微生物与发酵工程经典知识荟萃

1、微生物微生物 本章内容本章内容 一、一、发酵工程定义及在生物技术中的地位发酵工程定义及在生物技术中的地位二、二、发酵工程发展简史发酵工程发展简史三、三、发酵工业的特点及其应用范围发酵工业的特点及其应用范围四、四、工业发酵的类型与典型过程工业发酵的类型与典型过程五、五、发酵工程前沿及应用前景发酵工程前沿及应用前景http:/ ferver：发泡、沸腾发泡、沸腾 fermentation微生物的发酵现象http:/ 两种角度（能量、产物）生生物物化化学学家家http:/ 有氧呼吸、糖酵解、厌氧呼吸（兼性微生物）（1）有氧呼吸有氧呼吸（氧供应充分、有机物氧化彻底、产生大量能量）（2）糖酵解（暂时缺氧

2、、有机物氧化不彻底、产生少量能量）2、无氧呼吸无氧呼吸：特指那些不需要氧的微生物所进行的能量代谢。 指有机物经彻底或不彻底氧化，所脱下来的电子最后传给外源的无机氧化物(个别是有机氧化物)并释放较少能量。 根据最终电子受体不同，无氧呼吸分为：硝酸盐呼吸硝酸盐呼吸、硫酸盐呼吸、硫呼吸、碳酸盐呼吸及延胡索酸呼吸等。对发酵现象的不同理解对发酵现象的不同理解 两种角度（能量、产物） 发酵是指有机化合物进行无氧代谢发酵是指有机化合物进行无氧代谢释放能量释放能量 的过程的过程 厌氧发酵是厌氧菌借助氧化厌氧发酵是厌氧菌借助氧化-还原反应还原反应释放能量释放能量的的过程过程 发酵是酵母无氧呼吸发酵是酵母无氧呼吸

3、产生能量产生能量的过程的过程 需氧发酵是好氧生物在受到分子态氧短缺限制时的不需氧发酵是好氧生物在受到分子态氧短缺限制时的不 完全氧化完全氧化释放能量释放能量的过程的过程 生生物物化化学学家家http:/ 培养来培养来生产产物生产产物的所有过程？（需氧过程、细胞工程）的所有过程？（需氧过程、细胞工程）发酵是利用微生物培养来发酵是利用微生物培养来生产产物生产产物的无氧或需氧的任何过程的无氧或需氧的任何过程http:/ 发酵工程概念？发酵工程概念？ 微生物细胞加工技术过程优化与放大微生物细胞加工技术过程优化与放大 n传统发酵工程传统发酵工程：利用微生物的生长和代谢活：利用微生物的生长和代谢活动来大量

4、生产人们所需产品的动来大量生产人们所需产品的过程理论与工过程理论与工程技术体系程技术体系。该技术体系主要包括菌种选育。该技术体系主要包括菌种选育与保藏、菌种扩大生产、代谢产物的生物合与保藏、菌种扩大生产、代谢产物的生物合成与分离纯化制备等技术集成。成与分离纯化制备等技术集成。http:/ 现代发酵工程现代发酵工程：是将：是将DNA重组及细胞融合重组及细胞融合技术、酶工程技术、组学及代谢网络调控技术、酶工程技术、组学及代谢网络调控技术、过程工程优化与放大技术等新技术技术、过程工程优化与放大技术等新技术与传统发酵工程融合，大大提高传统发酵与传统发酵工程融合，大大提高传统发酵技术水平，拓展传统发酵应

5、用领域和产品技术水平，拓展传统发酵应用领域和产品范围的一种现代工业生物技术体系（新一范围的一种现代工业生物技术体系（新一代工业生物技术）。代工业生物技术）。 强调现代生物技术、控制技术强调现代生物技术、控制技术和装备技术在和装备技术在传统与现代传统与现代发酵工业领域的发酵工业领域的集成应用。集成应用。http:/ 传统大型发酵工传统大型发酵工业的中央控制业的中央控制 现代发酵工业现代发酵工业的中央控制的中央控制 3. 发酵工程在生物技术中的地位发酵工程在生物技术中的地位 生物技术：应用自然科学和工程学的原生物技术：应用自然科学和工程学的原理，依靠生物及其细胞的催化作用，将理，依靠生物及其细胞的

