分子生物学基因重组和基因工程

1、目录目录基因重组与基因工程基因重组与基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering第十四章第十四章The biochemistry and molecular biology department of BMUKong lijun QQ359452074目录目录DNA克隆、测序与重组技术的历史克隆、测序与重组技术的历史 1973年，年，Stanley Cohen等人首次获得体外等人首次获得体外重组重组DNA的分子克隆的分子克隆 1977年，年，Allan Maxam和和Walter Gilbert的的化学裂解化学裂解DNA测序问世测序问世 不

2、久，不久，Sanger 等的双脱氧测序法等的双脱氧测序法 20世纪世纪90年代启动人类基因组计划年代启动人类基因组计划(human genome project，HGP) 重组重组DNA技术学技术学(Recombinant DNA Technology)目录目录第一节第一节自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移是经常发生的是经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目录目录n自然界不同物种或个体之间的基因重组和基因自然界不同物种或个体之间的基因重组和基因转移是经常发生的，它是基因变异和物种演变

3、、转移是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。进化的基础。n基因转移和重组也在繁殖、病毒感染、基因表基因转移和重组也在繁殖、病毒感染、基因表达及癌基因激活等过程中起重要作用达及癌基因激活等过程中起重要作用n人类进行基因克隆、动物克隆以及基因治疗等人类进行基因克隆、动物克隆以及基因治疗等科学实验和实践中所进行的基因操作也离不开科学实验和实践中所进行的基因操作也离不开基因转移和重组。基因转移和重组。n重组重组DNA技术就是基于人们对自然界的基因转技术就是基于人们对自然界的基因转移和重组的认识发展起来的。移和重组的认识发展起来的。目录目录n基因重组基因重组（Gene re-arrangem

4、ent，recombination）n是指整段是指整段DNA在细胞内或细胞间、甚至在在细胞内或细胞间、甚至在不同物种之间进行交换，井能在新的位置上不同物种之间进行交换，井能在新的位置上复制、转录和翻译。复制、转录和翻译。n是自然界常见的现象，基因重组有病毒介导是自然界常见的现象，基因重组有病毒介导的基因转移，细胞在增殖、分裂、分化过程的基因转移，细胞在增殖、分裂、分化过程也发生基因重组或重排（也发生基因重组或重排（rearrangement）n基因重组有多种方式。基因重组有多种方式。目录目录DNA重组重组接合作用接合作用 (conjugation)转化作用转化作用 (transformatio

5、n)转导作用转导作用 (transduction)转转 座座 (transposition)同源重组同源重组 (homologous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)目录目录 发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重组同源重组(homologous recombination)，又称又称基本重基本重组（组（general recombination）。 是最基本的是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个和再连接，在两个DNA分子同源序列间进分子同源序列间进行单

6、链或双链片段的交换。行单链或双链片段的交换。一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式目录目录 同源重组需要一些重组蛋白和酶。如同源重组需要一些重组蛋白和酶。如RecA、B、C、D及及DNA连接酶等。连接酶等。 同源重组不依赖特异同源重组不依赖特异DNA序列，而依赖两序列，而依赖两分子之间的相同或相似性。若转化或转导分子之间的相同或相似性。若转化或转导获得的外源获得的外源DNA与宿主与宿主DNA同源同源,那么外源那么外源DNA就可以整合进宿主的染色体。就可以整合进宿主的染色体。目录目录nHolliday模型的模型的4个关键步骤：个关键步骤： 两个同源染色体两个同源染色体

7、DNA排列整齐；排列整齐；片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) 一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体；中间体； 通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA； Holliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNA，分别为：，分别为：目录目录 片段重组体片段重组体 （见模型图左边产物）：（见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链

8、，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本本DNA。 拼接重组体拼接重组体（见模型图右边产物）：（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本链区的两侧来自不同亲本DNA。 目录目录Holliday模型中，同源重组主要模型中，同源重组主要4个关键步骤个关键步骤 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐排列整齐一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体中间体通过分支移动产生异源双链通过分支移动

9、产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNA，分别为：，分别为：片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) 目录目录5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3

