环介导的恒等温扩增技术---张建立

1、环介导的等温扩增技术（LAMP）普通PCRPCR的基本步骤变性：高温使双链DNA解离形成单链（94,30s）。退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（ 55,30s ）。延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（7072 ,3060s）。PCR的基本步骤环介导的等温扩增技术（LAMP）LAMP简介环介导的等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由日本研究人员Notomi等人发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术主要是利用两对特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，使反应中在

2、模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，让引物可以在等温条件下（约65）顺利结合上去进行链置换扩增反应，客服了传统PCR反应需要通过反复的热变形过程获得单链模板的缺点，并大大节省了反复升降温度的时间，从而实现在恒温条件下进行连续的快速扩增。LAMP与PCR方法对比LAMP引物简介LAMP扩增原理LAMP扩增的三个阶段：1. 循环模板合成阶段2. 循环扩增阶段3. 伸长和再循环阶段LAMP扩增产物的检测1. 琼脂糖电泳检测普通PCR结果LAMP结果LAMP扩增产物的检测2. 焦磷酸镁浊度检测3. 荧光目测比色法检测2.a2.b3.a3.bLAMP技术特点 优点：1.等温扩增：只需要一个恒定温度就

3、能完成扩增反应，不需要像PCR那样循环的温度变化。2.快速高效：因没有反复变性退火等耗时过程，LAMP体系从一开始到结束都在不停的进行扩增反应，所以LAMP可以实现快速高效的扩增。整个扩增反应可以在3060min内完成，扩增出1091010倍靶序列拷贝，DNA产量高达500ug/ml。3.特异性高：4个引物靶向6个区域决定了LAMP的高特异性，其中6个独立的序列在扩增起始阶段决定靶序列的识别，而在后续的扩增反应中，则由4个独立的序列决定靶序列的识别。因此就算在非靶DNA共存情况下，LAMP的特异扩增都不受影响。LAMP技术特点 优点：4.灵敏度高：LAMP能检测到比PCR检测限低10倍的拷贝数

4、，扩增模板可达10拷贝或者更少，对少至几个细胞的样品也能进行扩增反应。5.产物检测方便：因为LAMP反应产生了大量的产物，因此可以利用直观的焦磷酸镁浊度检测法或者荧光目测比色法对扩增结果进行简便的检测。6.设备简单：只需要一个简单的恒温器，不需要昂贵的PCR检测设备，这对现场检测或基层应用及其有利。LAMP技术特点 缺点：1.不易区分非特异性扩增：LAMP的结果判读只有扩增与非扩增两种，一旦发生非特异性扩增，不易区分。2.无法用于长片段的扩增：因为LAMP要求靶序列长度不能过长，一般不超过300bp，才能保证高效率的扩增，所以不宜用于长片段检测。LAMP的应用病原微生物检测 DNA病毒的检测 RNA病毒的检测 SARS 流感病毒（influenza viruses） 呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus） 腮腺炎病毒（mumps virus） 日本脑炎病毒（Japanese encephalit