6、催化作用，将物料进行加工以提供产品或为社会服务物料进行加工以提供产品或为社会服务的技术。的技术。发酵工程是生物技术的应用基发酵工程是生物技术的应用基 础，是生物技术产业的核心。础，是生物技术产业的核心。http:/ 分离和纯化产品。分离和纯化产品。包括固液分离技术、细包括固液分离技术、细胞破壁技术、产物纯化胞破壁技术、产物纯化技术，以及产品检验和技术，以及产品检验和包装技术等包装技术等 下游技术发酵过程控制，主要包发酵过程控制，主要包括发酵条件的调控，无括发酵条件的调控，无菌环境的控制，过程分菌环境的控制，过程分析和控制等析和控制等 中游技术广义发酵工程对生物广义发酵工程对生物学和工程学的要求

7、学和工程学的要求 优良种株的选育和保优良种株的选育和保藏（包括菌种筛选、改造，藏（包括菌种筛选、改造，菌种代谢路径改造等），菌种代谢路径改造等），上游技术上中下游相互关联！上中下游相互关联！生物技术体系生物技术体系生化工程生化工程酶工程酶工程细胞工程细胞工程发酵工程发酵工程 产物 产品产品 产品产品基因工程基因工程 产品产品强调过程优强调过程优化与控制化与控制http:/ 自然发酵阶段自然发酵阶段19001940 纯培养技术的建立纯培养技术的建立19401950 通气搅拌纯培养发酵技术的建立通气搅拌纯培养发酵技术的建立19501960 诱变技术与代谢控制发酵技术的建立诱变技术与代谢控制发酵技术

8、的建立19601970 开拓发酵原料时期（石油发酵时期）开拓发酵原料时期（石油发酵时期）1970年以后年以后 进入基因工程菌发酵时期，以及细胞进入基因工程菌发酵时期，以及细胞 大规模培养技术的全面发展。大规模培养技术的全面发展。 近年来，以现代生物技术和过程工程技术为基础的近年来，以现代生物技术和过程工程技术为基础的 现代发酵工业突飞猛进。现代发酵工业突飞猛进。http:/ 啤酒、干酪、酸乳等啤酒、干酪、酸乳等n17世纪，能在容量为世纪，能在容量为1500桶（一桶约桶（一桶约136升）的升）的 木质大桶中进行第一次真正的大规模酿造木质大桶中进行第一次真正的大规模酿造 n1757年应用温度计；年

9、应用温度计；1801 使用原始热交换器使用原始热交换器 主要特点：嫌气发酵，非纯种培养主要特点：嫌气发酵，非纯种培养 ，产品质，产品质 量不稳定量不稳定http:/ 的纯粹培养的纯粹培养nPetri创造一种培养皿创造一种培养皿(petri dish)用于用于 微生物平板分离微生物平板分离nWinograsky和和 Beijerink发明富集培发明富集培 养法，分离特定的微生物养法，分离特定的微生物n主要产品：酵母、甘油、乳酸、丙酮丁醇主要产品：酵母、甘油、乳酸、丙酮丁醇等等http:/ ABS0基质浓度对基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（两种菌的比生长速率（）的影响）的影响 当当SS0时，富

10、集什么菌株？时，富集什么菌株？http:/ Weizmann 发明了发明了丙酮丁醇发酵，建立了真正的丙酮丁醇发酵，建立了真正的无杂菌发无杂菌发酵酵。n在面包酵母的生产中首先采用了分批补在面包酵母的生产中首先采用了分批补料培养技术料培养技术 主要特点：纯培养为主、嫌氧发酵，产主要特点：纯培养为主、嫌氧发酵，产品产量品产量 质量控制水平大大提高质量控制水平大大提高http:/ n主要技术进展：主要技术进展：通气搅拌解决了液体深层培养的供氧问题。通气搅拌解决了液体深层培养的供氧问题。无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大 型发酵罐的密封与抗污染设计解决了耗氧型发酵罐

