第2单元免疫沉淀类实验

1、第二单元免疫沉淀实验免疫沉淀实验实验一实验一 双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验 在琼脂凝胶中，待检人血清在琼脂凝胶中，待检人血清IgG和羊抗人和羊抗人IgG抗血清在不同孔内各自向四周扩散，在比抗血清在不同孔内各自向四周扩散，在比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀线，证明两例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀线，证明两者发生特异性结合反应。者发生特异性结合反应。实验原理实验原理v试剂试剂 健康人血清，用生理盐水做健康人血清，用生理盐水做1:51:40系列倍比稀释系列倍比稀释 、羊抗、羊抗 人人IgG抗血清、抗血清、1015g/L琼脂糖或琼脂粉琼脂糖或琼脂粉 。 v仪器仪器 水浴箱、温箱水浴箱、温箱 。v材

2、料材料 载玻片、微量加样器、打孔器、载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、湿盒等吸管、吸球、湿盒等 。实验器材和材料实验器材和材料v 制备琼脂凝胶：用生理盐水配置制备琼脂凝胶：用生理盐水配置1015g/L琼脂，隔水加热煮沸备用。琼脂，隔水加热煮沸备用。v 浇板：将载玻片置于水平台上，用吸管吸取浇板：将载玻片置于水平台上，用吸管吸取44.5ml融化的琼脂倾注于融化的琼脂倾注于玻片上，滴加时注意速度不要过快，要使琼脂盖满整张玻片，使其均匀、玻片上，滴加时注意速度不要过快，要使琼脂盖满整张玻片，使其均匀、饱满，勿溢出并避免产生气泡。饱满，勿溢出并避免产生气泡。v 打孔打孔 ：待琼脂凝固后，将

3、梅花形打孔模板待琼脂凝固后，将梅花形打孔模板置置于琼脂板下，用直径于琼脂板下，用直径3mm的打孔器打孔，使其孔径为的打孔器打孔，使其孔径为3mm，孔距为，孔距为4mm，孔要求圆整光滑，孔，孔要求圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿与载玻片脱离。缘不能破裂，底部勿与载玻片脱离。v 加样：用加样：用10l微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体，微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体，周围孔分别加入不同稀释度的抗原。周围孔分别加入不同稀释度的抗原。v 温育：将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，温育：将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37温箱温育温箱温育24h，观察，观察沉淀线。沉淀线

4、。实验方法实验方法v操作示意图操作示意图浇板浇板温育温育打孔打孔加样加样结果判断结果判断中央孔中央孔抗体成分抗体成分周围孔周围孔不同稀释度的抗原不同稀释度的抗原成分（第成分（第1 15 5孔）孔）第第6 6孔孔阴性对照阴性对照123456 以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为人血清人血清IgG的扩散效价。的扩散效价。结果判断结果判断北华大学北华大学 王雪松王雪松 该方法简便易行，结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇该方法简便易行，结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇后所出现沉淀线的特征，对其进行定性分析。若相邻两孔后所出现沉淀线的特征，对其进行定性分析。若相邻两孔内抗原

5、成分完全相同，则形成完全相连的两条沉淀线；若内抗原成分完全相同，则形成完全相连的两条沉淀线；若抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；若抗原部分相抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；若抗原部分相同，则形成部分相连的两条沉淀线；当抗原存在多种成分同，则形成部分相连的两条沉淀线；当抗原存在多种成分时，则呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可根据沉淀时，则呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可根据沉淀线的位置、形状、数目等，初步分析抗原和抗体的纯度、线的位置、形状、数目等，初步分析抗原和抗体的纯度、浓度、扩散速度等理化性状。该方法除用于血清浓度、扩散速度等理化性状。该方法除用于血清IgG的检的检测以外，

6、还曾用于诊断和分析某些疾病，如检测测以外，还曾用于诊断和分析某些疾病，如检测AFP、HBsAg等，但敏感度低所需时间长。等，但敏感度低所需时间长。 实验讨论实验讨论实验二实验二 单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验 将一定量的羊抗人将一定量的羊抗人IgG抗血清成分混合于琼脂凝胶抗血清成分混合于琼脂凝胶中，制成含有特异性羊抗人中，制成含有特异性羊抗人IgG抗血清的琼脂板，待凝抗血清的琼脂板，待凝固后打孔，并在相应孔中加入待检人血清固后打孔，并在相应孔中加入待检人血清IgG。使待检。使待检血清在琼脂板中向四周呈环状扩散，在两者浓度比例恰血清在琼脂板中向四周呈环状扩散，在两者浓度比例恰当处形成肉眼可见的

