无菌、微生物限度、细菌内毒素方法学验证

1、l省药品检验所l1、无菌检查方法学验证关键点及常见问题l2、微生物限度检查方法学验证关键点及常见问题l3、细菌内毒素检查方法学验证关键点及常见问题相关规定无菌检查验证的关键点验证中常见的问题 一、相关规定 药品无菌和微生物限度检查方法验证作为中国药典2005年版增订的一项重要内容对促进我国药品微生物检验的标准化是十分重要和必要的，执行近一年以来的情况表明，方法验证是促使我国药品无菌和微生物限度检查方法更加合理、科学和严谨的重要途径。（2006年6月全国会议纪要） 中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重视，从各方面支持这项工作长期持续发展。 实际工作中

2、，药品生产、研发企业和各级药检所在工作中都存在很多困难和问题。l各药品检验所：l 根据国食监注2005234号“关于颁布和执行中国药典2005年版有关事宜的通知”规定，中国药典7月1日起开始执行，各药品检验所在执行“微生物限度检查法”和“无菌检查法”过程中遇到了一些问题，为保证中国药典2005年版的顺利实施，现就有关问题说明如下：l 1“微生物限度检查”和“无菌检查”是药品安全性检查的重要项目。虽然近几版中国药典均收载有“微生物限度检查法”和“无菌检查法”，但在如何保证检验方法的科学性和检验结果的准确性方面与国外药典相比仍具有一定差距，其关键是中国药典未强调对检验方法进行必要的方法验证。为此，

3、药典会设立专项科研课题，对2005年版中国药典的“微生物限度检查法”和“无菌检查法”增加验证试验的必要性进行研讨。根据研究结果，2005年版中国药典规定当进行药品的“微生物限度检查”或“无菌检查”时应进行方法验证。l验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定方法及确定的检测系统是否适用于该供试品的检验，即只有通过方法验证，才能确定供试品的检验条件和方法，保证“微生物限度检查”或“无菌检查”方法的科学性和检验结果的准确性。 l2不同企业生产的相同品种，特别是中成药，因原料来源、工艺、辅料的不同，药品可能表现出不同的抑菌特性；同一个企业生产的相同品种，因原料来

4、源不同、工艺改变或不同实验室等原因，也可能导致检测结果的差异。因此，不同企业生产的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌检查”时，其具体试验方法如冲洗量等不能简单照搬，需通过验证试验核实该试验方法和检测系统是否适宜。 l3目前各药检所涉及的检验工作可分为三类：注册检验（包括进口注册和新药注册）、监督抽验和进口检验。考虑到各检验性质的差异，各口岸所在进行进口复核及进口检验时，应请企业提供方法验证材料或详细的SOP资料进行审核；各口岸所完成复核时应在修订的进口注册标准中明确“微生物限度检查”或“无菌检查”的关键操作点（如供试品的处理方法等）及试验方法（如平皿法、薄膜过滤法、直接接种法等），并在复核

5、说明中概述验证实验结果，以方便以后的进口检验。l对国内新药的注册检验，也应请企业提供方法验证资料，如果企业提供不出方法学验证资料，根据药品注册管理办法，应在审核意见中明确指出“方法学未经验证，无法检验”，并建议企业重新建立“微生物限度检查”或“无菌检查”方法。监督抽验药品，由于2005年版以前历版中国药典未强调进行方法学验证，故各药检所目前在进行具体品种检验时难度较大，故也应请企业提供方法验证资料并进行审核，未经过方法学验证的“微生物限度检查”或“无菌检查”结果，决不能给出“符合2005年版中国药典的规定”的结论。 l 国家药典委员会 l 中国药品生物制品检定所l 二00五年十月十一日 验证的

6、目的: 验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。 二、无菌检查验证的关键点验证的类型前验证: 建立药品的微生物限度检查法和无菌检查法时（当建立药品的无菌或微生物限度检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查）。 再验证: 修订的检验方法;供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时 ;定期的方法验证（若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证） 。l金黄色葡萄萄球菌 (Staphylococcus

7、 aureus) CMCC(B) 26 003l铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 *拟修订为大肠埃希菌l枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) CMCC(B) 63 501l生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64 941l白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F) 98 001l黑曲霉 (Asperglllus niger) CMCC(F) 98 003菌种的要求： 传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，

8、以保证试验菌株的生物学特性。加菌量:100cfu。 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每试验菌应逐一进行验证。验证方法： 直接接种法 薄膜过滤法l将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培养35天。各试验菌同法操作。l取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法

