Friedman）教授在专题会上介绍了肝纤维化模型的研究历史和进展。肝纤维化主要的模型包括动物模型和体外模型。 目前的肝纤维化动物模型可模仿人肝硬化发生过程，是研究肝硬化发病机制和药物疗效的重要方法。 肝纤维化是肝脏对各种原因所致肝损伤的创伤愈合反应，表现为肝内结缔组织增生与沉积，是慢性肝病重要的病理特征，也是进一步向

2、肝硬化发展的重要环节。 在体外模型上，肝星状细胞（HSC）在肝纤维化发病中的作用得到深入探讨。HSC梯度离心分离和体外培养研究的建立与推广应用始于上世纪八十年代，为研究肝脏基质的产生和作用（如硬度、收缩性、组成、比较生物学等）提供了有力工具，并证实HSC具有产生胶原等细胞外基质的能力，在肝损伤和纤维化发病中起重要作用。 研究证实，HSC体外激活模型可复制许多但不是全部的体内激活特征。因此分离和培养肝脏内其他细胞也极为重要。动物模型 临床上肝纤维化的发病机制较为复杂，涉及到病毒复制、炎症介质释放、免疫功能紊乱、自由基损伤等多个环节。因此，在抗肝纤维化药物研究中可采取在损伤机制不同的多个模型上观察

3、药物的保肝作用，综合判断药效和作用机制。以下介绍几种目前国际上常用的肝纤维化模型，中毒机制的研究也较为深入。肝纤维化造模 肝纤维化动物模型的建立方法主要包括：化学药物或毒物所致肝纤维化实验动物模型，如:四氯化碳；胆管阻塞 (BCM)、慢性酒精中毒性、实验性免疫法、致癌物致肝纤维化动物模型等。 动物的选择:主要有小鼠、大鼠、鸭、家兔、家犬、猕猴等,但从造模的成功性、简便性、稳定性及经济性等方面考虑,目前大多选择大鼠制备模型。HF造模： CCl4 法制备HF动物模型 致癌物及毒物（化学性）HF动物模型 胆管阻塞法诱导HF模型 免疫性HF动物模型 高脂造HF模型 血吸虫性HF动物模型的制备 金属离子

4、摄入建立HF模型 复合因素致肝纤维化模型 四氯化碳(CCI4)诱导的肝纤维化模型： 四氯化碳又称四氯甲烷,主要用于制造二氯二氟甲烷和三氯氟甲烷,还可用于制造氯仿和其它药物,也可用作溶等。 CCl4法造模的途径有口服、腹腔注射及皮下注射,依据药途径和剂量的不同,所需时间8周至4个月不等。动物实验研究证明,四氯化碳除致急性肝损伤外,反复多次的刺激可导致慢性肝损伤的发生,主要表现为肝细胞再生和肝纤维化。临床研究表明,四氯化碳是引起人类肝损害的剧毒类化学药物。 原理:是CCl4进入机体后在肝内活化成自由基(.CCl和.00Cl3),后者可直接损伤质膜,启动脂质过氧化作用,破坏肝细胞的膜性结构等,造成肝

5、细胞变性坏死。 方法：一般采用60%CCI4橄榄油溶液给雌性SD大鼠以0.3ml/100g体重皮下注射,每周2次,共12周,肝功能检查模型组谷丙转氨酶、总胆红素均较对照组明显升高,血清白蛋白水平则明显下降,PC、LN、HA含量测定较对照组均显著增高,病理组织学证实造模组大鼠有典型的假小叶形成,纤维间隔增宽,形成肝纤维化。模型特点： CCl4进入动物体内后,可直接进肝细胞,使肝细胞变 性、坏死,诱导肝纤维化的形成。造模途径多样、简便、病理特征稳定可靠、造模时间短,已广泛用于研究肝纤维化发生的细胞及分子机制、血清学标志物与组织病理的相关性及抗纤维化物质的药效评价。 缺点是对于相同的CCl4处理,不

