第1章培养基准备和培养基灭菌的设备

1、第一节第一节 培养基的准备与要求培养基的准备与要求 培养基培养基：供特定的微生物、动物细胞、植物：供特定的微生物、动物细胞、植物细胞、细胞组织、微藻生物等生长、繁殖、细胞、细胞组织、微藻生物等生长、繁殖、代谢和合成产物需要的，按一定组成比例配代谢和合成产物需要的，按一定组成比例配制而成的营养物质。制而成的营养物质。 培养基按其配方成分可以分成培养基按其配方成分可以分成天然培养基和天然培养基和合成培养基合成培养基。 天然培养基：一类具体成分不十分明确的天然培养基：一类具体成分不十分明确的天然产品，大部分是农产品。天然产品，大部分是农产品。 合成培养基：一类完全明确的化学成分物合成培养基：一类完全

2、明确的化学成分物质配制组成。质配制组成。微生物培养基 微生物培养基按用途分为孢子培养基（不产孢子的称斜面培养基）、种子培养基和发酵培养基。 孢子培养基中的碳源和氮源（特别是有机氮源）的浓度要低，多了会只长菌丝，少长或不长孢子。通常把配制好的培养基装在扁瓶、三角瓶或试管中，在高压灭菌锅中121，灭菌2030min。微生物培养基 种子培养基是指用于摇瓶种子培养或工业生产用种子罐种子培养的营养组成。工业化生产中把配制好的培养基装在种子罐中，采用高压蒸汽直接灭菌，控制温度121，灭菌1520min。 发酵培养基含有供菌丝体迅速生长繁殖和合成产物需要的营养物质。工业化生产中发酵培养基灭菌方法把配制好的培

3、养基装在种子罐中，采用高压蒸汽直接灭菌，控制温度121，灭菌1520min。发酵培养基的要求培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。培养基能满足产物最经济的合成，最大限度地利用原料,使原料全部转化成某种产物。发酵后所形成的副产物尽可能的少。例如酒精发酵。所选用的培养基应满足总体工艺的要求，如不影响通气、提取、纯化和废物处理。微生物培养基 在高温灭菌时，糖类物质容易被破坏且易在高温灭菌时，糖类物质容易被破坏且易和有机氮发生美拉德反应，即氨基酸和还和有机氮发生美拉德反应，即氨基酸和还原糖及还原糖的分解物反应，经过复杂的原糖及还原糖的

4、分解物反应，经过复杂的历程最终生成棕色甚至是黑色的大分子物历程最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质拟黑素。这些物质会对微生物产生毒性，质拟黑素。这些物质会对微生物产生毒性，严重时抑制微生物的生长。严重时抑制微生物的生长。动物细胞培养基 动物细胞培养对培养基要求较高。动物细胞培养动物细胞培养对培养基要求较高。动物细胞培养基的特性是营养丰富，含有氨基酸（基的特性是营养丰富，含有氨基酸（1313种以上）、种以上）、维生素、碳水化合物、无机盐和其它成分（如生维生素、碳水化合物、无机盐和其它成分（如生长因子、激素、贴壁因子等），许多成分是热敏长因子、激素、贴壁因子等），许多成分是热敏物质，不能用高温蒸汽灭

5、菌法，通常采用微孔滤物质，不能用高温蒸汽灭菌法，通常采用微孔滤膜过滤灭菌法来处理动物细胞培养基，保证培养膜过滤灭菌法来处理动物细胞培养基，保证培养基无菌，营养成分不被破坏。基无菌，营养成分不被破坏。植物细胞培养基 植物细胞培养基与动物细胞培养基相比，相对较为简单，培养基的组分由无机盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸和一些复合物。培养基中的热敏化合物（如植物生长激素）不能用高温蒸汽灭菌法，通常采用微孔滤膜过滤灭菌法来处理，然后再按无菌操作方法混入经高温灭菌好的培养基中。第二节 培养基的灭菌方法和设备 大规模微生物、动物细胞、植物细胞培养过程都是纯种培养过程，不允许有杂菌的污染。

6、灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞。 消毒不一定能达到灭菌要求，灭菌可达到消毒的目的。 1.1.化学试剂灭菌法化学试剂灭菌法 甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒2.2.射线灭菌射线灭菌法法3.3.干热灭菌法干热灭菌法 电磁波、紫外线或放射性物质电磁波、紫外线或放射

7、性物质适用范围：无菌室、接种箱适用范围：无菌室、接种箱常用烘箱，灭菌条件：常用烘箱，灭菌条件：160160下保温下保温1h 1h 适用范围：金属或玻璃器皿适用范围：金属或玻璃器皿4.4.湿热灭菌法湿热灭菌法 利用饱和蒸汽灭菌，条件：利用饱和蒸汽灭菌，条件：121121，30min 30min 适用范围：生产设备及培养基灭菌适用范围：生产设备及培养基灭菌5.5.过滤除菌法过滤除菌法 利用过滤方法阻留微生物利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气适用范围：制备无菌空气 6.6.火焰灭菌法火焰灭菌法 火焰火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口 培养基的湿热灭