7、白色沉淀环，沉淀环的直径或面积当处形成肉眼可见的白色沉淀环，沉淀环的直径或面积与待检人血清浓度呈正相关。同时用标准免疫球蛋白或与待检人血清浓度呈正相关。同时用标准免疫球蛋白或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测人血清国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测人血清IgG浓度。浓度。实验原理实验原理实验器材和材料实验器材和材料v 试剂：试剂： 待检人血清、免疫球蛋白工作标准（待检人血清、免疫球蛋白工作标准（IgG含量为含量为10.10mg/ml）、羊抗人）、羊抗人IgG抗血清（单扩效价抗血清（单扩效价1:100）、琼）、琼脂糖或琼脂粉、生理盐水、脂糖或琼脂粉、生理盐水、NaN3 。 v 仪

8、器：仪器： 水浴箱、温箱水浴箱、温箱 。v 材料：材料： 载玻片、微量加样器、打孔器、载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、三角烧吸管、吸球、三角烧瓶、湿盒半对数坐标纸等瓶、湿盒半对数坐标纸等 。实验方法实验方法v 制备抗体琼脂凝胶制备抗体琼脂凝胶:用生理盐水配置用生理盐水配置1015g/L琼脂，加琼脂，加0.01%（0.1g/L）NaN3，隔水加热煮沸琼脂，置，隔水加热煮沸琼脂，置56水浴水浴中备用。吸取中备用。吸取99ml已融化的琼脂于三角烧瓶中，置已融化的琼脂于三角烧瓶中，置56水水浴中保温，将预温的羊抗人浴中保温，将预温的羊抗人IgG抗血清抗血清1ml与琼脂充分混合，与琼脂充分

9、混合，继续保温于继续保温于56水浴中备用。水浴中备用。v 浇板浇板:将清洁干燥的载玻片置于水平台上，用吸管吸取充分将清洁干燥的载玻片置于水平台上，用吸管吸取充分混匀的抗体琼脂混匀的抗体琼脂44.5ml倾注于玻片上，置室温冷却凝固。倾注于玻片上，置室温冷却凝固。要求浇板时要均匀、平整、无气泡、薄厚均匀。要求浇板时要均匀、平整、无气泡、薄厚均匀。v 打孔打孔:待琼脂凝固后，用打孔器打孔，孔径待琼脂凝固后，用打孔器打孔，孔径3mm，孔距，孔距1012mm。要求孔打得圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿。要求孔打得圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿与玻片分离。与玻片分离。v 加样加样:稀释人免疫球蛋白工作标准品

10、：取冻干人免疫球蛋白稀释人免疫球蛋白工作标准品：取冻干人免疫球蛋白工作标准品工作标准品1支加蒸馏水支加蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐，待完全溶解后，用生理盐水稀释成不同的稀释度。其稀释范围为水稀释成不同的稀释度。其稀释范围为1:5、1:10、1:20、1:40，IgG相应含量为相应含量为2020、1010、505、252mg/L。稀释。稀释待检血清：将待检血清用生理盐水做待检血清：将待检血清用生理盐水做1:40稀释。用微量加稀释。用微量加样器分别吸取各稀释度的人免疫球蛋白工作标准品样器分别吸取各稀释度的人免疫球蛋白工作标准品10l加加入到标准抗原孔，制备标准曲线。再用同样的方法吸取已

11、入到标准抗原孔，制备标准曲线。再用同样的方法吸取已稀释好的待检血清稀释好的待检血清10l加入到待检血清孔。加入到待检血清孔。 v 扩散扩散:将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37温箱温育温箱温育24h，观察结果。如果沉淀环不清晰，可用生理盐水浸泡，观察结果。如果沉淀环不清晰，可用生理盐水浸泡23h。v操作示意图操作示意图浇板浇板扩散扩散打孔打孔加样加样1 2 3 45 6 7 8结果判断结果判断第第1、2、3、4、5孔孔标准蛋白标准蛋白第第6、7孔孔待检抗原待检抗原第第8孔孔阴性对照阴性对照结果判断结果判断绘制标准曲线：绘制标准曲线： 以各稀释度工作标准的沉淀