11、的密封与抗污染设计解决了耗氧 发酵中的杂菌污染问题。发酵中的杂菌污染问题。http:/ 酵，一系列过程工程技术创新酵，一系列过程工程技术创新n意义：意义：推动抗生素工业乃至整个发酵工业快速推动抗生素工业乃至整个发酵工业快速发展发展建立了完整的好氧发酵放大技术及装备建立了完整的好氧发酵放大技术及装备奠定了现代发酵工业的理论和实践基础奠定了现代发酵工业的理论和实践基础http:/ n代谢控制发酵技术：应用生物化学的代谢代谢控制发酵技术：应用生物化学的代谢知识和遗传学理论，选育微生物突变株，知识和遗传学理论，选育微生物突变株，从而调控微生物代谢，大量积累目标发酵从而调控微生物代谢，大量积累目标发酵产

12、物。产物。n主要应用：主要应用：氨基酸氨基酸及核苷酸等基于初生代及核苷酸等基于初生代谢产物谢产物 的发酵生产，以及有机酸的发酵生产，以及有机酸 、抗抗生素等生素等 http:/ 料蛋白质的来源料蛋白质的来源 n技术进步技术进步：n发展了高压喷射式、强制循环式等多种发发展了高压喷射式、强制循环式等多种发 酵罐及其发酵技术酵罐及其发酵技术 n计算机和自动控制技术的运用：灭菌和发计算机和自动控制技术的运用：灭菌和发 酵过程自动控制，促进发酵工业朝酵过程自动控制，促进发酵工业朝连续化、连续化、 自动化方向自动化方向发展发展 http:/ 基因工程产品生基因工程产品生产以及基因工程技产以及基因工程技术应

13、用术应用n世界上已批准上市的世界上已批准上市的基因工程药物有几十基因工程药物有几十种，如：胰岛素、人种，如：胰岛素、人生长激素等。生长激素等。http:/ n高产微生物代谢产物及非微生物代谢产物的高产微生物代谢产物及非微生物代谢产物的基因工程菌构建及产品的发酵生产基因工程菌构建及产品的发酵生产n主导碳氧经济发展，碳氢经济的替代及生物主导碳氧经济发展，碳氢经济的替代及生物炼制技术的兴起炼制技术的兴起http:/ 牛生长激素(BGH纤维素酶, -干扰素乙型肝炎疫苗集落刺激因子(CSF)促红细胞生成素(EPO)抗血友病因子组织溶纤原激活剂(t-PA)部分利用基因工程技术研制的产品http:/ 可再生

14、资源的加工和综合利用（如纤维素原可再生资源的加工和综合利用（如纤维素原料）料）n过程优化技术过程优化技术n多尺度生物反应器优化控制技术多尺度生物反应器优化控制技术n生物炼制生物炼制http:/ 可用基因工程、细胞工程的方法可用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传特性进行定向改造，对菌种的遗传特性进行定向改造，以构建工程细胞或工程菌，从而以构建工程细胞或工程菌，从而达到生产相应产品的目的达到生产相应产品的目的 培养基的配制培养基的配制原则原则 （1）目的要明确。）目的要明确。（2）培养基的营养要协调）培养基的营养要协调（3）pH要适宜。要适宜。2、培养基的配制、培养基的配制成分成分酸碱度酸碱度豆

15、饼水解液、玉米浆、豆饼水解液、玉米浆、尿素、磷酸二氢钾、尿素、磷酸二氢钾、氧化钾、硫酸镁、生氧化钾、硫酸镁、生物素物素PH为为7 8谷氨酸发酵的培养基谷氨酸发酵的培养基（液体、天然）（液体、天然）2、培养基的配制、培养基的配制密闭式发酵罐密闭式发酵罐发酵罐发酵罐3、灭菌、灭菌 竞争关系竞争关系例如：如果在谷氨酸发酵过程中混入例如：如果在谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌的抗生素就放线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡。会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡。如果在青霉素生产过程中污染了杂如果在青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌则会分泌青霉素酶，菌，这些杂菌则会分泌青霉素酶，将