6、同动物出现肝细胞坏死和肝纤维化的程度个体差异较大,导致不一致的组织 学和病理生理学表现。此外,CCl4的肝毒性作用迅速而剧烈,若剂量掌握不当,动物死亡率很高。二甲基亚硝氨(DMN)诱导肝纤维化大鼠模型：原理： DMN具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性。大鼠染毒后肝内小叶炎性细胞浸润,出血性坏死。在肝内形成中心-中心纤维间隔或中心-门脉性纤维间隔。方法： 用SD大鼠按10 mg/kg的剂量,给予1%DMN生理盐水稀释液,腹腔注射10次,模型组大鼠均形成肝纤维化或早期肝硬化。模型特点： 该模型造模周期短,大鼠死亡率低,肝纤维化形成也相对稳定。在评价药物对伴凝血障碍、纤溶亢进的慢性肝病致纤维化的防治方面

7、是一个比较理想的模型。 缺点是小剂量不易形成肝纤维化,大剂量又容易形成肝细胞坏死后纤维化,剂量不容易掌握。胆汁性肝纤维化动物模型:原理： 通过结扎胆管或注入硬化剂等方法人为地造成肝外胆道梗阻,从而引起梗阻部位以上胆管扩张、胆汁淤积、 胆道内压力增高,由于肝内血管受到扩张胆管的压迫及胆外 渗,肝细胞发生缺血和坏死,纤维组织增生向胆管伸展,包绕肝小叶,形成肝纤维化。方法： 对雌性Wistar大鼠采用胆管结扎与切断和逆行性注入N-丁基-2氰基丙烯酸盐胆管粘堵的方法导致胆管阻塞,建立肝纤维化模型。模型特点： 采用胆总管结扎的方法可在狗、大鼠、猴等动物中制作出实验性胆汁性肝纤维化肝硬化模型,被认为是一种

8、能模拟人肝纤维化的较理想动物模型,主要用于考察药物的直接抗纤维化作用及用于筛选非创伤性肝纤维化血清指标等的研究。 该模型主要特点是成型快、炎症反应轻、肝细胞坏死不明显、自发逆转率低、实验指标稳定。乙醇法：原理： 肝脏是乙醇代谢的主要场所,90%以上的乙醇在肝脏通过乙醇脱氢酶(ADH)和微粒体乙醇氧化酶系统(MEOS)进行氧化代谢,乙醇脱氢酶和微粒体乙醇氧化酶系统通路均可产生毒性代谢产物乙醛。乙醛通过多种途径损害肝脏的结构和功能,直接刺激胶原蛋白质的合成,从而促进肝纤维化的发生。方法： 国外已经创建成型的有Lieber-Decarli模型 Tsukamoto-French模型和Lieber-De

9、carli液体饲料加辅剂模型。模型特点： 国内学者多在喂饲料的同时进行酒精灌胃;还有在灌酒精的同时加吡唑以延缓酒精在肝脏代谢,造成与人相近的动物模型。 该方法的优点是成功率高、方便、价格低廉、模型稳定。 缺点是灌胃量难以保证完全一致,加入辅料造模与人的生理情况不符。免疫性肝纤维化模型-刀豆素蛋白A法：原理： 是引发机体免疫应答,在肝脏门脉汇管区形成免疫复合物沉积,由沉积的免疫复合物引起局部炎症反应,进一步刺激胶原的增生而造成肝组织纤维化。方法： 将小鼠经尾静脉注射12.5 mg/kg剂量的1 mol/L刀豆素蛋白A,每周1次,连续6周。模型特点： 该方法所产生肝纤维化系免疫损伤所致,有利于从免