8、菌培养基的湿热灭菌 湿热灭菌原理湿热灭菌原理灭菌条件灭菌条件灭菌不利方面灭菌不利方面蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。质凝固而杀死各种微生物。 121，30min。 同时会破坏培养基中的营养成分，甚同时会破坏培养基中的营养成分，甚至产生不利于菌体生长的物质。至产生不利于菌体生长的物质。第三节 培养基实罐灭菌的计算 发酵罐发酵罐蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽冷却水冷却水无菌培养基无菌培养基预热罐预热罐 连消泵连消泵 加热器加热器维持罐维持罐冷却管冷却管 连续灭菌的基本设备连续灭菌的基本

9、设备问题问题配料罐配料罐送料泵送料泵第四节 培养基连续灭菌的设备及计算 连续灭菌的流程与设备连续灭菌的流程与设备（1 1）配料预热罐，）配料预热罐，将配制好的料液预热到将配制好的料液预热到7575 90 90 以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；水汽撞击声；（2 2）加热器，）加热器，用高温蒸汽使料液用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭温度很快升高到灭菌温度（菌温度（130130 140140），目前使用最广泛的加热器有），目前使用最广泛的加热器有塔式加热器和喷射式加热器。塔式加热器和喷射式加热器。塔式加热器塔式加热器用内外两根管

10、子套合组成，内管开有45向下倾斜的小孔，孔径一般为6mm，蒸汽由此喷出。小孔在导入管上的分布是上稀下密，使蒸汽较为均匀。培养基由塔底进入，与 小孔中喷出的蒸汽连续混合后在塔上部流出。培养基在塔内停留时间一般取2030s；线速度要求0.1m/s。这种连消塔比较高大，钻孔、加工、安装等均不便。塔式加热器塔式加热器喷射式加热器喷射式加热器改进后的喷射式加热器喷射式加热器，培养基以较高流速从中间管喷入，蒸汽从管外环隙同时喷入，在器内进行混合，为了增加混合效果，器内设置一块弧形挡板。（3 3）维持罐，）维持罐，由于加热器加热的时间很短，光由于加热器加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐起保温

11、灭靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐起保温灭菌作用，使加热后的培养基在维持设备中保温菌作用，使加热后的培养基在维持设备中保温停留一段时间，以达到灭菌目的。要求该设备停留一段时间，以达到灭菌目的。要求该设备物料返混要小，外壁用保温材料保温。物料返混要小，外壁用保温材料保温。（4 4）冷却设备，）冷却设备，培养基在完成灭菌后，要求快速培养基在完成灭菌后，要求快速冷却到发酵工艺规定的温度。冷却设备要求严密冷却到发酵工艺规定的温度。冷却设备要求严密性好，冷却效率高。目前工业化微生物发酵企业性好，冷却效率高。目前工业化微生物发酵企业都采用都采用真空冷却器、喷淋冷却器和螺旋板换热器真空冷却器、喷淋冷却器和螺

12、旋板换热器。冷却器内是真空，培养基进入后，压力骤降，急速蒸发，所产生的二次蒸汽从顶部抽汽管排走，培养基由于蒸发产生大量蒸汽，消耗了培养基大量的热能，于是培养基温度在瞬息间降低到与器内真空度相对应的沸点温度为止。培养基最终被冷却的温度取决于设备操作的真空度。真空式冷却器喷淋式冷却器最上端有个淋水槽，冷却水从淋水槽中溢出，沿着檐板淋到最上层冷却器直管，然后一层一层往下流，高温培养基由底端进，上端出。由两张薄板平行卷制而成，形成了两个均匀的螺旋通道，两种传热介质可进行全逆流流动，大大增强了换热效果，即使两种小温差介质，也能达到理想的换热效果。一般一对进出口在圆周边上，另一对进出口则设在圆鼓的轴心上。

13、螺旋板换热器喷射加热连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程空罐灭菌空罐灭菌 培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法，则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。 定义：空罐灭菌也称空消空消。无论是种子罐、发酵罐、还是消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，称为空罐灭菌。优优 点点缺缺 点点连连续续灭灭菌菌1.1.高温短时灭菌，培养基高温短时灭菌，培养基 营养成分损失少。营养成分损失少。2.2.发酵罐占用时间缩短，发酵罐占用时间缩短， 利用率高。利用率高。 1.1.设备复杂，操作麻烦设备复杂，操作麻烦, , 染菌机会多。染菌机会多。2.2.不适合含大量固体物不适合含大量固体物 料的灭菌。料的灭菌。间间歇歇灭灭菌菌1.1.设备要求低，不需另外设备要求低，不需