10、 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体5 3 5 5 5 3 3 3 目录目录二、接合作用（二、接合作用（conjugation）当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相当细胞与细胞、或

11、细菌通过菌毛相互接触时，质粒互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称转移称为接合作用。为接合作用。细菌的基因转移与重组方式细菌的基因转移与重组方式目录目录 可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor) 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。分子。 质粒质粒目录目录 有的细菌染色体外有一比较大的质粒有的细菌染色体外有一比较大的质粒 - F 因因子子(F factor) ，是一个小型环状双链，是一个小型环状双链DNA。F因因子中含有性鞭毛蛋白编码基因，这决定性鞭毛子中含有性鞭毛蛋白编

12、码基因，这决定性鞭毛的形成。有的形成。有F因子的细菌有性鞭毛。当因子的细菌有性鞭毛。当F+和和F-的细菌相互接触的时候，它们之间通过鞭毛的的细菌相互接触的时候，它们之间通过鞭毛的连接构成通道，连接构成通道， F+细菌中双连细菌中双连DNA的一条链打的一条链打开一个缺口，进入另一个细菌，开一个缺口，进入另一个细菌， F+细菌按滚环细菌按滚环复制另一条链；进入复制另一条链；进入F-细菌的那条连做模板，细菌的那条连做模板，复制成两条链，这样两个细菌都成为复制成两条链，这样两个细菌都成为F+细菌。细菌。质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子分子目录目录三、转化作用三、

13、转化作用(transformation)定义：通过自动获取或人为地供给外定义：通过自动获取或人为地供给外源源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化。的遗传表型，称为转化。目录目录 肺炎双球菌存在无夹膜不致病的无毒型肺炎双球菌存在无夹膜不致病的无毒型（RH型）和有夹膜的致病型的肺炎双球菌型）和有夹膜的致病型的肺炎双球菌（ SH型）。提取致病型肺炎双球菌的型）。提取致病型肺炎双球菌的DNA，加入到加入到RH型菌里培养，型菌里培养，RH型就会转化成致病型就会转化成致病的的SH型型肺炎双球菌转化实验：肺炎双球菌转化实验：目录目录四、转导作用四、转导作用(

14、transduction)当病毒从被感染的（供体）细胞释放当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一细胞出来、再次感染另一细胞（受体）（受体）时，发时，发生在供体细胞与受体细胞之间的生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移转移及基因重组即为及基因重组即为转导作用转导作用。目录目录噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径 (lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径 (lysogenic pathway) 噬菌体感染细菌时，其外壳留在细菌噬菌体感染细菌时，其外壳留在细菌的表面，噬菌体的表面，噬菌体DNA进入大肠杆菌细胞进入大肠杆菌细胞内，在细菌细胞内其生活途径有两

15、种：内，在细菌细胞内其生活途径有两种：目录目录噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径 (lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)目录目录1、溶菌生长途径、溶菌生长途径 (lysis pathway) DNA在细菌内复制，也可以表达产生噬在细菌内复制，也可以表达产生噬菌体的外壳蛋白，然后包装成新的菌体的外壳蛋白，然后包装成新的噬菌体，噬菌体，当生成大量的当生成大量的噬菌体后，细胞溶解，噬菌体后，细胞溶解， 噬菌噬菌体就释放出来了。体就释放出来了。目录目录例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细

16、菌摄取。目录目录 2、溶源菌生长途径、溶源菌生长途径 (lysogenic pathway) DNA进入细菌后，可以通过基因重组整合到进入细菌后，可以通过基因重组整合到细菌染色体细菌染色体DNA中，维持下去，随着细菌的分裂中，维持下去，随着细菌的分裂繁殖，繁殖， DNA被扩增，当在一定条件下，这一段被扩增，当在一定条件下，这一段 DNA可以被切下来扩增、复制，进入溶菌途径。可以被切下来扩增、复制，进入溶菌途径。如果如果 DNA 切下时带有了细菌的切下时带有了细菌的DNA,包装成噬菌包装成噬菌体后，新的噬菌体体后，新的噬菌体DNA就带有细菌就带有细菌DNA, 当其再当其再感染另外的一个细菌时，通

