基因工程实验biochemlab

1、基因工程实验biochemlab实验目录实验一 实验计划表实验二 染色体DNA的提取实验三 PCR扩增实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接实验五 感受态细胞的制备实验六 重组质粒的转化实验七 质粒的提取实验八 重组质粒的酶切鉴定第1页/共63页实验一 实验计划表、了解本学期整体的实验流程及安排。、熟练使用微量移液器。、学习制备琼脂糖凝胶。第2页/共63页v基因工程（Gene Engineering）又称重组技术，把不同生物的与载体相连，并导入到受体细胞中去增殖、表达。v基因工程包括切、接、转、增、检五大要素。第3页/共63页凝胶电泳系统、微量移液器、三角瓶、微波炉、铲子、手套琼脂糖、1

2、TBE、加样缓冲液第4页/共63页 目的基因的获取基因组总提取凝胶电泳检测扩增目的基因 产物的电泳检测产物纯化获得目的基因1.本学期实验计划第5页/共63页重组、转化与pMD18-T连接DH5a感受态细胞制备 转化、平板涂布、培养筛选与鉴定抗生素抗性筛选挑单菌落培养提取质粒质粒酶切、电泳检测第6页/共63页2.微量移液器的使用 将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。 等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到

3、第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、 提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头使用操作第7页/共63页使用注意事项使用注意事项 未装吸头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。 一定要再允许范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。 不要横放带有残留液体吸头的移液器 不要用大量程的移液器移取小体积样品 微量移液器每日用完后，应旋转到最大刻度，让弹簧恢复原形，保持弹性。 为了确保微量移液器的准确性，移液器必须定期进行校准。第8页/共63页3. 琼脂糖凝胶制作 选择好胶盒、胶板和梳子，洗净，把胶板放入胶盒中，梳子插上。 量取25ml 1T

4、BE溶液放入锥形瓶或烧杯中 称量0.25g 琼脂糖，倒入锥形瓶中 将锥形瓶放入微波炉中，让溶液沸腾2-3次，琼脂糖彻底融化 锥形瓶取出，稍稍冷却后倒入胶盒中 等待琼脂糖冷却凝固形成点样孔后即可第9页/共63页掌握酚氯仿法提取的原理和操作。第10页/共63页 生物的大部分或几乎全部都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可

5、用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。 第11页/共63页消化缓冲液: TE 、EDTA、 NaCl、 SDS、蛋白酶KTris平衡酚、氯仿:异戊醇(24:1)，NaAc，无水乙醇，70%乙醇 微量移液器、高速离心机、1.5ml管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱第12页/共63页、切取组织 ，剪碎放入研钵(越细越好)，磨成粉末。以消化缓冲液处理55水浴过夜，获得组织消化液。、取出消化组织液，5000rpm，min，取上清液于新离心管 。、 加等体积ris-平衡酚，轻轻混匀min。4、1000rpm，10min

6、，留上清，取上清液于新离心管 。、加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，轻轻混匀min。、同。、加等体积氯仿:异戊醇，轻轻混匀min。、同。第13页/共63页、加1/10体积3mol/LNaAc，及.倍体积预冷（）无水乙醇，混匀。 沉淀min。、12000rpm，15min，弃上清。、加70%乙醇1ml，混匀。、 同。、管放置于烘箱中烘干。、加ul TE或ddH2O溶解。、琼脂糖凝胶电泳检测。第14页/共63页提取染色体的基本原理是什么？操作中应该注意什么？第15页/共63页、学习扩增的基本原理。、掌握技术的常规操作。、了解扩增的参数设计。实验三实验三扩增第16页/共63页、聚合酶链

7、反应 (Polymerase chain reaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异片段的过程。、反应体系引物、dNTP、 Mg 、模板、 Taq DNA聚合酶， Buffer。第17页/共63页、循环参数 9 5min 9 30s 5 30s 72 30s goto times 72 10min第18页/共63页 Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液， MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系

8、统，紫外凝胶成像系统第19页/共63页、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul反应体系。 dd water 20.5ul 10PCR buffer（不含MgCl2） 3ul 25mM MgCl2 2ul 10mmol/L dNTP 1ul 10mol/L Primer 1 1ul 10mol/L primer 2 1ul 模板 1ulTaq酶 0.5ul 总体积 30ul第20页/共63页、在离心机中混匀。、管放入仪中，按照原理中的条件设置程序，进行反应。、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。 第21页/共63页PCR中产生非特异性条带的原因可能有哪些？第22页/

9、共63页实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接第23页/共63页1. 学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。2. 掌握DNA体外连接的方法。第24页/共63页1.DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关DNA分子大小DNA分子构象琼脂糖凝胶浓度电泳所用电压电泳缓冲液第25页/共63页2. 利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。3. Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。第26页/共63页凝胶电泳系统，刀

10、片，紫外仪，酒精灯1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65 水浴锅PCR产物，1TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000 marker第27页/共63页1. 2%琼脂糖凝胶电泳2. 在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量3. 加入5个凝胶体积量的DR- Buffer 4. 混匀 65加热融化凝胶块5. 加入DR-Buffer量的1/2 体积的DR- Buffer, 当目的片段小于400bp再加入终浓度为20% 的异丙醇6. 将上述溶液short后转移至spin coloumn中12000rpm,

11、 1min 弃滤液7. 加入500ul RinseA 12000rpm 30s 弃滤液8. 加入700ul RinseB 12000rpm 30s弃滤液9. 同8第28页/共63页10. 将spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测11. 链接反应（冰上操作）在一支0.2 ml EP管中加入以下试剂：纯化的目的DNA片段 4.5ulVector 0.5ul连接液 5ul 混匀 16连接过夜第29页/共63页为什么连接反应的温度要定在

12、16度？第30页/共63页实验五 感受态细胞的制备1.掌握感受态细胞的制备方法2. 学习和理解影响细胞感受态的因素第31页/共63页 感受态是指受体（或者宿主）细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是有受体菌的遗传性所决定的。转化过程中所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，既不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。用Cacl2处理受体细胞，使细胞的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。 第32页/共63页 培养皿，离心管，冷冻高速离心机，超低温冰箱，摇床，锥形瓶 Cacl2， LB Amp-液体培养基， LB Amp-固体培养基，DH5甘油菌

13、第33页/共63页1.先从保存菌种DH52(-70),划线培16h(37)2.从平板中挑取一个单菌落移到4ml，LB Amp- 培养基中，37摇荡过夜180250rpm3.按1%的接种量将过夜培养的菌转接于50ml LB Amp-的培养基中，37，250rpm（2h2.5h）4.当培养菌生长至OD600达0.50.6时（约22.5h），将培养菌取出，在无菌条件下将细菌转移至50ml无菌聚乙烯离心管中，冰浴10min，以使培养液冷至0第34页/共63页5.4，5000rpm/min,7min6.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重悬于4，5000rpm/min，5min7.细胞沉淀用10ml

14、冰冷的Cacl2溶液重悬冰上放置30min， 于4，5000rpm/min，5min8.用2ml冰冷Cacl2溶液重悬各管细胞，然后按每管100ul的量分装于预冷的0.5ml EP管中存于-70第35页/共63页 如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？第36页/共63页实验六 重组质粒的转化 掌握重组质粒的转化方法第37页/共63页1.转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。2.化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使

15、其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。第38页/共63页 水浴锅，培养箱，枪头，冰盒，超净台，微量加样器，制冰机，牙签 DH5感受态细胞，连接产物，LB Amp-液体培养基， LB Amp+液体培养基，LB Amp+ 培养基平板第39页/共63页1.5ul连接液加100ul感受态细胞（-70取出），置冰上，加后轻轻旋动2.冰上静置30min3.42水浴90s热休克，冰上3min4.加10ul LB （Amp-）至菌液，混匀（颠倒）5.37烘箱30min6.37，摇床 30min 180rpm7.涂平板 100ul/板， 37培养1216h8.挑克隆 挑取菌落接入5ml LB Am

16、p+液体培养基中，37 振荡过夜 第40页/共63页 当质粒加入宿主细胞进行转化，再涂布在含有Amp的LB培养基平板前，为什么要在LB培养基中培养1h?第41页/共63页实验七 质粒的提取1.学习质粒DNA提取的基本原理2.掌握质粒最常用提取方法第42页/共63页 细菌质粒DNA的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对分子质量较小、易于复性的特点进行的，碱法是常用的提取方法。在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件，由于变性的质粒分子能在较短的时间内复性而染色体DNA不能复性，从而分离质粒DNA。第43页/共63页高速离心机、微量移液器、枪头、凝胶电泳系统，凝胶紫外成像系统，

17、EP管EB，加样缓冲液，阳性克隆的培养液，质粒提取试剂盒第44页/共63页1. 取14ml过夜培养的阳性克隆菌液，12000rpm离心2min,弃上清2.用250ul的solution(含RNaseA1)充分悬浮细菌沉淀3.加入250ul的solution轻轻上下翻转混合56次使菌体充分裂解，形成透明溶液4.加入400ul的4 预冷的solution，轻轻上下翻转混合56次，直至形成紧实凝集块，室温静置2min第45页/共63页5.室温12000rpm， 10min，取上清6.将试剂盒中的Spin column安置于collection Tube上7.将操作6中的上清液转移至Spin colu

18、mn中12000rpm， 1min，弃滤液8.将500ul的RinseA加入Spin column中， 12000rpm，30s，弃滤液9.加700ul的RinseB加入Spin column中， 12000rpm，30s，弃滤液10.同9第46页/共63页11.将Spin column安置于新的1.5ml离心管上,在Spin column膜中央处加入60ul灭菌或Elution Buffer,室温静置1min12. 12000rpm， 1min洗脱DNA13.凝胶电泳检测提取效果，并以空载体做对照，从质粒大小上初步判断是否有外源基因进入载体第47页/共63页在碱法提取质粒DNA操作过程中应该

19、注意哪些问题？第48页/共63页实验八 重组质粒的酶切鉴定1.学习和掌握限制性内切酶的特性2.了解重组质粒的鉴定方法，重点掌握重组质粒的酶切鉴定方法第49页/共63页1.限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定第50页/共63页2. 影响核酸限制性内切酶活性的因素DNA的纯度；DNA的甲基化程度；酶切消化反应的温度；DNA的分子结构；溶液中离子浓度及种类；缓冲液的 pH值。第51页/共63页三

20、、实验用品及试剂三、实验用品及试剂恒温水浴锅、微量加样器、枪头、凝胶电泳系统、凝胶成像系统酶Hind Hind III III 和 BamH BamH I I 核酸内切酶（TakaraTakara）， Hind Hind IIIIII和 BamH BamH I I酶解缓冲液(10(10通用 buffer)buffer)，琼脂糖，pMD18-T质粒，加样缓冲液第52页/共63页1.对初步确定有外源基因进入的质粒用限制性内切酶进行切割，进行进一步的鉴定 重组质粒DNA 10ul ddH2O 7ul 10通用缓冲液 2ul BamH I（10U/ul） 0.5ul Hind III（10U/ul） 0.5ul 总体积 20ul2. 37 保温0.5-1h3.利用空载体与目的基因片段为对照，对酶切后的片段进行比对，从酶切后的片段的数目及大小上进行确认第53页/共63页 除了酶切鉴定重组质粒外，还可以选用何种方法鉴