生物：专题53《血红蛋白的提取和分离》课件(新人教选修1)08

1、 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。物大分子的基本原理。凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法 样品的处理样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。色谱柱填料的处理和色谱柱的

2、装填。血血每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。红色。选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性质的理或化学性质的生物大分子生物大分子。根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类类

3、的蛋白质。的蛋白质。 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。 根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大的大 小，利用具有小，利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行分离。的凝胶，来进行分离。 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢移动速度较慢; ;而相对分子量较大的蛋白质无法进入

4、而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。分离。分离蛋白质分离蛋白质混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。 分离过程分离过程 在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强外加少量强酸

5、或强碱酸或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混不变的混合溶液。合溶液。 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。 由足够浓度的缓冲对组成。常见缓冲对由足够浓度的缓冲对组成。常见缓冲对有三类，有三类，即即由弱酸及其所对应的盐，由弱酸及其所对应的盐，多元弱多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，酸的酸式盐及其对应的次级盐，弱碱及其所对弱碱及其所对应的盐组成。如应的盐组成。如H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3，醋酸，醋酸/ /醋酸钠，醋酸钠，NaHNaH2 2POPO4 4

6、/Na/Na2 2HPOHPO4 4，NH4H2O/NH4CLNH4H2O/NH4CL等等： 利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察( () )和科和科 学研究学研究( () ), ,磷酸缓冲液磷酸缓冲液 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范围内范围内使用的缓冲液使用的缓冲液。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大

7、分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，下，这些基团会带上正电或负电。这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着在电场的作用下，这些带电分子会向着与其与其所带电荷相反的电极移动。所带电荷相反的电极移动。不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。从而实现样品中各种分子的和运动速度不同。从而

8、实现样品中各种分子的分离分离。琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。电荷性质电荷性质 分子大小分子大小 分子形状分子形状 电荷量电荷量影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 决定决定运动方运动方向向形成形成库仑力库仑力形成形成阻力阻力决定决定运动速运动速率率电荷性电荷性质质电荷量电荷量分子形分子形状状分子大小 电泳检测结果电泳检测结果 1 1、聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂剂N,NN,N- -亚甲基双丙烯酰胺在亚甲基双丙烯酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶

9、。作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素等因素。 （为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入SDSSDS。 。由几条肽链组成由几条肽链组成的的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会，因此测定的结果只是因此测定的

10、结果只是。SDSSDS能与各能与各种蛋白质形成种蛋白质形成，SDSSDS所带负电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子的量大大超过了蛋白质分子。因而掩因而掩盖了盖了，使电泳迁移率使电泳迁移率完完全取决于分子的大小。全取决于分子的大小。用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少分离纯化，洗涤次数不可过少。注意：注意：洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过洗

11、涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞一同沉淀，达不到分离效果。高和时间过长会使白细胞一同沉淀，达不到分离效果。采集血样采集血样低速短时间离心低速短时间离心（500r/min 离心离心 2min）吸取血浆吸取血浆盐水洗涤盐水洗涤低速短时间离心低速短时间离心重复重复3次次如何知道红细胞已洗干净？如何知道红细胞已洗干净？离心后上清液没有黄色离心后上清液没有黄色得到较为纯净的红细胞得到较为纯净的红细胞过程：过程：加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加再加4040体积的体积的甲苯甲苯 ，置于置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分钟（分钟（加速细加速细胞破

12、裂胞破裂）, ,细胞破裂释放出血红蛋白细胞破裂释放出血红蛋白。目的或结果：目的或结果：红细胞破裂释放出血红蛋白红细胞破裂释放出血红蛋白 为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂实验结果实验结果将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的的速度离心速度离心10 min。用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于

13、分液漏。用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体红色透明液体目的：目的：除去脂溶性物质除去脂溶性物质第第1层（最上层）：甲苯层（层（最上层）：甲苯层（无色透明无色透明）；）；第第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体白色薄层固体）；）；第第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体红色透明液体）；）；第第4层（最下层）：杂质沉淀层（层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色暗红色）。）。红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 离心离心管管滤纸滤纸过滤过