12、环直径为横坐标，相应以各稀释度工作标准的沉淀环直径为横坐标，相应孔中的孔中的IgG含量为纵坐标，在半对数纸上按含量为纵坐标，在半对数纸上按Fahey法绘法绘制出标准曲线。制出标准曲线。结果判定：结果判定： 待测标本中所含抗原量根据标本孔的沉淀环直径查待测标本中所含抗原量根据标本孔的沉淀环直径查标准曲线，将查得的标准曲线，将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍数，即待含量乘以标本的稀释倍数，即待检标本血清中检标本血清中Ig的实际含量。的实际含量。实验讨论实验讨论 单向免疫扩散试验方法简便、易于操作，且重复性和单向免疫扩散试验方法简便、易于操作，且重复性和线性均可信赖。但敏感度稍差，观察结果所需时间较长

13、，线性均可信赖。但敏感度稍差，观察结果所需时间较长，每次需做参考血清对照，不可一次做成，长期使用。应用每次需做参考血清对照，不可一次做成，长期使用。应用此方法除检测人血清此方法除检测人血清IgG含量外，还可用于健康人群或患含量外，还可用于健康人群或患者血清中者血清中IgA、IgM、补体、白蛋白、蛋白酶等蛋白质含、补体、白蛋白、蛋白酶等蛋白质含量的定量测定。量的定量测定。北华大学北华大学 王雪松王雪松实验三实验三 对流免疫电泳对流免疫电泳 在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗体的扩散具有一定的特点。在体的扩散具有一定的特点。在pH8.6以上的缓

14、冲液中，大以上的缓冲液中，大部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动；部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动；而大部分抗体属于而大部分抗体属于IgG，在此种，在此种pH条件下只带微弱的负条件下只带微弱的负电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色

15、沉淀线。淀线。实验原理实验原理实验器材和材料实验器材和材料v 试剂：试剂： 人血清、抗人血清、人血清、抗人血清、 pH8.6 0.05mol/L巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液 、用、用巴比妥缓冲液配置巴比妥缓冲液配置1%琼脂琼脂 。 v 仪器：仪器： 电泳槽、电泳仪、水浴箱电泳槽、电泳仪、水浴箱 。v 材料：材料： 孔型模板、打孔器、滤纸、纱布条、微量加样器、载玻片、孔型模板、打孔器、滤纸、纱布条、微量加样器、载玻片、吸管、吸球等吸管、吸球等 。v 制备巴比妥琼脂凝胶：取出一清洁载玻片，用制备巴比妥琼脂凝胶：取出一清洁载玻片，用75%乙醇冲乙醇冲洗干净，晾干备用。将洗干净，晾干备用。将1%巴比妥琼脂

16、融化后，置巴比妥琼脂融化后，置56水水浴中备用。用吸管吸取浴中备用。用吸管吸取44.5ml琼脂溶液滴加于玻片上，琼脂溶液滴加于玻片上，室温放置，待凝固后打孔，孔径室温放置，待凝固后打孔，孔径3mm，孔距，孔距10mm。v 加样：用微量加样器分别吸取抗原加样：用微量加样器分别吸取抗原10l加入阴极侧孔内，加入阴极侧孔内，抗体抗体10l加入阳极侧孔内，所加样品切勿外溢。加入阳极侧孔内，所加样品切勿外溢。v 电泳：将加样完毕的琼脂板置电泳槽的支架上，抗原孔置电泳：将加样完毕的琼脂板置电泳槽的支架上，抗原孔置阴极端，抗体孔置阳极端，电泳槽内加阴极端，抗体孔置阳极端，电泳槽内加pH8.6的的0.05mo

17、l/L巴比妥缓冲液至电泳槽的三分之二处，琼脂板两端分别用巴比妥缓冲液至电泳槽的三分之二处，琼脂板两端分别用盐桥与缓冲液相连。控制端电压为盐桥与缓冲液相连。控制端电压为56V/cm板长，电泳板长，电泳3060min。电泳完毕后，切断电源。电泳完毕后，切断电源。实验方法实验方法v操作示意图操作示意图浇板浇板电泳电泳打孔打孔加样加样两孔之间形成的白色沉淀两孔之间形成的白色沉淀线即为抗原抗体复合物线即为抗原抗体复合物 。AgAbAg Ab 在抗原和抗体两孔之间形成的白色沉淀线即为在抗原和抗体两孔之间形成的白色沉淀线即为抗原抗体复合物。如果沉淀线不够清晰，于湿盒中抗原抗体复合物。如果沉淀线不够清晰，于湿