10、疫学角度探讨发病机制及评价药物。 与其他肝纤维化动物模型相比较,Con A诱导的肝纤维化模型的方法成功率较高,动物死亡率较低,方法简便易行。 另外，免疫性肝纤维化模型的建立目前常使用的异种血清有猪血清、牛血清、人血清、血吸虫血清等。猪血清以其中的白蛋白作为异种抗原物质，通过免疫反应活化枯否细胞而诱导发生肝纤维化。形态学和免疫组化显示，免疫复合物在血管和连接组织沉积先于肝纤维化的发生，而肝细胞无显著改变。猪血清诱导的免疫性肝纤维化与人类肝纤维化的原因有一定相似之处，纤维化形成率虽不太高，但纤维化持久，停止注射3个月，对先前形成的肝组织改变无影响，在研究肝纤维化产生机制和筛选抗肝纤维化药物方面有一

11、定的优势。因此，猪血清反复腹腔注射模型一直用于研究吞噬细胞、贮脂细胞与肌纤维变性细胞在肝纤维化中的作用及肝纤维化过程中微循环的改变。其他： 病毒性肝纤维化模型：给樱桃谷鸭胫静脉注射鸭乙肝病毒(DHBV)血清,同时给予低蛋白质、低维生素、高脂饲料喂养, 85 d后出现轻度肝纤维增生。由DHBV复制的肝纤维化模型的优点是与人类肝炎病毒引起的肝纤维化接近,但与鸭种来源、DHBV接种量、接种次数、给药途径及间隔时间等因素有关。缺点是造模时间长,影响因素偏多,不易控制。 血吸虫法：用血吸虫尾蚴来制备肝纤维化模型。实验第6周可见肝脏中心静脉的变形坏死,门脉区网状蛋白聚集并伸入到肝小叶,并最终形成肝纤维化。

12、此种模型可用于血吸虫病性肝硬化的药物治疗研究,但不适宜用于其他人类肝纤维化的研究。显微镜下放大40倍的血吸虫尾蚴： 营养法(高脂饮食法)：给大鼠含有胆固醇的高脂饲料后，一定时间就可诱发体重超重、高脂血症、动脉粥样硬化和脂肪肝。 方法：以基础饲料+100g/kg猪油+ 20g/kg胆固醇喂养大鼠12wk，实验动物出现高胆固醇血症、中重度脂肪肝伴以小叶内为主的肝脏炎症坏死，从而建立了高脂饲料诱发的大鼠高脂饮食模型。特点： 此大鼠脂肪性肝炎伴随肝纤维化模型与人类的脂肪性肝炎肝纤维化在生化、病理等方面较为接近。且该造模方法简便，仅需含有一定比例的猪油和胆固醇的高脂饲料，造模过程中大鼠死亡率为零。 不足

13、之处是，这些动物模型一般无明显的脂肪性肝炎，更少出现肝纤维化，除非有内毒素等“二次打击”的作用。 复合法：由于单因素制备动物模型的周期长,成模比率低。单一因素可能在加大剂量时不但不产生肝纤维化,反而增加动物死亡率。因此部分学者采用复合因素制备模型。 人类的肝纤维化是一个复合因素作用的结果,因此在选择肝纤维化动物模型的时候,首先应选择复合因素造模方法;其次是选择成模方法简单、经济,复制性高,成模比例高,稳定的方法。复合模型的建立： （1）先用苯巴比妥诱导肝酶 （2）2周后加用CCl4建立肝纤维化模型,皮下注射四氯化碳花生油溶液、高脂饮食、酒精等。此方法造模时间短,肝纤维化形成率较高,死亡率较低。

14、 （3）联合应用血管紧张素每100g体重0.3mg,分2次腹腔注射及CCI4皮下注射每100g体重0.3ml,每3天1次,首剂加倍,结果使原先单独使用CCl4需时8周的肝纤维化在4周内完成,加速了大鼠肝纤维化进程,缩短了造模时间。 一个理想的肝纤维化动物模型应该符合以下 条件: 与人类肝纤维化疾病的基本病变特征相似; 病变有一定发展过程，即明显分期，以及病程发展存在一个可逆与不可逆的阶段性演进过程； 形成率高，死亡率低，重复性好; 造模方法简便易行和动物易获得，经济实用。中医症候动物模型： 中医学研究认为肝纤维化多是湿热、疫毒、痰瘀、饮食失节、情志失调、劳逸失当、正虚所致，对肝纤维化的主要病理