9、培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接人规定量的供试品，另1管作为对照，按规定的温度培养35天。 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。增加冲洗量增加培养基的用量使用中和剂或灭活剂： -内酰胺酶、对氨基苯甲酸 更换滤膜品种注意：重新进行方法验证。总的要求：详细、严谨、可操作性l供试品信息l检验数量和检验量：按照无菌检

10、查的量确定l供试品处理、供试品溶液的制备l检验方法（选择直接接种法说明理由）l实验用菌 代数、稀释级、计数l检验条件：主要是冲洗条件（冲洗液、冲洗次数、量，必要时说明滤膜材质、仪器、泵速等条件）。l需要中和、酶处理等特殊处理方法的需说明l逐日记录各菌的生长情况l采用的方法：薄膜过滤法/直接接种法l关键实验点：如冲洗条件、中和、酶处理等因素l按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，而验证试验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌的生长的影响，可以与对照滤器比较而作出判断，所以验证试验中加菌时机与方式只要与对照一致即可（中检所讲义）。l普通滤膜l有机膜l低吸附滤膜l1.根据供试品及其溶剂的特性选择

11、滤膜材质。l2.应保证滤膜在过滤前后的完整性。l3.采用全封闭过滤器注意观察膜的状态，某些油性供试品或采用蓖麻油等作为溶媒的供试品可以损伤普通滤膜。l培养观察时间 验证试验：按规定的温度培养35天 无菌检查：阳性对照培养4872h应生长良好 问题：生长缓慢的判断标准？l敏感菌株与阳性对照菌 阳性对照菌不是验证试验选定的敏感菌株 问题：降低了阳性对照菌的意义，实际工作中抑制枯草芽孢杆菌的样品很多（敏感菌株），但阳性对照只能选择金黄色葡萄球菌。l供试品无菌检查中规定“抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌”，但在方法学验证中所用菌株没有大肠埃希菌。l解决措施：抗革兰阴性菌的抗菌药物进行方法学

12、验证时增加大肠埃希菌。l即将修订，将铜绿假单胞菌修订为大肠埃希菌。修订后按新方法执行。l薄膜过滤法和直接接种法l如：一般供试品（无特殊说明）采用直接接种法某厂家胸腺五肽注射液为普通注射剂，完全可以采用薄膜过滤法，生产单位进行的无菌检查验证法为直接接种法。l也有的厂家把两种方法的验证都写上，结论中也没有说明采用那种方法。lCP2005：无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法，只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。l修订：改为薄膜过滤法重新进行验证。l进行供试品无菌检查时，所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同。l结合无菌检查检验数量和检验量确定验证时取样量。l如同时进行无菌检查一定要按照规定

13、的检验数量和检验量取样。l生产单位进行方法学验证时检验数量要按照表1 批出厂产品最少检验数量。检验量（每只样品接入每种培养基的最少样品量）同上市抽验品种。l无菌检查法中规定：只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。因此，验证试验中检验量就多不就少，如10ml注射液，虽然每个滤膜每容器取2ml也符合药典规定，10支分配至3个或更多滤筒也可，但建议取15支分3个滤筒（贵重药品和抗生素品种可灵活掌握，但不能低于最少量）。l对检验数量和检验量的把握应考虑便于实际操作，比如处理100ml/袋的样品，取9袋样品一次分配到一组三联滤器，检验数量大于药典规定的6个，但检验量似乎不符合药典规定的每袋

14、样品取半量检验的规定，仅为1/3，但根据药典检验量即为一次试验所用供试品总量（g或ml）的解释，这与先将6袋分配两个滤筒，再将剩下3袋抽入一个滤筒作为样定对照的方法一样，却更节省时间。（中检所讲义）l有些厂家提供的验证资料中，对非抑菌性供试品也采用大量的冲洗，100ml/次*10次/膜，增加了出现误差的机会。l1. 对膜的损伤l2. 检验方法繁琐，大大增加检验人员的工作量（检验要按照已经验证的方法进行）l3. 验证试验方法选择总的原则是由易到难l冲洗不一定为100ml/次，可少量多次，如50ml/次，注意充分振摇。l对于抑菌性较强的供试品，可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤，以减少膜的吸附, 减

15、少冲洗量。如：抗生素品种取规定量，混合至含适量稀释液（如500ml等)的无菌容器中，然后再过滤。l对于抑菌性较强的注射用无菌粉末或固体原料，一定要充分溶解、混合均匀。l抗菌药可以根据其抗菌谱选择敏感菌先进行预试验，找到合适的条件再进行其他菌的实验。l采用开放式薄膜过滤器：滤膜分成几份与取样量、冲洗条件的选择有关，建议尽量与无菌检查法一致（最常见为3等分）。l如：某产品验证资料内容“将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入小于100CFU的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养集中，或将培养基加至滤筒中”。l验证的目的是为了“照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查