14、滤脂类物质脂类物质,红红细胞破碎物细胞破碎物烧杯烧杯 取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。 2.粗分离粗分离除去样品中分子量较小的杂质，得到除去样品中分子量较小的杂质，得到较为纯净的血红蛋白，同时可以更换样品的缓冲液。较为纯净的血红蛋白，同时可以更换样品的缓冲液。利用透析袋透析利用透析袋透析3.纯化纯化实现途径：实现途径：4.纯度鉴定纯度鉴定(1)方法方

15、法：（2）原理）原理：凝胶色谱法凝胶色谱法电泳（常用电泳（常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）通过电泳区带位置的比对，确定蛋白质的纯度或通过电泳区带位置的比对，确定蛋白质的纯度或相对分子质量。即选用一组已知浓度的标准蛋白相对分子质量。即选用一组已知浓度的标准蛋白（或相对分子质量）的标准蛋白质与需要鉴定的（或相对分子质量）的标准蛋白质与需要鉴定的蛋白质同时进行电泳，通过比对二者电泳的区带蛋白质同时进行电泳，通过比对二者电泳的区带位置，确定需要的鉴定的蛋白质的纯度（或相对位置，确定需要的鉴定的蛋白质的纯度（或相对分子质量）分子质量）蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离凝胶色谱制作凝

16、胶色谱制作1.凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作 取长取长40厘米，内径厘米，内径1.6厘米的厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。玻璃管，两端需用砂纸磨平。 底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。顶塞的制作：顶塞的制作：组装：组装：安装其他附属结构。安装其他附属结构。打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管底塞中插入的玻璃管的上部不得底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。质分离不

17、彻底。注注 意意2.凝胶色谱柱填料的处理凝胶色谱柱填料的处理计算凝胶量计算凝胶量配置凝胶悬浮液配置凝胶悬浮液装填装填洗涤平衡洗涤平衡凝胶装填时尽量紧密，凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶以降低凝胶颗粒之间的空隙。颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有装填凝胶柱时不能有气泡存在：气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。白质的洗脱次序，降低分离效果。 注注 意意缓冲液液面不要低于凝胶表面缓冲液液面不要低于凝胶表面，否，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。流动与最终生物大分子物质的分离效果。

18、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象现象，否则重新填装。，否则重新填装。 注注 意意装配好的凝胶柱装配好的凝胶柱在提取血红蛋白实验中用的缓冲在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，环境，保证血红保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究。色）和材料的科学研究。思考思考 如果凝胶装填得不够紧密、均匀，如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成就会在色谱柱

19、内形成无效的空隙无效的空隙，使本，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，中通过，搅乱洗脱液的流动次序搅乱洗脱液的流动次序，影响，影响分离的效果。分离的效果。你能从凝胶色谱的分离原理分析为你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？思考思考3 样品加入与洗脱样品加入与洗脱缓冲液缓慢下降缓冲液缓慢下降50cm高高加加透析透析样样品品注意正确的加样操作：注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面不要触及破坏凝胶面贴壁加样贴壁加样使吸管管口沿管壁环绕移动使吸管管口沿管壁环绕移动注注 意意3 .样品加入与洗脱样品加入与洗

20、脱缓冲液缓慢下降缓冲液缓慢下降50cm高高样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：洗脱：洗脱：收集：收集：加透析样品加透析样品收集得到的纯化后的蛋白收集得到的纯化后的蛋白观察你处理的血液样品离心后是否分观察你处理的血液样品离心后是否分层？如果分层不明显，可能是洗涤次数少、层？如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。响后续血红蛋白的提取纯度。1. 你是否完成了对血液样品的

21、处理？你你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？三三实验结果分析与评价实验结果分析与评价2. 你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2

22、0002000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、；如果红色

23、区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。谱柱的装填有关。3. 你能观察到蛋白质的分离过程中，你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？动情况，并据此判断分离效果？1.与其他真核细胞相比，红细胞有什与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？有什么意义？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时谱分离时可以通过观察颜色来

24、判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。过程非常直观，大大简化了实验操作。 思考思考2.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即: :样样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，