15、认识多数建立在“血瘀”基本病机之上，认为血瘀是其主要病机,治疗也以疏肝化瘀通络贯穿始终。 中医证候动物模型所揭示的是中医学的基本内涵,所以复制时应以中医病因、病机、脏象理论为依据,反映中医学的实质。在中医基础理论的指导下,从病因、病机入手,复制中医证候动物模型是切实可行的。如风、寒、湿性复制痹证动物模型,慢性疲劳复制虚证动物模型,苦寒泻下复制的脾虚证动物模型,助阳伤阴复制的阴虚证动物模型,寒盛伤阳阴复制的阳虚证动物模型,膏粱厚味伤脾加大肠杆菌感染复的温病湿热证动物模型等等基本上都是成功的范例。 在肝脏疾病中，利用不可预知的多种应激随机组合方法，建立中医肝郁证大鼠模型。 目前尚缺乏依据中医病因病

16、机理论建立的肝纤维化动物模型。由于“证候”概念寓意深刻,包含的信息量庞杂,是一个动态过程,具有复杂性、模糊性和不确定性,因此证的研究受到很大的局限,与之相关的肝纤维化的证候动物模型的研究也受到限制。 总之,理想的肝纤维化模型应具有人类肝纤维化的基本形态特征,其病理改变呈阶段性进展,模型制作具有可重复性以及低死亡率等到特点。今后应进一步加强肝纤维化动物模型研究,并结合中医理论寻找符合“证”本质的动物模型,从而促进中医药抗肝纤维化的研究。体外模型 肝脏细胞分为肝实质细胞和非实质细胞，非实质细胞又可分为肝窦内皮细胞、 枯否氏细胞、Ito细 胞和隐窝细胞。它们在整个肝脏细胞中 (除外胆管细胞和血管细胞

17、)所占的细胞百分数和体积百分比见下表。大鼠肝脏细胞的种类和比例细胞数（细胞数（）体积（体积（）肝细胞6092.2血窦内皮细胞193.3枯否细胞152.5肝星状细胞51.7隐窝细胞10.3 肝脏非实质细胞（间质细胞）在肝纤维化的发病过程中起到很重要的作用，其中以肝星状细胞的作用更为关键。建立这些细胞的体外培养，有助于研究肝纤维化的发病机制和影响因素，也可作为体外细胞模型观察药物对肝纤维化的影响。 因此，分离和培养这些细胞对于在细胞生物学和分子生物学水平上研究肝纤维化是及其重要的。下面介绍细胞分离和培养的方法。肝星状细胞肝星状细胞枯否细胞枯否细胞血窦内皮细胞血窦内皮细胞 肝星状细胞肝星状细胞( (

18、hepatic stellate cellhepatic stellate cell，HSC)HSC)的分离与培养的分离与培养（一）Nycodenz密度梯度离心分离法（文献报道较多） Sprague-Dawdey大鼠或Wistar大鼠，体重400g以上为宜。用戊巴妥钠腹腔麻醉(30mg/kg），用5 碘酒和75酒精消毒皮毛。在洁净台中剪开腹部皮肤和肌肉，行门静脉插管输入D-Hanks液，pH7.3,同时剪断下腔静脉，并将肝脏游离取下，在体外灌洗肝脏直至洗清肝脏中的血液。当肝脏中的血液洗清后，从门静脉循环灌注还酶的D-Hanks液，37，pH7.4-7.5。 灌注液中含型胶原酶0.05 （W/V