16、”，方法确立后，以后该产品就可以采用该方法进行检验。l修订：应记录取样量、（稀释方法）、冲洗液、冲洗量（冲洗条件）等。2006年6月山东省药品检验所36l规格：100ml:吡20g与氯0.9gl1. 方法选择：薄膜过滤法l2. 确定检品取样量（讲义中按上市抽验品种的检验数量为例）l规定：每支样品接入每管培养基的最少样品量：半量，最少检验数量：6l确定：每菌（6*1/2）瓶l 3联过滤器9瓶、2联过滤器6瓶l3. 实验条件选择 冲洗：无 菌名 代数 稀释级 计数结果铜绿假单胞菌 3 10-6 85枯草芽孢杆菌 3 10-7 65金黄色葡萄球菌 3 10-6 92生孢梭菌 3 10-6 75白色念

17、珠菌 3 10-6 67黑曲霉菌 3 10-4 55结果观察12345金葡阳性对照+供试品+绿脓阳性对照+供试品+生孢阳性对照+供试品+枯草阳性对照+供试品+白念阳性对照-+供试品-+黑曲阳性对照-+供试品-+l说明本品在该检验条件下无抑菌作用，或抑菌作用可以忽略不计。l本品可以采用薄膜过滤法（不冲洗）进行无菌检查。阳性对照菌选用金黄色葡萄球菌。l规格：5ml:1gl确定样品量：根据供试品的规格和检验目的l每支样品接入每管培养基的最少样品量：2mll最少检验数量：10l每菌（10*2ml）（建议全部内容物滤过）l3联过滤器15支、2联过滤器10支l方法选择：薄膜过滤法l冲洗：无（或稍加冲洗）结

18、果观察12345金葡阳性对照+供试品+绿脓阳性对照+供试品+生孢阳性对照+供试品+枯草阳性对照+供试品-+白念阳性对照-+供试品-+黑曲阳性对照-+供试品-+l说明本品在该检验条件下无抑菌作用，或抑菌作用可以忽略不计。l本品可以采用薄膜过滤法（不冲洗）进行无菌检查。阳性对照菌选用金黄色葡萄球菌。l我们进行的其他厂家的维生素C注射液（2ml:1g）存在抑菌作用。l规格：20mgl取样量：每菌 10 瓶l 3联过滤器30瓶l 2联过滤器20瓶l冲洗：无12345d金葡阳性对照+供试品+铜绿阳性对照+供试品+生孢阳性对照+供试品-枯草阳性对照+供试品+白念阳性对照-+供试品-+黑曲阳性对照-+供试品

19、-+l说明本品在该检验条件下对枯草芽孢杆菌有抑制作用。l需采用进一步处理（加大冲洗量）以消除抑菌性其他菌可以不做：冲洗：200ml/膜（100ml*2)结果：12345d阳性对照+供试品+l说明本品在该检验条件下抑菌作用可以消除。l本品可以采用薄膜过滤法（细菌冲洗200ml/膜）进行无菌检查。敏感菌株为枯草芽孢杆菌。l眼用液体制剂：制剂通则中规定，眼用液体制剂微生物限度检查法为“除另有规定外，按薄膜过滤法或直接接种法检查，至少从2支供试品抽取规定量（每种培养基各接种2支，每支1ml），直接或处理后接种于硫乙醇流体培养基及改良马丁培养基中。培养7天，不得有菌生长。若有菌生长，应重新取2倍量供试品

20、，分别依法复试，各管均不得有菌生长。”l眼用液体制剂微生物限度检查的方法验证同无菌检查方法学验证。l一、附录 90 页，无菌检查法中的 “ 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 ” 修订为 “ 大肠埃希菌 ( Escherichia coli ) CMCC(B) 44 102 ” ； “ 铜绿假单胞菌 ” 修订为 “ 大肠埃希菌 ” l二、附录 90 页，灵敏度检查 菌液制备 第 10 行 “ （用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细管） ” 订正为 “ （用管口塞有适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细管）

21、 ”n三、附录 90 页，方法验证试验 n1 第 1 5 行 n“ 当建立药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若该药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。n验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作，对每一试验菌应逐一进行验证。 ” l增修订为l l供试品的无菌检查应采用验证的方法，无菌检查 方法 的验证是确认供试品在所采用的无菌检查方法和检验条件下无抑菌作用 , 以保证所污染的微生物能充分检出。若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。 l验证时，按 “ 供试品无菌检查 ” 的规定及下列要求进行。 l方法 验

