医学分子生物学-上课用-7.基因结构与表达分析方法

1、第七章 基因结构与表达分析方法第一节 DNA序列分析一、双脱氧末端终止法二、化学降解法三、DNA自动化序列分析四、新一代DNA测序分析一、双脱氧末端终止法DNA合成反应ATP、dATP和ddATP的结构1. 双脱氧末端终止法原理 DNA合成反应中，ddNTP不存在3-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5-P端形成3,5-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP.7DNA测序技术基础高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)能分离长度为300-500bp，差别仅1个碱基的单链寡核苷酸片段8ddCTPddATPdd

2、TTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPA G C T5 T4711G A A T G A 3ACG CT2. DNA测序主要步骤 单链DNA模板的制备 DNA模板与测序引物退火 掺入法标记反应（如：-35S） 延伸-终止反应 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影 阅读测序结果二、化学降解法 将待测DNA片段3或5端进行同位素标记，标记的DNA片段分成四个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种碱基处断裂。13ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5 TG A A T G A 3ACG CT三、DNA自动化序列分析 利

3、用双脱氧末端终止法的原理 用荧光化合物分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。DNA自动测序步骤4种有不同荧光燃料标记的ddNTPsSanger测序反应反应产物毛细管电泳分离激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光荧光信号采集，计算机分析与DNA自动排序Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries 四、新一代DNA测序技术 基于循环芯片测序法 高通量、测序成本低 焦磷酸测序法 SOLiD分析系统：准确度最高 Illumina测序仪第二节 核酸分子杂交（Nucle

4、ic Acid Hybridization）一、核酸分子杂交原理二、Southern印迹杂交三、Northern印迹杂交四、斑点杂交五、原位分子杂交六、液相杂交一、核酸分子杂交原理 指两条互补单链核酸在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 杂交双方是探针与待测核酸序列。探针探针 + 待测核酸待测核酸 杂交双链杂交双链（一）印迹技术 利用各种物理方法使电泳中的生物大分子转移到硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜、化学活化膜、滤纸等各种膜上，使之成为固化分子。（二）探针标记技术 用放射性同位素、生物素或荧光染料标记序列已知的多聚核苷酸链称为探针。二、Southern印迹杂交（Southern blo

5、tting） 将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。 用于DNA定性定量分析，基因突变分析，及RFLP分析等提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜，高温烘烤与DNA或RNA探针杂交放射自显影Southern印迹杂交 检测靶分子为DNA, 检测靶分子是否含有目的基因。 预杂交三、Northern印迹杂交（Northern blotting） 将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及大小。 用于mRNA定性和定量分析，即基因表达分析。优点：简单、迅速 可在同一张膜上进

6、行多个样品的检测 核酸粗提样品的检测效果也较好四、斑点杂交五、原位杂交in situ hybridization用于核酸定性、定位分析。 菌落原位杂交 荧光原位杂交核 酸 杂 交 分 类 表杂交方法适 用 范 围Southern 印迹检测经凝胶电泳分开的DNA分子，需转印到膜上Northern 印迹检测经凝胶电泳分开的RNA分子，需转印到膜上斑点印迹杂交检测未经分离的、固定在膜上的DNA或RNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子 与固相杂交的区别：直接在液体中杂交，不用纯化或固定靶分子，杂交步骤更简化，杂交速度有所提高，反应的敏感性和特异性更强。 1核酸酶S1保护分析法 2RNA

7、酶保护分析法六、液相杂交技术 利用M13噬菌体合成放射性的ssDNA探针。 探针与待测RNA样品在液相中进行杂交，形成DNA/RNA。核酸酶S1能专一 性地降解未形成杂交的DNA和RNA单链，不降解DNA/RNA双链。 还可用于基因转录起始点分析、内含子剪切位点分析。 1核酸酶S1保护分析法（nuclease S1 protection assay）目的：检测RNA，可用于mRNA的定量分析，比Northern杂交灵敏度更高。原理：探针为ssRNA，杂交后形成RNA/RNA，RNA酶A和T1专一性地降解ssRNA，而dsRNA不被降解。2RNA酶保护分析法（RPA)第三节 聚合酶链式反应（Po

8、lymerase Chain Reaction，PCR）一、PCR技术原理二、耐热DNA聚合酶三、PCR引物设计原则四、PCR条件的优化五、PCR改进技术聚合酶链式反应(PCR) :一、PCR技术原理 Mullis K. 1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 1. PCR循环由三步组成： 变性（denaturation）：9398 退火(annealing)：3765 延伸(extension)：7075 5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Te

9、mplate DNA5 5 5 5 5 5 5 5 反应步骤反应步骤示意图示意图Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。2. PCR扩增终产物大小: 介于两条退火引物5末端之间的双链DNA片段。循环一循环二循环三一对引物：正向和反向限制了PCR扩增的片段的范围 5CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCG

10、GATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGC3GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT 3. 引物设计实例 Y=A（1+E）n Y: 扩增产物的量 A: 最初靶DNA分子

11、数 E: PCR扩增效率 n: 循环次数 4. PCR产量 当E100, A=1时 Y=2n 2n(引物延伸产物的量）PCR thermal cyclerPCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR产物产物5. 平台期与平台效应 PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入线性增长期或静止期，即平台效应。影响因素： 引物及dNTP底物浓度降低。 酶与模板比例下降。PCR平台效应平台效应实际应用提示： 定量PCR应考虑平台期效应，选择最适循环次数。二、耐热DNA聚合酶1. Taq D