16、合成的青霉素分解掉。将合成的青霉素分解掉。3、灭菌、灭菌用高温、高压的方式，杀死所有杂菌的胞用高温、高压的方式，杀死所有杂菌的胞体、芽孢和孢子。体、芽孢和孢子。 怎样才算灭怎样才算灭菌彻底呢？菌彻底呢？将培养液投将培养液投放到发酵罐放到发酵罐中，中，98kPa的蒸汽进行的蒸汽进行灭菌灭菌4、扩大培养和接种、扩大培养和接种扩大培养和扩大培养和连续培养有连续培养有何区别？何区别？5、发酵过程（中心阶段）、发酵过程（中心阶段）下图表示发酵罐中各种因素对谷氨酸棒下图表示发酵罐中各种因素对谷氨酸棒状杆菌发酵产生谷氨酸的影响，其中不状杆菌发酵产生谷氨酸的影响，其中不正确的是正确的是5、发酵过程（中心阶段）

17、、发酵过程（中心阶段） 控制控制因素因素 作用机理作用机理 控制方法控制方法 温温 度度影响酶的活性影响酶的活性影响生物合成途径影响生物合成途径影响培养基的理化影响培养基的理化性质以及菌种对营性质以及菌种对营养物质的分解吸收养物质的分解吸收影响微生物生长影响微生物生长 通过控制通过控制产热与散产热与散热的平热的平 衡来控制衡来控制培养基的培养基的温度温度控制因素控制因素 作用机理作用机理 控制方法控制方法 pH影响酶的活性影响酶的活性影响细胞膜的带影响细胞膜的带电情况，导致细胞电情况，导致细胞膜通透性改变从而膜通透性改变从而影响对营养物质的影响对营养物质的吸收和产物的排出吸收和产物的排出影响培

18、养基营养影响培养基营养物质的分解物质的分解加入缓冲溶加入缓冲溶液，补加氨液，补加氨水、尿素、水、尿素、CaCO3、NH4HCO3等来控制等来控制pH控制因素控制因素 作用机理作用机理 控制方法控制方法 溶溶 解解 氧氧促进需氧型微生物促进需氧型微生物的呼吸的呼吸抑制厌氧型微生物抑制厌氧型微生物代谢代谢通过无菌空通过无菌空气的通气量气的通气量和搅拌速度和搅拌速度来控制来控制控制控制因素因素 作用机理作用机理 控制控制方法方法 泡泡 沫沫占据发酵罐的空间占据发酵罐的空间影响通气、搅拌影响通气、搅拌导致代谢异常导致代谢异常安装消安装消泡沫挡泡沫挡板或用板或用消泡沫消泡沫剂剂营养营养浓度浓度直接影响菌

19、体的生长、直接影响菌体的生长、影响代谢产物的积累、影响代谢产物的积累、影响代谢途径影响代谢途径根据具根据具体情况体情况及时控及时控制制6、分离提纯、分离提纯n温度温度30-37 C，pH7-8，经过，经过28-32h，培养液中就会产生大量的谷氨酸培养液中就会产生大量的谷氨酸50-100g/Ln提取出谷氨酸提取出谷氨酸n用适量的用适量的Na2CO3溶液中和溶液中和n过滤过滤n浓缩浓缩n离心离心味精味精6、分离、提纯、分离、提纯 n菌体本身，如酵母菌和细菌等菌体本身，如酵母菌和细菌等n采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来离出来n代谢产物代谢产物n采用蒸

20、馏、萃取、离子交换等方法进行提取。采用蒸馏、萃取、离子交换等方法进行提取。（一）发酵工业的特点（一）发酵工业的特点 发酵过程发酵过程一般是一般是在在常温常压常温常压下进行的生化下进行的生化反应，反应， 反应安全，要求条件较简单。反应安全，要求条件较简单。 可用较廉价原料生产较高价值产品。可用较廉价原料生产较高价值产品。 反应专一性强。反应专一性强。 能够专一性地和高度选择性地对某些较为能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的复杂的 化合物进行特定部位的生物转化修饰。化合物进行特定部位的生物转化修饰。 http:/ 酶制剂酶制剂 代谢产物代谢产物 生物转化生物转化微生物特殊机能的利用微生物特殊

21、机能的利用n 利用微生物消除环境污染利用微生物消除环境污染n 利用微生物发酵保持生态平衡利用微生物发酵保持生态平衡n 微生物湿法冶金微生物湿法冶金n 利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域http:/ 疫苗疫苗http:/ 药用功能菌体药用功能菌体 茯苓菌茯苓菌茯苓茯苓 担子真菌担子真菌灵芝、香菇类灵芝、香菇类 虫草头孢菌虫草头孢菌 密环菌密环菌 微生物菌体微生物菌体http:/ 面包酵母面包酵母 藻类藻类芽孢杆菌和伴孢晶体芽孢杆菌和伴孢晶体 http:/ http:/ http:/ 亮氨酸脯氨酸精氨酸（C6N4)蛋氨酸（C5N5)天门冬氨酸（C4N)苏氨酸（C9

22、N)异亮氨酸（C6N)赖氨酸（C6N2)ADP(C7N2)色氨酸酪氨酸（C9N)(C11N2)苯丙氨酸（C9N)组氨酸（C6N3)各种氨基酸的生物合成途径葡萄糖丙糖丙酮酸乙酸草酰乙酸柠檬酸酮戊二酸谷氨酸次生代谢产物CO2(C4)(C6)(C5)氨基糖苷类抗生素（糖苷部分）次生代谢产物丝氨酸甘氨酸（C3N)(C2N)缬氨酸（C5N)次生代谢产物生物甲基化甲羟戊酸（C4)IPP（C5)萜类甾体天冬氨酸（C4N)次生代谢产物丙氨酸（C3N)丙二酸（C3)脂肪酸聚酮莽草酸（C7)丁糖戊糖核糖次生代谢产物次生代谢产物核苷类抗生素初生代谢的合成过程从初生代谢从初生代谢到次生代谢到次生代谢微生物转化微生物转

23、化 http:/ 固体发酵固体发酵 厌氧发酵厌氧发酵 需氧发酵需氧发酵 兼性厌氧发酵兼性厌氧发酵 液体发酵（包括液体深层发酵）液体发酵（包括液体深层发酵） 按培养基的物理性状按培养基的物理性状 浅盘固体发酵浅盘固体发酵 深层固体发酵（机械通风制曲）深层固体发酵（机械通风制曲） 按微生物对氧的不同需求按微生物对氧的不同需求http:/ 用作种子扩大培养及发酵生产的各种培用作种子扩大培养及发酵生产的各种培 养基的配制；养基的配制；2. 培养基、发酵罐及其附属设备的消毒灭培养基、发酵罐及其附属设备的消毒灭菌；菌；3. 扩大培养出有活性的适量纯种，以一定扩大培养出有活性的适量纯种，以一定比比 例接种入

24、发酵罐中；例接种入发酵罐中；http:/ 控制最适发酵条件使微生物生长并形成控制最适发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物；大量的代谢产物；5. 将产物提取并精制，以得到合格的产品；将产物提取并精制，以得到合格的产品；6. 回收或处理发酵过程中所产生的三废物回收或处理发酵过程中所产生的三废物质。质。http:/ n采用发酵技术进行高等动植物细胞培养，具有诱人前景。采用发酵技术进行高等动植物细胞培养，具有诱人前景。n 不断开发和采用大型节能高效的发酵装置，不断开发和采用大型节能高效的发酵装置，n 计算机自动控制将成为发酵生产控制的主要手段。计算机自动控制将成为发酵生产控制的主要手段。http:

25、/ http:/ 铁四局宿舍里锈断的铁护栏铁四局宿舍里锈断的铁护栏 阳逻汽渡职工戴口罩上班阳逻汽渡职工戴口罩上班 清洁生产清洁生产n按照联合国环境规划署按照联合国环境规划署（UNEP）的定义：的定义：“清洁生产清洁生产是一种新的创造性的思想，该思想将整体预防的环境是一种新的创造性的思想，该思想将整体预防的环境战略持续应用于生产过程、产品和服务中，以增加生战略持续应用于生产过程、产品和服务中，以增加生态效益和减少人类及环境的风险。对生产过程，要求态效益和减少人类及环境的风险。对生产过程，要求节约原材料和能源，淘汰有毒原材料，减降所有废弃节约原材料和能源，淘汰有毒原材料，减降所有废弃物的数量和毒性