22、证试验的试验菌为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 生孢梭菌 、白色念珠菌和黑曲霉。上市产品监督检验进行方法验证时试验菌至少应选用金黄色葡萄球菌（ 抗革兰阴性菌为主的供试品 选用大肠埃希菌）、 生孢梭菌 和白色念珠菌。对每一试验菌应逐一进行验证。l2 薄膜过滤法 第 1 行 “ 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤， ” l订正为 “ 取每种培养基规定的供试品接种量按薄膜过滤法过滤， ” l3 直接接种法 第 5 行 “ 。其中 1 管接入规定量的供试品， ” l订正为 “ 。其中 1 管接入每支培养基规定的供试品， ” l四、附录 91 页，供试品的无菌检查 l阳性对照 第 6 行 删除

23、 “ （ 大肠 埃希 菌 的 菌液制备 同 培养基的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌 ） ” l五、附录 91 页，薄膜过滤法 l水溶液供试品 第 6 行 “ ，取出滤膜，将其剪成 3 等份， ” l订正为 “ ，取出滤膜，将其分成 3 等份， ” l六、附录 93 页，表 2 l第 9 行 “100V 500 ” 订正为 “100V 500 ” l第 10 行 “V 500 ” 订正为 “ V 500 ” l附录 68 页，无菌检查法中的“铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 ” l修订为“大肠埃希菌 (Escherichia coli)

24、CMCC(B) 44 102 ”；“铜绿假单胞菌”修订为“大肠埃希菌” l附录 68 页，灵敏度检查 l菌液制备 第 10 行 “（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细管）”订正为“（用管口塞有适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细管）” n附录 68 页，方法验证试验 n1 、 第 1 5 行 n当建立药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。n验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作，对每一试验菌应逐一进行验证。 ” l增修订为 l“供试品的无菌检查应

25、采用验证的方法，无菌检查方法的验证是确认供试品在所采用的无菌检查方法和检验条件下无抑菌作用 , 以保证所污染的微生物能充分检出。若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。验证时，按“供试品无菌检查”的规定及下列要求进行。 l方法验证试验的试验菌为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。上市产品监督检验进行方法验证时的试验菌至少应选用金黄色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌。对每一试验菌应逐一进行验证。” l2 、薄膜过滤法 第 1 行 “将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，” l订正为“取每种培养基规定的供试品接种量按薄膜过滤法过滤，” l3 、 直接接

26、种法 第 5 行 “。其中 1 管接入规定量的供试品，” l订正为“。其中 1 管接入每支培养基规定的供试品，” l附录 69 页，薄膜过滤法 l水溶液供试品 第 6 行“，取出滤膜，将其剪成 3 等份， ” l订正为“，取出滤膜，将其分成 3 等份， ” 附录 69 页 直接接种法 l删除“一次性使用含药产品供试品 取规定量，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。” l l附录 70 页，表 2 l第 9 行 “ 100 V 500 ” 订正为“ 100 V 500 ” l第 10 行 “ V 500 ” 订正为“ V 500 ” l附录 70 页，表 3 l删除 第 7 行“一次性使用含

27、药产品 10 ” l为了进一步理顺方法验证和目前监督抽验工作的关系，讨论认为应对以建立科学合理的检验方法为目的的方法验证试验和对监督抽验工作中所采用抽验方法的有效性的确认实验加以区分，具体有如下三点：l1. 对于注册检验，如果没有合理的检验方法，应严格按照药典要求，通过完整的验证试验建立标准检验方法及SOP，所建立的标准检验方法中应确定具体的实验方法，如无菌检查中的薄膜过滤法和直接接种法，微生物限度检查中的平皿法和薄膜过滤法。标准检验方法中应有关键的实验要点，如无菌检查薄膜过滤法的冲洗条件；微生物限度检查平皿法的供试品稀释程度（0.5ml/皿、0.2ml/皿应注明）。对有抗菌作用的样品应通过验

28、证试验确定一株敏感菌株，以供采纳该检验方法时进行方法的确认使用。l2. 对注册检验中已有验证资料的方法进行复核时，应根据企业提供材料的情况，结合药检所掌握的情况，通过分析判断、适当的实验验证等，保证验证资料中检验方法的合理、可靠和科学。l3. 对于目前比较突出的已上市品种的监督抽验问题，原则上应向被抽验品种的生产单位索取方法验证资料，如资料中已确定有敏感菌株，可以该菌株为阳性对照确认或调整检验方法。如果没有及时获得验证资料，或者验证资料中没有确定敏感菌株，抗生素及抗菌品种可根据其抗菌谱确立一株敏感菌株进行方法确认试验，其他品种可从药典验证菌株中选取一到两株菌快速确立检验方法，一般细菌选择枯草芽

29、孢杆菌或金黄色葡萄球菌，真菌选择白色念珠菌，或其他有可靠依据的敏感菌株，方法确认实验可和检验同步进行。2006年6月山东省药品检验所65概述微生物检查验证的关键点验证中常见的问题l1.概述l2.样品前处理方法及验证l3.菌落计数方法及验证l4.控制菌检查方法验证l5.总结并举例l微生物限度检查法验证的目的：确认所采用的方法是否适合于供试品的微生物限度检查。l验证的内容：包括准确性(回收率)、专属性。l验证的类型：前验证(建立微生物限度检查法时的验证)和再验证(修订检验方法后、供试品组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时、定期的方法验证)。l根据检查方法的不同分为： 细菌、霉菌、酵母菌计数方

30、法的验证和控制菌检查法的验证。l验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。l某些供试品含有抗微生物物质，使供试品中的活微生物的生长被抑制，不能按常规方法检验，必须以适当的方法消除或抑制供试品中抗微生物物质的活性后，活微生物才能生长，得以检出。通过消除或抑制供试品中抗微生物物质的活性来检测微生物的方法，应通过验证，以确定所用检测方法测定结果的可信度。l验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判断没有影响。l前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在验证的范围内。已有标准规程（SOP）和充足实验证明的前处理方法可以直接采用，但出现

31、疑问应进一步研究提高。 供试品中抗菌活性的去除供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点重点l稀释法降低供试品的相对浓度l薄膜法利用体积差异分离l中和法利用化学（生物）专属性灭活l离心法利用沉降系数差异分离 各方法组合运用，会达到更好效果！各方法组合运用，会达到更好效果！l样品：首先应是合格的样品。本底微生物太多可以先灭活，但不应因此影响药效。l注意 针对抽验品种本底微生物太高情况，如我们没条件进行灭活处理，可对检品适当稀释后再进行验证。（经请示专业委员会认可） 指供试品一次检验的用量。一般为10g 或 10ml; 化学药膜剂为100cm2。l贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于3g）。l检查

32、沙门菌的供试品其检验量改为10g或10ml。l验证实验按检验量执行。 l制剂形式多样，决定前处理各异 液体供试品固体、半固体或粘稠液体供试品非水溶性供试品其他l取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。l油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。l可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。l取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其它有效方法混匀，作为供试液。(常规方法）l必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴适当加温使供试品分散均匀。 l方法

33、一 2000版已有方法 （乳化法）l方法二2005版新增方法 （萃取法）l软膏、乳膏剂 先将已备妥灭菌的含司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的混合物融化，待冷至45时，加入供试品5g（或5ml），立即用玻璃棒搅拌均匀，分次少量慢慢加入45的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20供试液。l油剂 取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯80 58ml，摇匀，再加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。 l栓剂 称取供试品10g，加适量pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，置45水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯80 5

34、8ml，振摇使之乳化，再加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，摇匀。 l眼膏剂 取供试品10g，加至20ml无菌十四烷酸异丙酯，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇510min，静置，待油水明显分层，取其水层作为供试液。 l非水溶性膜剂 化学药膜剂一般取样量为100cm2，置灭菌锥形瓶中，加入适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，于45水浴保温，浸泡，振摇，以供试品浸液作为供试液。中药膜剂取50 cm2，剪碎，加入适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（通常1 cm2加1ml或2ml），浸泡，振摇

35、，以供试品浸液作为供试液。 l取供试品10g，肠溶制剂加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，结肠溶制剂加pH7.6无菌磷酸盐缓冲液至100ml，置45水浴中，振摇，使溶解，作为供试液。 l取规定量供试品，置冰箱冰冻室内约1h，取出，速消毒供试品容器的开启部位周围，用无菌钢锥在容器上消毒部位钻一小孔，在室温轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1：10的供试液。 l取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇23m

36、in，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30min）。l以上供试品如吸水膨胀，或黏度过高，可增加稀释级的量，制成1：201：100供试液l制备供试液所用的乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应验证，在该检验条件无抗菌作用。l目标是使不便于取样的供试品分散均匀！ l在建立供试品的细菌、霉菌和酵母菌计数方法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验，以判断供试品是否具有抗菌活性的实验方法。l细菌计数方法验证用菌株： 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌l霉菌及酵母菌计数方法验证 白色念珠菌、黑曲霉l取

37、培养物用无菌0.9%氯化钠溶液稀释成含 50100cfu/ml的菌液。 l验证实验应独立平行进行3次，分别计算各次试验菌的回收率。l1)试验组l2)菌液组l3)稀释剂对照组l4)供试品对照组l平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。l薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。l测定所加的试验菌数l若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对

38、照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml 供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。l取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。l试验组的菌回收率 l稀释剂对照组的菌回收率 l在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于70%。l若试验组的菌回收率均不低于70%，按此该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。l若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性

39、，并重新验证。l供试液的常规制备方法： 10g(ml)样品加pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml, 制成1：10供试液l试验组：取1：10供试液1ml和菌液1ml （50100cfu试验菌），分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。l菌液组：取菌液1ml注入平皿中，倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。l供试品对照组：取1：10供试液1ml注入平皿中，倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。l计算试验组的菌回收率，若三次平行试验各个试验菌的回收率均不低于70%，按常规法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。

40、若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。 l取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。l1ml供试液可等量分注多个平皿。l培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。l在采用培养基稀释法时，应注意避免在注皿前菌液和供试液直接接触l实验组（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均应加1ml菌液。l10g(ml)样品加pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml, 制成1：10供试液l供试液制备方法为常规法，无需进行稀释剂对照组的实验l试验组：1m

41、l 1:10的供试液等量分注5皿，平行2ml，共10皿，每皿各加1ml 菌液。计算每皿平均菌数（A）l供试品组（本底组）：1ml 1:10的供试液等量分注5皿，平行2ml，共10皿。计算每皿平均菌数（B）l菌液组：每皿加入1ml菌液，平行2皿。计算每皿平均菌数（C）l回收率：（A-B）/C*100l计算试验组的菌回收率，若三次平行试验各个试验菌的回收率均不低于70%，按培养基稀释法测定供试品的细菌数（或霉菌及酵母菌数）。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用其他方法，如薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。l1：10供试液的制备：10g样品加pH

42、 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，低速离心（500rpm离5分钟）去渣，取上清10ml高速离心（3000rpm离20分钟），离心后不要震摇离心管（一般用10 ml带有刻度的离心管），用注射器或吸管（注意不要插到2ml刻度以下）吸取上面的8 ml弃去，再加 8 ml稀释液补充到10 ml，混匀。l试验组：取1：10供试液1ml和菌液1ml （50100cfu试验菌），分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。l菌液组：取菌液1ml注入平皿中，倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。l供试品对照组：取1：10供试液1m

43、l注入平皿中，倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。 取含菌稀释液（含菌浓度为50100cfu /ml）代替供试品，经过低速离心后转移含菌稀释液至另一离心管中，高速离心后，用与制备供试液相同的方法吸取离心管上层8ml液体，再加 8 ml稀释液补充到10 ml，混匀。取此液体1ml注入平皿中，倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。 要保证稀释剂对照组的操作过程与实验组完全相同！l操作过程不小心极易造成菌体损失，使回收率降低。l某些沉降系数低的细菌可能被漏检，而验证试验无法对其验证。l对某些抑菌性不强的样品建议采用培养基稀释法。l供试品对照组：取规定量供试

44、品，相当于供试品1g或1ml，如1：10供试液取10ml, 过滤，冲洗（确定冲洗量），取出滤膜，菌液面朝上贴在对应培养基上，按薄膜过滤法测定其菌数。l试验组：过滤量，冲洗量同供试品对照组，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。l菌液组：取菌液1ml注入平皿中，倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。l稀释剂对照组：稀释液+1ml菌液混匀，过滤，冲洗（冲洗量及冲洗方法同试验组） ，取出滤膜，按薄膜过滤法测定其菌数。 l如回收率仍达不到70%，首先考虑增加冲洗量，少量多次冲洗，不局限于药典所说的每次冲洗100ml。l可将待过滤的样品稀

45、释至大量稀释液中（如: 500ml, 多少量需在验证资料中注明）再进行过滤，这样可以减少膜对样品抑菌成分的吸附。l冲洗速度不易过快，冲洗量不易过大。l可与离心沉淀集菌法，中和法等方法联用。 l-内酰胺类抗生素 -内酰胺酶l奎诺酮类抗生素 0.1mol/L MnSO4 l当最低稀释级的供试液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法后试验菌的回收率还无法达到计数方法验证的要求时，根据供试品的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，可采用高一稀释级的供试液重新进行回收率的测定。若试验菌的回收率符合计数方法验证的要求，那么，进行供试品细菌计数或霉菌及酵母菌计数时，应以该稀释级供试

46、液作为最低稀释级的供试液 （中国药典2006 增补本拟增订内容）l样品给药途径和类型决定何种控制菌检查验证一般口服制剂验证大肠埃希菌外用制剂验证金葡和铜绿含药材原粉；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂的大肠菌群检查验证 l按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。大肠菌群检查用大肠埃希菌梭菌检查用生孢梭菌。l菌种的要求：不得超过5代。l菌液制备为10100cfu/ml。l取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。l当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。l 设立阴性菌对照组是为了

47、验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组。l阴性对照菌不得检出。 控制菌阴性对照菌株大肠埃希菌金黄色葡萄球菌大肠菌群沙门菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌铜绿假单胞菌梭菌l 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。l验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行l试验组：取1：10供试液1ml及10100cfu大肠埃希菌加入乳糖胆盐发酵管，361培养1824h。l阴性菌对照组：取1：10供试液1ml及10100cfu

48、金黄色葡萄球菌加入乳糖胆盐发酵管，361培养1824h。l大肠菌群在乳糖胆盐发酵管中生长，表现为产酸产气。产酸使培养基颜色发生改变，一般由紫色变为黄色；产气可在倒管中出现气泡。l如果阴性菌对照组发酵管未见产酸产气，试验组发酵管产酸产气，按此法进行供试品的大肠菌群检查。l进行大肠菌群检查时，应取乳糖胆盐发酵管3支，分别加入1：10供试液1ml，1:100供试液1ml，1：1000供试液1ml。而在进行大肠菌群检查法的验证时，无需对此3管的检查一一验证，只验证加最低稀释级供试液的发酵管的检查即可。检查实验过程中的阳性对照也只需加在加1：10供试液的发酵管中。l大肠菌群检查为半定量试验，一般不建议使

49、用离心沉淀集菌法。1.常规法l实验组：取1：10供试液10ml及10100cfu生孢梭菌加入100ml0.1%庖肉培养基，厌氧条件培养。当实验管出现浑浊、产气等现象后，取0.2ml培养物涂布含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板上，厌氧条件培养。l阴性菌对照组：取1：10供试液10ml及10100cfu大肠埃希菌加入100ml0.1%庖肉培养基，厌氧条件培养。当实验管出现浑浊、产气等现象后，取0.2ml培养物涂布含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板上，厌氧条件培养。l 实验组：取1：10供试液10ml薄膜过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入10100cfu生孢梭菌，取出滤膜加入100ml0.1%庖肉培养基中，厌氧

50、条件培养。当实验管出现浑浊、产气等现象后，取0.2ml培养物涂布含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板上，厌氧条件培养。l阴性菌对照组：取1：10供试液10ml薄膜过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入10100cfu大肠埃希菌，取出滤膜加入100ml0.1%庖肉培养基中，厌氧条件培养。当实验管出现浑浊、产气等现象后，取0.2ml培养物涂布含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板上，厌氧条件培养。l如阴性菌对照组培养管未出现浑浊、产气等现象同时试验组培养管产生浑浊，可不进行选择性琼脂培养直接判断可用此供试液制备及梭菌检查方法进行本供试品的梭菌检查 l当阴性对照组选择性平板上无菌落生长，实验组选择性平板上有菌落生长时，可

51、判断可用此供试液制备及梭菌检查方法进行本供试品的梭菌检查。l在进行梭菌检查实验时，应取供试液10ml 2份，其中1份置80保温10分钟后迅速冷却。阳性对照实验方法同方法验证试验组，只做一份即可。如果2份供试液培养管在培养92h内均无浑浊、产气等现象，判供试品未检出梭菌。第一步：常规法第二步：培养基稀释法第三步：薄膜过滤法在计数方法验证时先用常规法对5种实验菌进行预实验，如果某个或某些菌的回收率达不到70%，继续用它验证下一步的实验方法。直到它的回收率达到70%以上。这时再用5种菌进行平行试验。l各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌

52、种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。 l 斜面低温保藏法l 石蜡油封藏法l 砂土管保藏法l 麸皮保藏法l 甘油悬液保藏法l 冷冻真空干燥保藏法l 液氮超低温保藏法l将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。l此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝， 加硅胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4冰箱内保藏。l此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一

53、般可保存12年左右。l又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。l此法适用于各大类微生物。l此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂， 保藏期一般长达515年，存活率高，变异率低，是目前 被广泛采用的一种较理想的保藏方法。l该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设 备。l简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（1

54、96）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。l此法适用于各种微生物菌种的保藏。l此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。l此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。菌种培养基保存条件及时间大肠埃希菌营养琼脂培养基4 6 保存2 3个月金黄色葡萄球菌营养琼脂培养基4 6 保存2 3个月枯草芽孢杆营养琼脂培养基4 6 保存3 6个月铜绿假单胞

55、菌营养琼脂培养基室温沙门菌营养琼脂培养基4 6 保存2 3个月生孢梭菌硫乙醇酸盐培基46 保存6个月以上白色念珠菌改良马丁培养基4 6 保存4 6个月黑曲霉改良马丁培养基4 6 保存4 个月2006年6月山东省药品检验所139 2006.11 2006.11l概述l方法的建立与验证关键点l验证中常见的问题l附：中外药典细菌内毒素检查方法收载 及修订情况 自20世纪60年代鲎血凝集机制的发现和鲎实验方法的建立以来，引起了各国药政管理部门的极大兴趣，并使细菌内毒素检查法在药品的热原限量控制中得到了广泛的应用和发展。尤其是与家兔热原法相比，细菌内毒素检查法具有劳动强度低，实验成本小等特点，还可以通过

56、对原料、活性成分、灭菌水、容器、赋形剂和终产品的细菌内毒素检测，对生产过程进行质控，更明显的特点是可以定量检测药品生产过程中可能污染的痕量内毒素，并且为区分干扰作用与内毒素污染提供了极为重要的技术手段。 1 细菌内毒素与热原的关系细菌内毒素与热原的关系 注射给药过程中，偶尔会出现发热、寒战、头痛、恶心、注射给药过程中，偶尔会出现发热、寒战、头痛、恶心、呕吐等症状，严重的甚至昏迷、死亡，将这种药物的不呕吐等症状，严重的甚至昏迷、死亡，将这种药物的不良反应称之为热原反应，能引起上述热原反应的物质被良反应称之为热原反应，能引起上述热原反应的物质被称之为热原（称之为热原（Pyrogen）。）。 热原与

57、内毒素的关系在学术上仍有争论，但目前认为，热原与内毒素的关系在学术上仍有争论，但目前认为，在在GMP的条件下，内毒素是主要的热原物质，可以说无的条件下，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制细菌内毒素就控制热原物质。内毒素就无热原，控制细菌内毒素就控制热原物质。 这也正是鲎试剂用于药物生产过程或药物成品热原检测这也正是鲎试剂用于药物生产过程或药物成品热原检测的基础。的基础。 l过去一直认为细菌内毒素来源于革兰阴性细菌，但最近发现存在革兰阴性菌来源的不具有内毒素毒性的革兰阴性细菌脂多糖（LPS）结构。因此，目前认为所有内毒素均为脂多糖，但非所有的脂多糖均为内毒素。l参与鲎血细胞凝集

58、的成分是细菌内毒素的C因子、B因子、G因子、凝固酶原和凝固蛋白原。lG因子激活的鲎试剂激活旁路，鲎试剂中的G因子可以被真菌、酵母和藻类细胞壁中另一类细菌多糖-（1，3）-D-葡聚糖激活，因此鲎试剂同内毒素的反应不是特异的。LPS不能激活G因子旁路。l但是，鲎试剂同葡聚糖的反应与鲎试剂同内毒素的反应敏感性是不一致的。有实验表明不同的鲎试剂在检测葡聚糖和内毒素上存在很大的差异，鲎试剂与内毒素的反应更灵敏。 l尽管与鲎试剂反应的物质不完全是内毒素， 但目前作为鲎实验基础的两个原则仍是：1、内毒素活性与热原性相关，家兔和鲎实验作为人类发热和炎症反应的预测方法是相关的。2、在注射剂GMP生产环境下，不存

59、在内毒素也就意味着不存在主要的热原物质。尽管 存在少数例外，但依然可以使用。C因子因子活化的活化的C因子因子内毒素内毒素活化的活化的B因子因子B因子因子凝固酶凝固酶凝固酶原凝固酶原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白原凝固蛋白原(1,3)(1,3)-D-葡聚糖或葡聚糖或LAL-RM活化的活化的G因子因子（旁路反应）（旁路反应）G因子因子抗LPS因子 复杂的酶促反应过程复杂的酶促反应过程l1.0IU=1.0EUl我国内毒素参考标准品无论是在赋形剂的选择，还是标定标准和方法的使用上均与国际参考标准品取得了一致。 l随着鲎试剂反应的进行，凝固蛋白不断增加，伴随凝聚的形成，光密度也会增加。l内毒素

60、的浓度决定了光密度增加的速率。l凝胶形成反应呈S型曲线（分为初期的平台期、快速增长期和后期的平台期）。l这些特性构成了各种检测方法的理论基础。l2000年版药典内毒素检查品种增加至69种，检测方法也由单一的凝胶法增加了定量检测法。l2005年版药典不但增加了112种检查品种，并且对细菌内毒素检查法进行了全面的修订，使之与美国、欧盟和日本三方协调统一的方法趋于一致。l国家SFDA正组织相关专业组对2005年版药典部分进行热原检查的品种开展细菌内毒素检查方法学研究。 l在方法学上，试管凝胶法已成为内毒素检查法的经典方法，并被普遍使用。但是凝胶法仍然存在着不能定量等缺点，于是随着光电子和计算机领域的