18、盒中37保温数小时，可增强沉淀线的清晰度。保温数小时，可增强沉淀线的清晰度。结果判断结果判断 北华大学北华大学 王雪松王雪松 此方法简便、快捷。敏感性比双向免疫扩散法高此方法简便、快捷。敏感性比双向免疫扩散法高816倍。需要选择高特异性、高亲和力的抗体，否则结倍。需要选择高特异性、高亲和力的抗体，否则结果难以判断。对流免疫电泳在临床常用于某些抗原的定果难以判断。对流免疫电泳在临床常用于某些抗原的定性检测（如性检测（如AFP、HBsAg等），同时也可用于抗原的半等），同时也可用于抗原的半定量测定，或根据沉淀线的位置、形状对抗原和抗体进定量测定，或根据沉淀线的位置、形状对抗原和抗体进行相对浓度的分

19、析。由于该方法分辨率差，当多种抗原行相对浓度的分析。由于该方法分辨率差，当多种抗原抗体系统同时存在时，形成的沉淀线常重叠，难以分辨。抗体系统同时存在时，形成的沉淀线常重叠，难以分辨。实验讨论实验讨论实验四实验四 抗原物质的变化及性质分析抗原物质的变化及性质分析（设计性实验）（设计性实验） 是指能够刺激机体免疫系统诱导免疫应答，是指能够刺激机体免疫系统诱导免疫应答，并能与相应免疫应答的产物在体内或体外发生特并能与相应免疫应答的产物在体内或体外发生特异性结合反应的物质。异性结合反应的物质。抗原概念抗原概念实验原理实验原理 大分子的抗原物质在细胞和生物体的生命活动过程中，大分子的抗原物质在细胞和生物

20、体的生命活动过程中，起着十分重要的作用，生物的某些结构和性状都与这些物质起着十分重要的作用，生物的某些结构和性状都与这些物质有关。现代分子生物学经常采用一些方法对大分子物质进行有关。现代分子生物学经常采用一些方法对大分子物质进行有目的的改造，如盐析、甲醛处理、加热、紫外线照射、超有目的的改造，如盐析、甲醛处理、加热、紫外线照射、超声波等，如处理不当这些物质会发生性质上的改变而凝结起声波等，如处理不当这些物质会发生性质上的改变而凝结起来，这种凝结是不可逆的，而且会影响蛋白的性质。我们的来，这种凝结是不可逆的，而且会影响蛋白的性质。我们的目的为寻求是否有简单的方法对处理过程中蛋白的性质进行目的为寻

21、求是否有简单的方法对处理过程中蛋白的性质进行监控，以观察处理前后抗原物质的性质变化。监控，以观察处理前后抗原物质的性质变化。v 首先制备出未处理抗原物质的抗体，用该抗体与处理首先制备出未处理抗原物质的抗体，用该抗体与处理前和处理后的物质分别进行免疫反应，观察处理前后前和处理后的物质分别进行免疫反应，观察处理前后抗原性是否发生变化。抗原性是否发生变化。v 然后制备出处理后抗原物质的另一抗体，用该抗体与然后制备出处理后抗原物质的另一抗体，用该抗体与处理前和处理后的抗原物质分别进行免疫反应，观察处理前和处理后的抗原物质分别进行免疫反应，观察抗原性是否有变化。抗原性是否有变化。 实验设计提示实验设计提

22、示实验设计提示实验设计提示v 通过了解抗原性的变化进一步推断大分子抗原物质的结通过了解抗原性的变化进一步推断大分子抗原物质的结构和功能是否有新的改变。构和功能是否有新的改变。 v 在试验过程中，通过类似双扩的方法，观察各种抗原和在试验过程中，通过类似双扩的方法，观察各种抗原和抗体之间的反应及变化。抗体之间的反应及变化。 1 2 3 4玻片上方两孔分别为未处理抗原（玻片上方两孔分别为未处理抗原（1）和未处理抗原制备的抗体（）和未处理抗原制备的抗体（2）；）； 玻片下方两孔分别为处理后抗原制备的抗体（玻片下方两孔分别为处理后抗原制备的抗体（3）和处理后抗原（）和处理后抗原（4）。）。 v 有哪些理

23、化因素能够导致抗原性发生变化，变化的特点和有哪些理化因素能够导致抗原性发生变化，变化的特点和意义是什么？意义是什么？ v 免疫电泳的方法是否可以用于观察抗原物质性质的变化？免疫电泳的方法是否可以用于观察抗原物质性质的变化？ v 是否能设计定量观察大分子抗原物质抗原性变化的实验？是否能设计定量观察大分子抗原物质抗原性变化的实验？ 结果讨论提纲结果讨论提纲北华大学北华大学 王雪松王雪松临床见习临床见习 免疫比浊分析系统免疫比浊分析系统见习要点见习要点v 掌握该系统的技术流程及其质量控制；掌握该系统的技术流程及其质量控制；v 熟悉速率散射比浊分析系统的基本原理；熟悉速率散射比浊分析系统的基本原理；v