26、；对产品，要求减少从原材料提炼到物的数量和毒性；对产品，要求减少从原材料提炼到产品最终处置的全生命周期的不利影响；对服务，要产品最终处置的全生命周期的不利影响；对服务，要求将环境因素纳入设计和所提供的服务中。求将环境因素纳入设计和所提供的服务中。”http:/ 生物能源：生物制氢、生物制沼气生物能源：生物制氢、生物制沼气 生物饲料生物饲料 生物肥料生物肥料 http:/ 生物工程的桥梁，生物科学与技术生物工程的桥梁，生物科学与技术 成果的推广应用离不开发酵工程！成果的推广应用离不开发酵工程！ 过量运动后肌肉会有酸痛感，运动后肌肉会有酸痛感，就是因为肌体在缺氧状态下进就是因为肌体在缺氧状态下进行

27、糖酵解产生了乳酸等行糖酵解产生了乳酸等n高等生物（动物、植物和好气性微生物）长期进行糖酵解（发酵）危害很大：n由于能量不足加速了底物的利用导致能量物质枯竭n产生大量有毒的底物不完全氧化的中间体：酒精、乳酸等n甚至导致局部细胞坏死或整体死亡 人类脑缺氧非常危险、长期剧烈运动有损健康、提倡有氧运动微生物发酵制药第一节 概述利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。微生物发酵制药的定义1、微生物菌体的发酵SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）生物防

28、治制剂（如苏云金杆菌）活性乳制剂细胞的生长与产物的积累成平行关系，生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段微生物发酵类型2、微生物酶发酵各种酶制剂糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等天冬酰胺酶： 抗癌纳豆激酶、链激酶： 治疗血栓青霉素酰化酶：青霉素生产需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。3、微生物代谢产物发酵u初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累u次级代谢产物：与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等

29、结构常较复杂对环境条件敏感4、微生物转化发酵利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链等。反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性。如：如： 甾体转化：环戊烷多氢菲核的化合物甾体转化：环戊烷多氢菲核的化合物可的松（可的松（Cortisone）药用发酵产品分类生物来源作用对象作用机制化学结构细菌真菌放线菌抗菌药抗肿瘤药抗病毒药除草剂酶抑制剂免疫调节剂抑制细胞壁合成药影响细胞膜功能药干扰蛋白质合成药抑制核酸合成药抑制生物能量反应药抗生素维生素氨基酸核苷酸甾体激素酶及酶抑制剂发酵工程制药的特点n微生物菌种选育获得高

30、产n发酵的理论产量存在约10%的变量n发酵过程常温常压，操作条件温和n纯种培养、无菌条件n生产过程是以生物体的自动调节方式进行的n分子水平生产，定向发酵、突变、杂交等手段n投资少、见效快发展趋势n利用DNA重组技术和细胞工程技术的发展、新的工程菌和新型微生物的开发n新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、白介素促红细胞生成素等；n新型菌体制剂和疫苗。红细胞生成素红细胞生成素 ( 治疗贫血治疗贫血) 生长激素生长激素 ( 促进生长促进生长) 胰岛素胰岛素 (治疗糖尿病治疗糖尿病) 干扰素干扰素 (抗病毒、抗肿瘤抗病毒、抗肿瘤) 第二节 发酵制药中的微生物常见的制药用微生物n细菌n放线菌n真菌细

31、菌之大肠杆菌属(Escherichia coli)n生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物n基因工程的载体细菌之短杆菌属(Brevibacterium)n维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium)生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)n生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用于甾体转化等。细菌之假单胞菌属 (Pseudomonas)n生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类；n进行类固醇

32、（甾体）转化；n有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。细菌之乳酸杆菌属 (Lactobacillus)n生产抗癌类药物放线菌n抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。放线菌之链霉菌属 ( Streptomyces )灰色链霉菌(Streptomyces griseus) 产链霉素金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens) 产金霉素红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 产红霉素龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus) 产土霉素放线菌之诺卡氏菌属 (Norcadia)n生产利福霉素、蚊霉素等放线菌之小单胞菌属 (Micro

33、monospora)n多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echinospora)产庆大霉素。放线菌之游动放线菌属 （Actinoplanes）n典型代表：济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinanesisn) 产创新霉素(creatmycin；1964)真菌之根霉属(Rhizopus)n生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。真菌之曲霉属(Aspergillus)n生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。真菌之青霉属(Penicillum)n产黄青霉(Penicillum chrysogenum) 生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸真菌之

34、头孢霉菌属(Cephalosporium)n产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、n顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium) 都生产头孢菌素C真菌之酵母菌属(Saccharomyces)u啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)：生产啤酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等。u红酵母 (Rhodotorula)：-胡萝卜素u棉病针孢酵母(Nematspora gossypii)：核黄素真菌之其它u牛肝菌属：含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺膘呤、胆碱和腐胺等生物碱。u灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽

35、、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。发酵菌种的选育要求生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素发酵菌种的选育方法从自然界中获得新菌种诱变育种杂交育种原生质体融合基因工程从自然界中获得新菌种u土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端环境等u基本程序：n采样预处理富集培养筛选鉴定野生型

36、菌株诱变育种物理或化学方法诱发突变物理诱变剂：紫外线、X-射线、-射线等化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等u杂交育种杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换u原生质体融合育种原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质的交换u基因工程育种基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，技术含量高，应用面广菌种保藏(Culture conservation)u目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。菌种保藏三要素典型菌种的优良纯种的休眠体；创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）；尽可能采用多种不同的手段

37、保藏同一菌株。菌种保藏的常用方法斜面低温保藏法石蜡油封存法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法方法名称主要特点适用范围保藏期斜面低温保藏法传代培养，4保藏各种微生物的短期保藏。 1-6个月石蜡油封存法石蜡油隔绝空气，室温或4保藏各种微生物的中短期保藏，不适用某些能分解烃类的菌种。1-2年砂土管保藏法沙土管作载体，干燥器中抽真空，室温或4保藏产孢子微生物和芽孢细菌的长期保藏，不适用对干燥敏感的微生物1-10年麸皮保藏法麸皮作载体，干燥，4保藏产孢子霉菌和某些放线菌，工厂多采用此法1年甘油悬液保藏法悬浮于10-15%甘油中，需低温冰箱基因工程菌1年/10

38、年冷冻真空干燥保藏法用保护剂制备悬液，快速冻结，减压抽真空，需冻干机各类微生物5-15年液氮超低温保藏法保护剂，超低温（-196），需超低温液氮设备各类微生物15年以上宿主保藏法与培养基混合直接低温保存专性活细胞寄生微生物（如病毒）u菌种保藏机构nnn第三节 发酵设备及消毒灭菌发酵的一般流程发酵的一般流程种子扩大培养种子扩大培养培养基配制培养基配制空气除菌空气除菌培养基灭菌培养基灭菌发酵生产发酵生产下游处理下游处理发酵设备发酵设备发酵设备发酵罐u发酵罐的特点轴封严密，泄漏少能承受一定压力、温度搅拌通风装置保证气液充分混合具有足够的冷却面积死角少，灭菌彻底适宜的径高比（高与直径的比值为2.54）

39、u发酵罐的类型n搅拌釜反应器n鼓泡式反应器n气升式反应器发酵辅助设备u无菌空气系统n无菌空气的要求u灭菌系统、管道、阀门培养基及其灭菌u培养基（medium）u培养基的成分n碳源、氮源、无机盐、前体物、促进剂、抑制剂u培养基的类型n按组成n按状态n按用途u培养基灭菌n空罐灭菌n实罐灭菌n连续灭菌第四节 发酵工程制药的过程与控制种子的扩大培养微生物发酵方式n分批发酵n补料分批发酵n半连续发酵n连续发酵发酵过程中的中间分析项目产物产量pH糖氨基氮菌丝形态发酵过程的影响因素及控制菌体浓度营养物质温度pH溶氧泡沫染菌发酵终点的判断u菌体浓度n在适合的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系。特别

40、是初级代谢产物。n菌体浓度过低，产物产率下降。n菌体浓度过高，产生其他影响。n措施：调节培养基中的营养物质的浓度。u营养物质n碳源n氮源n磷酸盐：生长亚适量浓度n补料：半饥饿状态u温度n考虑菌种及生长阶段n综合考虑其他培养条件n考虑菌种生长情况n发酵热u发酵终点的判断n提高产物的产量和经济效益n降低生产成本主要指标与中间分析项目雷同食用药用菌的深层发酵食用药用菌的深层发酵 n食用菌发酵生产是一门新兴的技术，食用菌发酵生产是一门新兴的技术，是借鉴现代抗生素液体发酵工艺生产是借鉴现代抗生素液体发酵工艺生产的菌丝体或兼用发酵液，在很大程度的菌丝体或兼用发酵液，在很大程度上解决了食用菌野生资源不足和人

41、工上解决了食用菌野生资源不足和人工栽培难以形成子实体的问题；栽培难以形成子实体的问题；n目前我国已建立起一些以发酵生产药目前我国已建立起一些以发酵生产药用真菌的专业化药厂。用真菌的专业化药厂。 第一节第一节 食用菌固体发酵食用菌固体发酵l固体发酵是中国特有的药用菌生产工艺，固体发酵是中国特有的药用菌生产工艺，早在早在1500年前中国已经采用固体发酵工年前中国已经采用固体发酵工业制成著名中药神曲，以健胃消食等功业制成著名中药神曲，以健胃消食等功效沿用至今。效沿用至今。l20世纪世纪70年代亮菌、猴头、安洛小皮伞、年代亮菌、猴头、安洛小皮伞、云芝等品种相继采用了固体发酵生产工云芝等品种相继采用了固

42、体发酵生产工艺。艺。l固体发酵设备简单、原料来源广、方法固体发酵设备简单、原料来源广、方法简便、经济有效，但机械化、自动化程简便、经济有效，但机械化、自动化程度低，不能适应工业化大生产的要求。度低，不能适应工业化大生产的要求。 一、固体发酵与固体栽培的区别：一、固体发酵与固体栽培的区别：l固体培养固体培养是真菌在农副产品组成的培是真菌在农副产品组成的培养料上摄取营养而生长，最终取得子养料上摄取营养而生长，最终取得子实体或营养体（菌核），也就是菌丝实体或营养体（菌核），也就是菌丝体可与已基本耗尽营养的培养料渣滓体可与已基本耗尽营养的培养料渣滓相分离。相分离。l固体发酵固体发酵是药用真菌在有机物组

43、成的是药用真菌在有机物组成的固体发酵基质上生长并合成新成分；固体发酵基质上生长并合成新成分；菌体不能也不应当与含有大量次生物菌体不能也不应当与含有大量次生物质的已经发酵的基质相分离，这种以质的已经发酵的基质相分离，这种以得到菌质为目的的生产工艺称为固体得到菌质为目的的生产工艺称为固体发酵。发酵。一方面菌丝体（胞内）可能含有活性成一方面菌丝体（胞内）可能含有活性成分；另一方面所产生的各种次生物质也分；另一方面所产生的各种次生物质也累积于体外已被分解的基质中（胞外），累积于体外已被分解的基质中（胞外），其中也可能存在活性成分；其中也可能存在活性成分；经过发酵的基质中含有大量菌丝体和次经过发酵的基质

44、中含有大量菌丝体和次生物质，称为生物质，称为菌质菌质。二、固体发酵的构成二、固体发酵的构成菌种、基质和发酵条件菌种、基质和发酵条件（一）菌种（一）菌种l不同菌种所具有的酶与代谢类型有所不不同菌种所具有的酶与代谢类型有所不同，因此应根据治疗疾病对象，选择或同，因此应根据治疗疾病对象，选择或筛选有效菌种中特定的菌株；筛选有效菌种中特定的菌株；l一旦研究其相应生产工艺经试验确认其一旦研究其相应生产工艺经试验确认其功效或已正式批准为新药后，不能再任功效或已正式批准为新药后，不能再任意变更该菌株的生产工艺，否则必须重意变更该菌株的生产工艺，否则必须重新经过各种有关试验。新经过各种有关试验。（二）基质：能提供被真菌分解利用的各种营（二）基质：能提供被真菌分解利用的各种营养，及其代谢活动合成有关成分所需要的某养，及其代谢活动合成有关成分所需要的某些原材料，按其性质可分为两类。些原材料，按其性质可分为两类。l1、营养基质：、营养基质：l2、药材基质：在发酵组合中合理地选用药材、药