17、过溶源途径，就将原感染另外的一个细菌时，通过溶源途径，就将原细菌的细菌的DNA，带给了新的细菌，这就是转导作用。，带给了新的细菌，这就是转导作用。目录目录目目 录录目录目录五、位点特异重组，即特异位点间五、位点特异重组，即特异位点间发生的整合发生的整合 位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由是由整合酶整合酶催化，在两个催化，在两个DNA序列的特异序列的特异位点间发生的整合。位点间发生的整合。目录目录噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶

18、可特异地识别、整合反转录录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒病毒cDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合目录目录（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组沙门菌沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。片段倒位决定鞭毛相转变。目录目录 hix为反向重复序列，它们之间的为反向重复序列，它们之间的H片段片段可在可在Hin控制下进行特异位点重组控制下进行特异位点重组(倒位倒位)。H片段上有两个启动子片段上有两个启动子P，其一驱动，其一驱动hin基基因表达，另一正向时驱动因表达，另一正向时驱动H2和和r

19、H1基因基因表达，反向表达，反向(倒位倒位)时时H2和和rH1不表达。不表达。rH1为为H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。目录目录 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶转位片段转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列沙门菌沙门菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变目录目录（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链，由两条轻链(L链链)和两条重和两条重链链(H链链)组成，分别由三个独立的基因族编码，组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链其中两个编

20、码轻链( 和和 )，一个编码重链。，一个编码重链。 轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基基因的因的V-J重排均发生在特异位点上。在重排均发生在特异位点上。在V片片段的下游，段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的两侧片段的两侧均存在保守的重组信号序列均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基。此重排的重组酶基因因rag (recombination activating gene)

21、共有共有两个，分别产生蛋白质两个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHVJ单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程目录目录六、转座六、转座(transposition) 由插入序列和转座子介导的基因移位或重由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为排称为转座转座。 大多数基因在基因组内的位置是固定的，

22、大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的置。这些可移动的DNA序列包括插入序序列包括插入序列和转座子。列和转座子。 目录目录 插入序列插入序列(insertion sequences, IS)组成：组成：（一）插入序列转座（一）插入序列转座 二个分离的二个分离的反向重复反向重复(inverted repeats, IR)序列序列：941bp,位于两侧位于两侧 特有的特有的正向重复序列正向重复序列：412bp，位于反向重复，位于反向重复序列外侧，为插入序列所特有。序列外侧，为插入序列所特有。 一个一个转座酶转座酶

23、（transposase)编码基因编码基因：产物是转座酶，：产物是转座酶，引起转座，位于中间引起转座，位于中间长长7501500bp正向重复序列正向重复序列正向重复序列正向重复序列IRTransposase GeneIR其组成为：其组成为：目录目录插入序列发生转座的形式：插入序列发生转座的形式：1、保守性转座、保守性转座(conservative transposition) ：2、复制性转座、复制性转座(duplicative transposition)：从原位迁至新位从原位迁至新位插入序列复制后，一个复制本迁到新位，插入序列复制后，一个复制本迁到新位，另一个保留在原位。另一个保留在原位。

24、目录目录转座子转座子Transposon末端反向重复序列末端反向重复序列Terminal repeatsTarget DNATransposase makes staggered cuts in the target siteTransposase Gene1、保守性转座、保守性转座错位开切错位开切转座子转座子目录目录转座子转座子TransposonThe transposon is insterd at the site of the cutsReplication fills in the gapsduplicating the sequences flanking The transpo

25、son复制转座子的旁侧复制转座子的旁侧 序列，填补空隙序列，填补空隙目录目录2 插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座目录目录插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座目录目录 转座子转座子(transposons) 可从一个染色体可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）转座子转座（二）转座子转座 转座子组成：转座子组成： 反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因目录目录 细菌的可流动性元件细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两

26、侧连接反向末端重复序列插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示)B转座子转座子Tn3：含有转座酶、：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L目录目录由转座子介导的转座由转座子介导的转座目录目录第二节第二节 重组重组DNA技术技术又称又称DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 目录目录重组重组DN