12、NA聚合酶（实现了PCR自动化） 95的半衰期: 40 min 最适温度: 72 80 催化反应速率: 150300核苷酸 / 秒/ 酶分子Taq DNA聚合酶特性： 53聚合酶活性； 53外切酶活性；l 逆转录酶活性； 较弱的非模板依赖性； 缺乏35外切酶活性，无校正功能。2. 无机离子及抑制剂的影响 Taq DNA聚合酶的活性对Mg 2+ 浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。 最适Mg 2+浓度：2 mmol/L K+浓度：50 mmol/L如何提高PCR DNA聚合酶的保真性？（1）使用Taq DNA聚合酶时，掺入少量具有35外切酶活性的耐热DNA聚合酶，错配率可降为原来

13、的1/10。（2）使四种dNTP底物浓度相等；（3）MgCl2浓度尽可能低；（4）减少循环数。3. 几种高保真的耐热DNA聚合酶u Tth DNA聚合酶u Vent DNA聚合酶u Pfu DNA聚合酶三、PCR引物设计原则引物设计是决定PCR特异性扩增的关键。PCR引物设计原则：1. 引物与模板的序列紧密互补2. 引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3. 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(错配)5CACTGAACGTAGGCCT3 3GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5特异扩增5CACTGAACGTAGGCCT33GGATCTACATGCGACTTA

14、ATCCGGAGATACC5错误引发p 引物与模板的序列要紧密互补p 引物不能在模板的非目的位点引发 DNA聚合反应(错配)（1）引物之间应避免3端互补p 引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构（2）引物自身不应形成发夹结构PCR引物设计原则: 引物长度: 1030 nt 碱基分布: A、T、G、C 随机分布 G+C含量：40 60%，Tm=4(G+C)+2(A+T) 引物之间：避免3末端互补 引物自身：不应形成二级结构 引物3末端碱基：最好选T/C/G 5末端碱基：可不与模板DNA互补模板引物Taq DNA聚合酶dNTPMg2+退火退火变性变性延伸延伸PCR反应体系：四、PCR条件的优化1.

15、 Taq DNA聚合酶浓度： 1.02.5 U/100 l反应液 2. dNTP浓度：20200 mol/L 3. Mg2+浓度：0.52.5 mmol/L 4. 引物浓度：0.10.5 mol/LPCR条件的优化五、PCR改进技术1. 反转录PCR (reverse transcription PCR， RT-PCR) 以mRNA为模板逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。逆转录酶 AMV（avian myeloblastosis virus） 酶活性最适温度42 MMLV（Moloney murine leukemia virus）：最适温度37 2. 定量RT-PCR（

16、QRT-PCR）半定量RT-PCR 以样本mRNA为模板逆转录合成cDNA，在不同引物对引导下共同PCR扩增“管家”基因和目的基因cDNA 。（1）选择内对照基因 组织中普遍表达、表达量比较恒定的“看家”基因mRNA。如GAPDH和 -actin mRNA等。（2）半定量标准 计算PCR 产物 ： 靶cDNA /GAPDH cDNA（3）KPNA2在正常生理状态东方田鼠和小鼠体内表达分析3. 实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR） PCR扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量。 应用：用于基因DNA拷贝数和mRN

17、A表达定量分析。 67（1）SYBR Green法q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green发荧光，在此阶段采集荧光信号pSYBR Green 69p与目标序列互补与目标序列互补（2）TaqMan法法TaqMan-水解型荧光标记探针水解型荧光标记探针v 探针完整，探针完整，R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被Q基团吸基团吸收收 ，无荧光，无荧光， R与与Q分开，发荧光分开，发荧光vTaq酶有酶有 53外切核酸酶活性，可水解探外切核酸酶活性，

18、可水解探针针。（3）分子信标探针（Molecular Beacon, TM） 该探针具有发夹结构，5端标记荧光报告基团，3端标记淬灭基团。探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料与淬灭染料分离，发出荧光。（4）实时荧光定量PCR计算原理PCR扩增效率的差异使相同的样品最终产量有很大差异CT或或Tc或或Ct值：值： 临界点循环（临界点循环（Threshold cycle ），即从基线到），即从基线到指数增长的拐点所对应的循环数指数增长的拐点所对应的循环数 传染病诊断、监测与疗效预后评估：传染病诊断、监测与疗效预后评估： 揭示疾病发病机制揭示疾病发病机制荧光定量 PCR仪 带有激发光源和荧光信号检测系统

19、的PCR仪，配有电脑系统及分析软件。六、其它PCR技术1. 反向PCR(inverse PCR) 对已知片段两侧的未知序列进行扩增和研究。2. Alu-PCR 利用Alu高度保守序列设计引物扩增哺乳动物未知DNA片段的方法。 3. 原位PCR(in-situ PCR) 是指直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。4. 巢式PCR（nested PCR） 两对引物：内引物、外引物 可检出低拷贝原始模板。 5. 不对称PCR（asymmetric PCR） 通过扩增可获得特异单链DNA，用作杂交探针或DNA测序模板。6. PCR单链构象多态性（PCR-single strand conformation po