19、)、蛋白酶E0.1 （W/V）、HEPES10mmol/L/、青霉素100U/ml、链霉素100g/ml、灌流速度为20-30ml/min,共消化肝脏约20-30min。停止灌注后用镊子撕开肝包膜，轻柔地钝性粉碎肝脏后再第二次消化肝脏，消化液为：Hanks液中含型胶原酶0.05 （W/V)、蛋白酶 E 0.02， HEPES 10mmol/L，37，pH7.4，振动消化20min,其间补充少量无菌的5NaHCO3 ,以免pH过低影响消化结果。第二次消化结束后，分别用80目和120目尼龙网过滤细胞悬液。 滤液离心450g， 7min,细胞沉淀在Hanks液中悬浮，体积10ml，与20ml18 （

20、W/V）、的Nycodenz混匀。此时将30ml与Nycodenz混合的细胞悬液分置数个离心管中，上覆Hanks液，进行密度梯度离心1450g，17min.离心后取界面细胞，在DMEM培养基中悬浮，再次离心450g，7min,洗去Nycodenz。将细胞沉淀重悬于含胎牛血清20 的DMEN和IMDM的混合培养基中（V/V=1:1）。可用胎盼蓝染色判断细胞的存活率并计算产率。一般体重400g以上的大鼠肝星状细胞产率约1-10）107个细胞，存活率95%。（二）Stractan（阿拉伯半聚乳糖）密度梯度离心法 Stractan的制备：将450g粗制的Stractan粉剂溶于400ml蒸馏水。在4

21、下分别将上述溶液用各900g的Amberlite 1RA-120阳离子交换树脂和1RA-410阴离子交换树脂搅拌30min以去除离子。然后经过滤漏斗除去溶液中的离子交换树脂。 Stractan溶液与BSG缓冲液2:1混合，最终经添加固体NaCl将溶液的渗透压调至290-295mOsmol/L；pH为7.4， Stractan的贮存液在35-40 的浓度范围，于-20 保存。 具体的分离方法是用75mlL-15盐溶液原位灌洗肝脏，10ml/min，37 ，然后用100mlHanks改良的DMEM其中含0.2 蛋白酶E灌注，再循环灌注含0.015 的胶原酶的H/DMEM约25min。第二次消化肝脏

22、时省去了胶原酶，用100ml H/DMEM含0.02 蛋白酶E和10g/mlDNase 37 下振荡消化30min左右。细胞悬液用纱布过滤，离心500g，7min总共三次以洗涤细胞。洗液为无Ca2+、Mg2+的MEM-E。最终细胞悬浮在25mlMEM-E中，分别加样到Stractan梯度上。 Stractan由经超滤消毒的4个浓度梯度组成：6、8、12和20 ，每一浓度有1.5ml，密度分别为1.053、1.058、1.080和1.111。加有细胞悬液的梯度于25 离心20000r/min,30min。离心后肝星状细胞在悬液（ MEM-E）和6 Stractan之间的界面收集，在MEM-E中离

23、心500g，7min洗涤。最终悬浮于各含10 的牛与血清的M199培养基中，并用该培养基培养细胞。该法分离的肝星状细胞产率为（12.2 1.7） 106，存活率96 ，纯度99。（三）Metrizamide密度梯度离心分离法 该方法与Nycodenz密度梯度离心分离法酷似，不同之处是在密度梯度离心时，分离介质由Nycodenz换成Metrizamide（8，13和18）， Metrizamide溶于无NaCl的Geys缓冲液。离心速度为700 g，17min。肝星状细胞在最上层收集，与适量的Hanks混合，离心洗去Metrizamide。 肝星状细胞的培养一般无特殊需求：在37 含5CO2、9

24、5 空气的培养箱中培养。培养液为DMEM /IMDM（V/V=1:1）或M-199均可，pH7.2-7.4。原代培养时，血清浓度要求较高，为20 ，最好是进口胎牛血清。细胞经传代后，培养液中的血清可减至10 。肝星状细胞培养时，第一次换液为细胞接种后的48h，以后视生长情况48-72h换一次液。细胞接种密度为（1-2）105/cm2。 肝星状细胞鉴定： 形态学 在光镜下，原代肝星状细胞呈星形或多边形，有数个突起，胞浆丰富，内含脂滴。随着培养天数增加，细胞活化并增殖，胞内脂滴逐渐减少，有的细胞变为梭形，如同成纤维细胞。透射镜下，原代早期的肝星状细胞胞浆内含大量脂滴，传代后胞浆中脂滴明显减少，有较

25、多的微丝出现，粗面内质网发达。 VitA自发荧光 用荧光显微镜，在328nm的紫外光激发下，新分离或早期原代培养的HSC能发出蓝绿色的自发荧光，并在数秒内减退。 胞浆中desmin(结蛋白）染色阳性 在培养皿中放入洗净消毒的小玻片，将HSC接种到平皿内。待细胞贴附后，取出玻片，用PBS冲洗，干燥后用丙酮/氯仿（V/V=1:1）固定20min,再干燥。与湿润的环境和室温下，与desmin抗体或抗血清培育30min。用PBS洗涤三次，每次5min。玻片再与荧光标记的第二抗体培育30min。最后用PBS洗3次，用50%甘油的PBS封片，在荧光显微镜下观察。阴性对照用与抗体稀释度一致的正常大鼠血清或兔

26、血清代替抗desmin抗体或抗血清。此法是鉴定肝星状细胞最可靠的重要方法。A AB BC CD DHSCsHSCs的培养与鉴定的培养与鉴定 A A 光镜下新鲜分离的光镜下新鲜分离的HSCsHSCs ( (100) B 100) B 光镜下培养光镜下培养7d7d的的HSCsHSCs （100100） C C VitAVitA自发荧光自发荧光 D D 光镜下光镜下DesminDesmin染色阳性染色阳性 枯否细胞（枯否细胞（kupfferkupffer cells) cells)的分离及培养的分离及培养 （一）Stractan（阿拉伯半聚乳糖）密度梯度离心法 kupffer细胞的分离方法与HSC相

27、似，主要是用密度梯度离心分离，胶原酶消化肝脏。前文以 Stractan为介质分离HSC，当经密度梯度离心20000r/min,30min后，在8%-12% Stractan的界面收集kupffer细胞，用MEM-E洗涤细胞，离心500g，7min。最后细胞悬浮于Medium199中，其中含20%血清。 将细胞接种于60mm未经包被的塑料培养皿中，37 下20min后吸去未吸附贴壁得细胞，并用L-15盐溶液轻柔漂洗一下已贴壁的细胞，随后平皿中加入新的含20%血清的M-199培养基。24h后，用0.5%胰蛋白酶加0.02%EDTA于37 消化细胞3min，轻轻吸去已消化下来的细胞，其余贴壁细胞即k

28、upffer细胞重新用M-199含20%血清培养，没24h换液。此法得到的细胞产率为（7.2-2.2） 106，纯度为95.4 % 2.7%，存活率96.9 % 5.4 %。（二）Percoll密度梯度离心法 大鼠经麻醉后，门静脉灌注D-Hanks液4min，流速40ml/min。随后用含0.05%的型胶原酶的L-15培养基灌注肝脏8min，流速25ml/min。将肝脏剪开并用镊子将肝脏的细胞分离。细胞悬液离心40g，3min，将上清液收集以密度梯度离心。将细胞悬液与Percoll混合，离心2800g，5min。在密度为1.06的层中收集细胞。细胞接种于培养皿中，密度为2 106/平皿。培养基