27、A技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的药物。药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。1997年年 英

28、国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。目录目录相关概念相关概念n DNA克隆克隆n 工具酶工具酶n 目的基因目的基因n 基因载体基因载体基本原理基本原理 重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系主要内容：主要内容：目录目录一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。贝的集合。 克隆化克隆化(cloning): 获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆分子克隆分子克隆 （DNA克隆）克隆）细胞克隆细胞克隆 个体克隆个体克隆 （

29、动物或植物）（动物或植物） 技术水平技术水平目录目录应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的天然的或人工的DNA）与载体）与载体DNA结合成具有结合成具有自我复制能力的自我复制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)即即重组体重组体，继而通过转化或转染宿主细胞，筛，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一提取获得大量同一DNA分子，也称分子，也称基因克隆或基因克隆或重组重组

30、DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆克隆各种来源的各种来源的DNA即目的即目的DNA,也叫外源也叫外源DNA目录目录 生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等工程、细胞工程等 目的：目的： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基因实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组又称重组DNA技术技术 / 重组重组DNA工艺

31、学。工艺学。目录目录（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（基因工程中重要的酶）（基因工程中重要的酶） DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶(PCR技术中应用的一种耐热的技术中应用的一种耐热的 DNA聚合酶，聚合酶，95度不变性度不变性)重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端

32、之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记

33、或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目录目录识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。是细菌内是细菌内存在的保护性酶，如果有外来的DNA进入细菌内，则RE将其水解掉，对细菌自身起保护作用。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，RE) 目录目录发现发现n19701970年，美国的年

34、，美国的Hamilton SmithHamilton Smith偶然发现，流感嗜血杆偶然发现，流感嗜血杆菌（菌（HaemophilusHaemophilus influenzaeinfluenzae Rd Rd）能降解外源噬菌体）能降解外源噬菌体DNADNA，且该菌的无细胞的抽提液也具有降解（酶）活性。，且该菌的无细胞的抽提液也具有降解（酶）活性。n该酶能降解该酶能降解E.coliE.coli DNA DNA，但不降解产生该酶的，但不降解产生该酶的HaemophilusHaemophilus自身细胞自身细胞DNADNA，称该酶为，称该酶为HindHind，能结合并，能结合并识别的识别的DNAD

35、NA序列为序列为：n限制性内切酶能够在限制性内切酶能够在DNADNA上寻找特定的位点切断双链，上寻找特定的位点切断双链，被称为被称为“分子剪刀”。目录目录 特点特点1 1）均来自微生物，并据此而进行命名；）均来自微生物，并据此而进行命名；2 2）特异识别连续的）特异识别连续的4 4、6 6或或8 8个碱基；个碱基；n按其识别顺序可以计算切割几率：按其识别顺序可以计算切割几率：n假定四种碱基在假定四种碱基在DNADNA链上随机分布，则识别链上随机分布，则识别4 4、6 6、8 8个碱基个碱基顺序出现的几率分别是顺序出现的几率分别是1/441/44、1/461/46、1/481/48（识别顺序出现

36、（识别顺序出现的碱基间隔）。的碱基间隔）。n识别序列越长、切点越少。识别序列越长、切点越少。3 3）识别序列多具有回文结构（）识别序列多具有回文结构（palindromepalindrome）；即识别序列呈二元）；即识别序列呈二元旋转对称。旋转对称。n回文结构多数不是重要的结构基因。回文结构多数不是重要的结构基因。4 4）其切割后的）其切割后的DNADNA可产生不同的末端。可产生不同的末端。目录目录 作用：作用：GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 分类：分类：、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型） 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系与甲基化酶共同构成细菌的

37、限制修饰系统，限制外源统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。回文结构回文结构目录目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。 命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目录目录I：切割位点：非特异性，跟识别位点大于：切割位点：非特异性，跟识别位点大于1000bpII

