蛋白质纯化技术(上)

1、A Brief View of Protein PurificationA Brief View ofProtein PurificationA Brief View of Protein PurificationA Brief View of Protein Purification细胞破碎细胞破碎蛋白溶解蛋白溶解酸、碱醇去垢剂尿素粗粗 提提沉淀相分离分子筛精精 提提各种色谱电泳分离差速离心研磨超声渗透压酶保保 存存预处理原材料的获取浓缩保存状态保存条件保存期限A Brief View of Protein Purification动物植物培养物A Brief View of Protein

2、 Purification材料的收集过滤离心A Brief View of Protein Purification离 心 A 19th century hand cranked laboratory centrifuge. 离心是利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的方法。 A Brief View of Protein Purificationrdus22(18粒子在离心场中的运动速度：离心加速度：2ra 离心分离因数：grFr2Fr3500 常速离心Fr=350050000 高速离心Fr50000 超速离心A Brief View of Protein Purifi

3、cationrpm与g的换算NrgNrgrRCF52210118. 1)602(（r,旋转半径，cm; N，转速，rpm）沉降系数每单位离心场的速度 2ruS avt 1S=10-13sA Brief View of Protein Purification机械方法非机械方法搅拌、振动研磨压滤超声匀浆干燥渗透压冻融酶A Brief View of Protein Purification超声破碎超声破碎频率高于20000HZ的声波称为“超声波”。 超声破碎的原理空化作用 当超声波在液体中传播时，由于液体微粒的剧烈振动，会在液体内部产生小空洞。这些小空洞迅速胀大和闭合，会使液体微粒之间发生猛烈的

4、撞击作用，从而产生几千到上万个大气压的压强。微粒间这种剧烈的相互作用，会使液体的温度骤然升高，起到了很好的搅拌作用，从而使两种不相溶的液体（如水和油）发生乳化，并且加速溶质的溶解，加速化学反应。这种由超声波作用在液体中所引起的各种效应称为超声波的空化作用。A Brief View of Protein Purification超声破碎影响超声破碎的因素-超声波强度超声波强度：对于一般液体超声波强度增加时，空化强度增大，但达到一定值后，空化趋于饱和。-超声波振幅超声波振幅：振幅越大，效率越高。-超声波频率：超声波频率：频率越低，在液体中产生空化越容易 。-液体的表面张力与黏滞系数：液体的表面张力

5、与黏滞系数：液体的表面张力越大，越不易于产生空化 ，黏滞系数大的液体难以产生空化泡 。-液体的温度：液体的温度：液体温度越高，对空化的产生越有利，但是温度过高时，气泡中蒸汽压增大，因此气泡闭合时增强了缓冲作用而使空化减弱。-探头的材料与形状探头的材料与形状 功率恒定时，探头的振幅与面积成反比。钛是最好的探头材料。-处理量处理量 大体积的处理对象需要更大的功率。A Brief View of Protein Purification超声破碎超声破碎利用超声波进行细胞破碎时，体系中会产生自由基，它可能破坏蛋白的结构，因此进行超声破碎之前，需可以添加自由基清除剂，如还原型的GSH，也可以用氢气预吹细

6、胞悬浮液来缓和。A Brief View of Protein Purification渗透压渗透压 溶液渗透压，简单的说，是指溶液中溶质微粒对水的吸引力。溶液渗透压的大小取决于单位体积溶液中溶质微粒的数目：溶质微粒越多，即溶液浓度越高，对水的吸引力越大，溶液渗透压越高；反过来，溶质微粒越少，渗透压就低。渗透压与无机盐、蛋白质的含量有关。在组成细胞外液的各种无机盐离子中，含量上占有明显优势的是Na+和Cl-，细胞外液渗透压的90%以上来源于Na+和Cl-。 A Brief View of Protein Purification渗透压渗透压A Brief View of Protein Pur

7、ification渗透压渗透压直接低渗溶液处理化学渗透有机溶剂 （Benzene 、Methylbenzene ）抗生素（Penicillin ） 表面活性剂 （Triton)金属螯合剂 (EDTA)变性剂(Urea) 改变细胞壁或者细胞膜通透性A Brief View of Protein Purification酶破碎法A Brief View of Protein PurificationA Brief View of Protein Purification 清蛋白清蛋白可溶于稀盐、稀酸、稀碱。可被饱和硫酸铵沉淀。eg:白蛋白，卵清蛋白 球蛋白不溶于水但溶于稀盐，可以被半饱和的硫酸铵沉

8、淀。eg: IgG，肌球蛋白 谷蛋白不溶于水、醇和中性盐溶液，但溶于稀酸或稀碱。eg:米谷蛋白 谷醇溶蛋白不溶于水及无水乙醇，但溶于70-80%乙醇中。非极性侧链多eg:小麦醇溶蛋白 组蛋白溶于水和稀酸，但可被稀氨水沉淀，分子中含His、Lys多。eg:小牛胸腺组蛋白 鱼精蛋白溶于水及稀酸，不溶于氨水，分子呈碱性。eg:鲑精蛋白 硬蛋白不溶于水、稀酸、稀碱、盐。有较强机械强度。eg:角蛋白，胶原A Brief View of Protein Purification面对的问题面对的问题杂质的去除杂质的去除蛋白的稳定蛋白的稳定溶解体系与条件溶解体系与条件A Brief View of Prote

9、in Purification杂质的去除杂质的去除脂类：离心：吸去浮在表面的脂类；SiO2：待蛋白全部溶解完后吸附，再离心除去。石油醚：比较适合固态蛋白中脂杂质的去除。核酸：核酸酶：将核酸直接分解为核苷酸。链霉素：与DNA结合形成沉淀。硫酸鱼精蛋白：带正电，可与DNA结合，主要用于生产疫苗中除去NDA，也用于蛋白纯化中除去DNA，尤其是纯化DNA结合蛋白。MnCl2：可与核酸一起形成核酸锰，但可以加强DNA与组蛋白结合。A Brief View of Protein Purification蛋白的稳定天冬氨酸蛋白酶抑制剂天冬氨酸蛋白酶抑制剂碘乙酸，PMSF，Pepstatin，云芝发酵物巯基蛋

10、白酶抑制剂巯基蛋白酶抑制剂PMSF，TLCK，N-乙基顺丁烯二酰亚胺 TPCK，Antipain-HCL 丝氨酸蛋白酶抑制剂丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF，AEBSF-HCl Aprotinin，ChymostatinLeupeptin 苏氨酸蛋白酶抑制剂苏氨酸蛋白酶抑制剂Unknown金属离子螯合剂金属离子螯合剂EDTA，EGTA，塔罗肽（马组链霉菌）A Brief View of Protein Purification溶解体系与条件溶解体系与条件离子条件 不同蛋白溶解所需要的离子条件是不相同的，一般根据需要选择合适的离子种类及浓度。大部分水溶性蛋白均可溶在0.020.05M 磷酸盐缓冲液或碳

11、酸盐缓冲液，也可溶 于0.15M NaCl溶液中。但是少数蛋白溶解对离子浓度依赖性比较强，这些性质也可以用来作为粗提的理论依据。如肌球蛋白在0.6M KCl中溶解度最大，偏离这一浓度则溶解度下降，利用这一性质可将其与其它蛋白分开。胶原蛋白多在1M NaCl溶液中有较大溶解度，NaCl浓度大于2.4M时，立即形成沉淀。A Brief View of Protein Purification溶解体系与条件溶解体系与条件体系的兼容 在选择溶解体系时，要充分地考虑到所采用的离子之间是否兼容，离子的种类以及离子浓度是否和体系后来要加入的物质兼容。常见不兼容体系可考虑以下因素：1、二价及以上阳离子在碱性体

12、系中不能稳定存在，尤其是Fe2+、Mn2+、Ni2+等过渡金属离子。2、如果体系中严格不能有二价离子影响，则调pH时不能选用KOH、NaOH。可用Tris。3、磷酸盐、碳酸盐可以与二价及以上金属离子形成沉淀。4、Tris、EDTA可以与二价金属离子形成络合物。柠檬酸盐可以与蛋白质形成金属复合物。5、有的酶需要金属离子存在才能有活性，有些酶则在特定金属离子存在下完全失活。6、有些特殊的离子需要用特殊的螯合剂才能络合，如邻二氮杂菲可以用来螯合Zn2+。7、一些离子存在与去垢剂不兼容的情况，长链脂肪酸与二价阳离子可形成沉淀，如脱氧胆酸钠在Ca2+、Mg2+溶液中就不能溶解，但其牛磺酸衍生物不会与二价

13、阳离子形成沉淀。8、当pH8时，钠离子的存在会使脱氧胆酸钠CMC值变小。9、Hepes等具有哌嗪基的试剂在溶液中会形成自由基，会干扰氧化还原缓冲体系。10、有些离子或去垢剂会对蛋白质定量实验产生较大干扰，如Triton X-100在280nm处有吸收峰，Hepes会干扰Lowry法定量，大部分去垢剂都会干扰Bradford测定。A Brief View of Protein Purification溶解体系与条件溶解体系与条件pH条件 选择一个合适的pH条件对溶解蛋白是十分重要的，选择pH时需要考虑的因素有：体系的兼容性、蛋白的溶解性、蛋白的稳定性。 原则上讲，对于酸性蛋白，应该选择pH较高的

14、体系去溶解；反之，对于碱性蛋白，应该选择pH较低的体系去溶解。 但是过酸或过碱都会造成蛋白质的水解或都活性的丧失。A Brief View of Protein Purification溶解体系与条件溶解体系与条件温度条件 蛋白质在水中的溶解很大程度上取决于其本身的疏水性，一般来说，温度越高，蛋白质的疏水性就升高。因此，大多情况下优先考虑低温环境去溶解蛋白。另外，为了减小体系中蛋白酶对目的蛋白的降解作用，最好也用低温。 但是有些特殊的蛋白，对热稳定性非常好，此时如果采用高温溶解不仅可以使非目标蛋白变性沉淀，还可以去掉蛋白酶的干扰。 另外，如果蛋白的浓度比较高，则体系很容易析出晶体；反复冻融蛋白质，也会使蛋白在体系中形成聚集沉淀。A Brief View of Protein Purification溶解体系与条件溶解体系与条件难溶蛋白的溶解方案对于难溶解的蛋白质，可以采用强的离液剂进行溶解。常用对于难溶解的蛋白质，可以采用强的离液剂进行溶解。常用的离液剂包括：的离液剂包括：DMF表面活性剂盐酸胍尿 素硫 脲A Brief View of Protein Purification溶解体系与条件溶解体系与条件难溶蛋白的