24、 了解免疫比浊分析系统的种类和原理。了解免疫比浊分析系统的种类和原理。基本原理基本原理v 散射比浊法是指沿水平轴向反应液照射一定波长的光，当散射比浊法是指沿水平轴向反应液照射一定波长的光，当光线通过反应体系时，由于抗原抗体反应形成的免疫复合光线通过反应体系时，由于抗原抗体反应形成的免疫复合物微粒子对光发生折射、反射及透射，使水平方向的光发物微粒子对光发生折射、反射及透射，使水平方向的光发生偏转，产生散射光。光线偏转的角度与发射光的波长和生偏转，产生散射光。光线偏转的角度与发射光的波长和反应液中抗原抗体复合物颗粒的大小及多少密切相关。一反应液中抗原抗体复合物颗粒的大小及多少密切相关。一般仪器采用

25、不同波长的光源两套光路，分别在般仪器采用不同波长的光源两套光路，分别在90和和180散射角检测小、中和大分子物质。散射角检测小、中和大分子物质。v 所谓速率是指在单位时间内，抗原抗体反应形成复合物的所谓速率是指在单位时间内，抗原抗体反应形成复合物的速度。速率散射比浊法是测定单位时间内免疫复合物形成速度。速率散射比浊法是测定单位时间内免疫复合物形成的最快时间段的散射信号值，当抗体量大于抗原量时，形的最快时间段的散射信号值，当抗体量大于抗原量时，形成的免疫复合物为小分子不溶性颗粒，产生的散射信号最成的免疫复合物为小分子不溶性颗粒，产生的散射信号最强，形成的速率散射信号值也最大。强，形成的速率散射信

26、号值也最大。免疫浊度分析系统基本技术流程图免疫浊度分析系统基本技术流程图 开机开机依次打开主机电源、电脑及打印机开关，仪器自行启动，依次打开主机电源、电脑及打印机开关，仪器自行启动，完成初始化和自检，即可开始工作完成初始化和自检，即可开始工作参数设置参数设置试剂装载试剂装载校准校准标本装载标本装载标本测定标本测定结果查询与传送结果查询与传送结果报告结果报告设置仪器项目和单位等相关参数设置仪器项目和单位等相关参数将试剂盒放入试剂舱内，根据已定程序扫描相关信息将试剂盒放入试剂舱内，根据已定程序扫描相关信息按已设定的参数和程序进行校准按已设定的参数和程序进行校准将标本放入标本架，根据已定程序输入工作

27、单将标本放入标本架，根据已定程序输入工作单按已设定的参数和程序进行测定按已设定的参数和程序进行测定按已设定的参数和程序查看并传送结果按已设定的参数和程序查看并传送结果以标准模式报告结果并给予解读和对临床提供建议以标准模式报告结果并给予解读和对临床提供建议仪器示意图仪器示意图 试剂区试剂区 试剂针试剂针 样本区和稀释液样本区和稀释液 加样针加样针 反应区反应区 清洗工作站清洗工作站124365124365检测菜单检测菜单（举例介绍，并不包含全部）（举例介绍，并不包含全部）自身免疫性疾病自身免疫性疾病v 免疫球蛋白A (IGA) v 免疫球蛋白G (IGG) v 免疫球蛋白M (IGM) v 补体

28、C3 (C3) v 补体C4 (C4) v 轻链(KAP) v 轻链(LAM) v Free 轻链* v Free 轻链*v C-反应蛋白(CRP) v 触珠蛋白(HPT) v 备解素B因子(PFB)v 类风湿因子(RF)炎症状态监测炎症状态监测v 白蛋白(ALB)v -酸性糖蛋白(AAG)v 抗胰蛋白酶(AAT)v 铜蓝蛋白(CER) v C-反应蛋白(CRP) v 触珠蛋白(HPT) 类风湿性关节炎类风湿性关节炎v 类风湿因子(RF)v C-反应蛋白(CRP)v 抗链球菌溶血素O(ASO) v ADNase-B肾功能监测肾功能监测v 尿微白蛋白(MA)v 尿免疫球蛋白(IGU)v 尿转铁蛋白(TRU)v