38、: 同于或接近于识别部位同于或接近于识别部位III: 跟识别位点跟识别位点3端端24-26bp处处切割位点：切割位点：目录目录 限制修饰系统限制修饰系统(Restriction and Modification System)n限制性核酸内切酶与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA目录目录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口目录目录二元旋转对称，即从到的方向阅读是完全相同的二元旋转对称，即从到的方向阅读是完全相同的5 3 识别的回文结构为短小序列大多为识别的回文结构为短小序列大多

39、为4-6bp4-6bp回文结构指的是：二元旋转对称回文结构指的是：二元旋转对称(180(180度旋转度旋转) )，即点对称，即点对称注意：线对称不是回文结构注意：线对称不是回文结构目录目录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口目录目录n限制性核酸内切酶识别序列长度为限制性核酸内切酶识别序列长度为48个bp，6个最多见。n不同酶切产生的相同粘性末端称不同酶切产生的相同粘性末端称配伍配伍末端末端（compatible end),可用连接酶连接。可用连接酶连接。粘性末端粘性末端端突出端突出端

40、突出端突出5 3 5 AATTC 3 G 5 G 3 AATTC 目录目录S A T O RA R E P OT E N E TO P E R AR O T A S具有反向重复序列的是：A、CGGTAGCTAGTTCGB、CGAGGATTAGGAGCC、AAGGTTCGAACCTTD、TTACGTATTACGTA目录目录来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功异源酶：同功异源酶：目录目录有些限制

41、性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶名称名称 识别序列及切割位点识别序列及切割位点名称识别序列及切割点名称识别序列及切割点切割后产生切割后产生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR

42、EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 HpaHpa 5CCGG.3CGG.3 MboMbo 5GATC.3GATC.3 NdeNde 5GATATG.3TATG.3切割后产生切割后产生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPyPy.3.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后产生平末端切割后产生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3HaeHae 5GGCC.3CC.3PvuPvu 5CAGCTG.3C

43、TG.3SmaSma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶目录目录（三）目的基因（三）目的基因(target gene) 应用重组应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。技术所要分离、获得的基因。 应用重组应用重组DNA技术的目：技术的目：1、为分离、获得某种感兴趣的基因或、为分离、获得某种感兴趣的基因或DNA序列，即目的基因（序列，即目的基因（target DNA）或外源）或外源DNA。2 为获得目的基因的表达产物为获得目的基因的表达产物 蛋白质蛋白质目录目录 cDNA (complementary DNA)双称互补双称互补DNA 指经反转录合成的、与指经反转录合成

44、的、与RNA (通常指通常指mRNA或病毒或病毒RNA)互补的单链互补的单链DNA。以单链。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体染色体及线粒体)的所有的所有DNA序列。序列。 目的基因的类型：目的基因的类型：DNADNA克隆时构建的嵌合体克隆时构建的嵌合体DNADNA组成包括：组成包括：载体载体DNA+DNA+目的目的DNADNA目录目录获取目的基因的方法：获取目的基因的方法：1、直接从组织或细胞染色体DNA中分离，限

45、制性酶切；2、利用DNA合成仪化学法合成，或用PCR法扩增；3、提取mRNA反转录合成cDNA直接克隆，或建立c-文库再从中筛选。4、利用鸟枪法建立G-文库，再用核酸探针从基因文库中“钓”取。5、PCR方法目录目录（四）基因载体（四）基因载体 定义定义能携带目的基因，实现其无性繁殖或表达能携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的可独立复制的完整有意义的蛋白质所采用的可独立复制的完整的一些的一些DNA分子。又称分子。又称克隆载体克隆载体。其中为表。其中为表达出蛋白质设计的载体又称达出蛋白质设计的载体又称表达载体表达载体。 常用载体常用载体质粒质粒DNA、噬菌体、噬菌体DNA、病毒

46、、病毒DNA目录目录克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。(大量获得基因片段大量获得基因片段)表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。(大量获得表达产物大量获得表达产物)目录目录n载体的选择标准：载体的选择标准：能自主复制；能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的

