基因编辑技术和原理

1、 基因编辑技术和原理 李傲 什么是基因编辑技术？ 基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上， 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变， 又修改并编辑了原有的基因组， 真正达成了“编辑基因”。 基因编辑的研究背景 传统的动物育种方法受到种源的限制，其程需要耗费大量的人力、物力和财力，经历漫长的培育过程。而且不同种间的杂交很困难，育种成果很难取得突破性进展。 基因编辑原理 现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性 DNA 双链断裂激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端连接和同源重组修复 两条途径

2、。 1.非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ 机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点的基因敲入。 （ 移码突变：在正常DNA分子中，碱基缺失或增加3的倍数，造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。） 2. 同源重组修复（HR） 是一种相对高保真度的修复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。如果在一个基因两侧同

3、时产生DSB，在一个同源供体存在的情况下，可以进行原基因的替换。 基因编辑原理基因编辑技术的种类目前主要有 3 种基因编辑技术， 分别为：n人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)技术；n转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALEN)技术； nRNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术(CRISPR- Cas 9）。 1. ZFN 基因组编辑技术ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。1986年

4、Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结合区域发现了Cys2- His2锌指模块，到1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 Fok核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由Fok构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能

5、会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。 2. TALEN 基因组编辑技术 2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现一种转录激活子样效应因子，它的蛋白核酸结合域的氨基酸序列

6、与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜力。TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 Fok融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶标位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 Fok形成二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同的TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一般为

7、1220 bp. 实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个碱基为 T 时其结合效果更佳。目前， TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动物和植物的位点特异性基因打靶， 与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势， 但仍然有些问题需要解决，例如:脱靶效应、TALEN 与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等。CRISPR /Cas9 基因组编辑技术1987年，Ishino 等在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。经过几十年的研究，在2007年终于证明这种重复序列与细菌获得性免疫的关系。CRISPR/Cas

8、 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。在这个系统中，只凭借一段 RNA 便能识别外来基因并将其降解的功能蛋白引起了研究者的兴趣。直到2012 年，Jinek 等第一次在体外系统中CRISPR/Cas9 为一种可编辑的短RNA 介导的DNA核酸内切酶，标志着 CRISPR /Cas9 基因组编辑技术成功问世。基因编辑的优势与传统的以同源重组