29、为L-15medium，含10%胎牛血清。该法分离得到的大鼠kupffer细胞纯度95%，存活率95%。 Kupffer细胞的相差显微镜形态学观察：细胞呈多角形，大小约10-15 m，细胞核呈特有的肾形。 （1）观察Kupffer细胞的吞噬功能 培养的Kupffer细胞在L-15培养基中培养，其中含10%胎牛血清和0.0042%聚苯乙烯微珠，该珠直径为1m。培育60min，37 。用上述培养基洗涤三次，然后再倒置显微镜下计数并观察细胞内吞噬的塑料珠球。 （2）细胞的过氧化物酶染色 将细胞在含二氨基联苯胺和H2O2的培养基中培育，细胞中的过氧化物酶能分解双氧水产生氧，与二氨基联苯胺反应显色。 K

30、CsKCs细胞培养与鉴定细胞培养与鉴定. A: . A: 新分离的新分离的KCsKCs细胞细胞, , 呈圆形呈圆形, , 大小基本一致大小基本一致( (200); B: 200); B: 培养培养72 h72 h后后, , 细胞体积增大细胞体积增大, , 延伸成不规则形延伸成不规则形, , 伸出伪足伸出伪足( (200); C: 200); C: KCsKCs吞噬碳素颗粒吞噬碳素颗粒( (200); D: 200); D: 肝非实质细胞离心前肝非实质细胞离心前ED2ED2染色染色( (400); E: 30% 400); E: 30% PercollPercoll层细胞层细胞ED2ED2染色染

31、色( (400); F: 30% 400); F: 30% PercollPercoll层与层与60% 60% PercollPercoll层之间的细胞层之间的细胞ED2ED2染色染色( (400).400).（曾曾 仲仲, , 黄汉飞黄汉飞, , 宋宋 飞等飞等. .体外灌注体外灌注法分离大鼠肝脏法分离大鼠肝脏KupfferKupffer细胞及原代培养细胞及原代培养J J. .世界华人消化杂志世界华人消化杂志, 2009, 17(25): 2550-, 2009, 17(25): 2550-2554.2554.） 血窦内皮细胞（血窦内皮细胞（sinusoidal sinusoidal end

32、othelial cells)endothelial cells)的分离及培养的分离及培养 血窦内皮细胞可在用Stractan为介质密度梯度分离大鼠Kupffer细胞的同时，在12%-20%Stractan的界面处得到血窦内皮细胞。此时获得的细胞虽大部分为内皮细胞，还有少量Kupffer细胞和红细胞及白细胞。去除这些细胞的方法：细胞在含血清的MEM-E培养基中接种培养，经24h后换液，即可除去不贴壁的红细胞和白细胞，再过24h后，贴壁的细胞用L-15溶液或PBS洗涤两次，用0.125%胰酶和 0.005%EDTA消化3min。消化下来的即为血窦内皮细胞，重新再20%血清的培养基中悬浮，接种到新

33、的培养瓶培养。未被胰酶消化的细胞为Kupffer细胞。 血窦内皮细胞的鉴定： 因子免疫荧光染色 方法与desmin免疫荧光染色鉴定HSC极为相似，仅一抗由抗desmin抗血清改为兔抗人第因子多克隆抗体。 因子染色为阳性者为内皮细胞。 倒置相差显微镜下培养不同时间的倒置相差显微镜下培养不同时间的 SEC( SEC( 200)200)A. A. 培养培养2h2h的的SEC SEC 呈小圆形呈小圆形, ,大小均匀大小均匀( (200) 200) B.B.培养培养6h6h的的SECSEC出现典型形态出现典型形态( ( 200)200)C. C. 培养培养12h12h的的SECSEC呈网状排列呈网状排列( (200) D.200) D.培养培养80h80h的的SECSEC成团排列成团排列 , ,完全伸展完全伸展( ( 200)200)肝星状细胞与其他肝脏细胞的联合培养肝星状细胞与其他肝脏细胞的联合培养 将HSCs与其他肝脏细胞联合培养的目的是为了观察研究细胞间的相互作用和影响。从狭义上讲联合培养仅是指两种细胞在同一培养容器中培养，它们之间是相通的，从广义上讲两种细胞虽在独自的培养容器中单独培养，但将其中