47、筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多个单一酶切位点，称为多克隆位点多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。目录目录理想基因载体应具备的条件理想基因载体应具备的条件n可在宿主细胞内自行复制（具有自身的复制子并能携带外源性DNA一同扩增）；n有多种限制性核酸内切酶的单一切割位点（多克隆位点）；n载体分子应尽可能小，可插入较大的外源DNA而不影响复制；n有两个以上的筛选标记（抗药性、酶基因、营养缺陷型、形成嗜菌斑等）。n拷贝数多、与宿主易于分离、抗剪切力强。n表达型载体应配备与宿主细胞适应的启动子、

48、前导顺序、增强子等。目录目录1.1.质粒质粒 (plasmid)特点特点: : 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 是存在于细菌染色体外的小型环状双链是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。分子。大小约为数千大小约为数千碱基对。常有碱基对。常有13个抗药性个抗药性基因，以利于基因，以利于筛选，能加筛选，能加0.110kb的基因的基因目录目录n以大肠杆菌中的质粒载体为例：n大肠杆菌有一套自己的染色体，在染色体之外还有一环状DNA拿出来，因为它体积小，容易操作，通过人工改造变

49、成载体。载体有几个重要部分：n1、用来复制的部分：克隆的话需要复制，要有调控的元件n2、人工改造的部分，用来筛选转到细胞是否成功。因为这一段的编码产物可以对抗抗菌素对宿主细胞的杀伤。如氨苄青霉素抗性基因，根据需要的不同选择不同的抗性基因。n3、装上Lac Z基因：乳糖操纵子，外界给了乳糖，可变成半乳糖，如果没有葡萄糖 Lac Z 如果成功转到大肠杆菌，就会产生n在含有 X-gal 、IPTG的培养基培养，B-半糖苷酶分解X-gal 的显色反应很灵敏。 B-半糖苷酶可以分解X-gal 变成蓝色，如果这个基因遭到破坏，不能合成B-半糖苷酶，不能分解X-gal而呈白色， IPTG半乳糖的类似物，很有

50、效地启动乳糖操纵子的基因转录。人工构建质粒人工构建质粒PBR322全长全长4363碱基对，碱基对，有一个复制起始点，有一个复制起始点，2个抗生素的抗性基因个抗生素的抗性基因（氨苄青霉素抗性基因、（氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因）四环素抗性基因）有多个单一的酶切位点有多个单一的酶切位点目录目录 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆克隆目的基因较小目的基因较小） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆系列（置换型，适用基因组克隆目的基因目的基因较在大较在大）2.2.噬菌体噬菌体(phage) M13 噬菌体噬菌体DNA改造系统（改造系统（含含l

51、acZ基因基因） M13mp系列系列 pUC系列系列目录目录n对 噬菌体噬菌体DNA中间部分进行改造，替换原来的结构基因，装上目的基中间部分进行改造，替换原来的结构基因，装上目的基因，利用它容易感染原核和真核细胞的性质，把目的基因带进去，其容因，利用它容易感染原核和真核细胞的性质，把目的基因带进去，其容量高，量高，8020Kbn病毒载体用的越来越多，因为病毒感染细胞的效率非常高（如，大肠杆病毒载体用的越来越多，因为病毒感染细胞的效率非常高（如，大肠杆菌载体效率不高菌载体效率不高）而病毒几乎百分之百。）而病毒几乎百分之百。n病毒依靠表面的蛋白质与宿主细胞结合，去感染，把它的内容物释放到宿主细胞内

52、。病毒基因组在两头有包装信号，中间是病毒的结构基因，第一步改造是把两头的结构信号拿掉，仅把结构基因重组，转到宿主细胞，能转成功的话，进入的全是结构基因与宿主的基因组整合，利用宿主的一切系统，把它的所有基因产物表达出来，在胞浆呆着，叫包装细胞；第二步，包装信号与目的基因重组，然后再与载体重组，转染到刚才已经建好的包装细胞中。包装信号是与目的基因连在一起的，利用宿主的基因组不断复制更多的带目的基因和包装信号的片段，这些片段当它与与已经有了的病毒蛋白相遇，包装信号发挥作用，可以包装成新的病毒（含有目基因但没有病毒的结构基因了），有感染力但无结构基因了。目录目录 柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)酵母人

53、工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）3、其他其他目录目录 粘性质粒粘性质粒(cosmid)目录目录二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理 基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛

54、选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 目录目录如果要获得一个如果要获得一个DNA克隆，操作：克隆，操作：1、从真核生物染色体、从真核生物染色体DNA中中获取目的获取目的DNA。2、基因、基因载体载体的选择和构建，如质粒。的选择和构建，如质粒。3、将载体和目的基因用同一种限制性内切酶来、将载体和目的基因用同一种限制性内切酶来切割，产生相同的粘性末端。切割，产生相同的粘性末端。4、切割后将载体与目的基因连接起来（外源基因、切割后将载体与目的基因连接起来（外源基因与载体的并接成与载体的并接成重组体重组体）。）。5、将重组体、将重组体导入受体细菌（细胞）导入受体细菌（细胞）。6、筛选出含有重组体

55、的转化子细胞筛选出含有重组体的转化子细胞，并无性繁殖，并无性繁殖重组体的目的基因（细菌重组体的目的基因（细菌扩增扩增得到得到DNA克隆）。克隆）。7、如果要获得蛋白质，最终还需要表达。、如果要获得蛋白质，最终还需要表达。目录目录Host宿主细胞E.Coli the “factory” used in the genetic engineering of insulin目录目录n有了基因有了载体，要想最终实现获得大量基因或产物，最终都要放到host cells实现。最常用的有3类：大肠杆菌、单细胞的真核生物（酵母B4）真核哺育类细胞。n拿基因根据目的不同，取的组织或细胞不同 以以 质质 粒粒 为

56、为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目录目录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取分分1. 化学合成法化学合成法（化学合成仪）（化学合成仪） 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列的氨基酸序列 ；或可推导出序列的基因，；或可推导出序列的基因，如胰岛素的基因、干扰素的基因。如胰岛素的基因、干扰素的基因。2. 基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第见第2

57、2章章) 目录目录1 1 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。目录目录组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细菌内，存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有由克隆载体所携带的所有基因组基因组DNA的集合。的集合。简称简称G文库。文库。它表达了细胞整套基因。它表达了细胞整套基因。2、从基因组、从基因组DNA文库获文库获取目的基因取目的基因目录目录基因文库：基因

58、文库：n提纯生物体全部DNA，用限制性内切酶随机切割成大致相同的数以万计的片段，重组入同一类载体上，转化宿主菌保存，即得基因文库。n（1） G-文库：n用基因组总DNA制备的基因库。n（2） c-文库：n用细胞全部mRNA经反转录制备全套cDNA后建立的基因库。G-文库比 c-文库基因数目多目录目录n就研究一个基因，而且知道这个基因组织中是表达的，表达量多，先抽提其RNA，是否抽提成功，跑电泳，成功的 RNA是5.8S 18S 28S三个条带非常清楚，如果5.8S不清楚，凑合用，如果28S 18S不清楚，不能用，自然界包括手上都有RNA酶，所以做RNA实验时要在一个独立的空间，所有东西都独立，

59、不能与别的实验混合。得到的是总RNA，我们需要的是mRNA， mRNA尾巴上有polyA ，利用这个特别纯化，去掉tRNA、 rRNA，有了mRNA为模板，加入dNTP，合成的是DNA，叫cDNA，cDNA相当稳定，可以长期保存下来。n有了cDNA，酶、引物、底物通过PCR技术，大量扩增。由于知道想做的这段基因的分子量，如果想知道这段基因的分子量，跑电泳，就可以大概知道拿到的这段基因是不是想要的基因，如果与理论基因分子量是对应的，那就可能是，最终的结论还需要测序。n如果是想要的基因，与载体重组，重组后转到细胞内，转到细胞有三种方法：化学的、物理的，生物的 。物理的方法比较简单有基因枪，电转；化

60、学的方法，比如用Ca2+Cl2处理细胞，细胞表面的膜变得疏松，载体容易进入。质子体感染、病毒感染等都可以转入细胞n是否转进去，就开始筛。用抗生素先筛质粒是否转进去了，再用蓝白斑筛目的基因是否进去（蓝斑没有进去，白斑进去了）限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb