硼替佐米单用或联合三尖杉酯碱体外诱导HL60细胞凋亡实验研

1、硼替佐米单用或联合三尖杉酯碱体外诱导HL60细胞凋亡实验研究(1)】 本研究探讨硼替佐米（bortezomib， Bor）单用或联合三尖杉酯碱（harringtonine， HT）对HL60细胞凋亡的影响。以不同浓度Bor、HT处理HL60细胞12-48小时，采用MTT比色法检测细胞增殖活性，以DNA凝胶电泳、荧光显微镜检、流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明： 10-50 nmol/L Bor可有效抑制HL60细胞增殖，并诱导其凋亡。其中10 nmol/L剂量处理12小时即有细胞凋亡发生，延长作用时间或增加药物剂量可使细胞凋亡率明显增加。30 nmol/L HT与10 nmol/L Bor联合应

2、用时，可见HL60细胞凋亡率比两种药物单独使用时显著增加。结论： Bor对HL60细胞具有时间和剂量依赖性的细胞凋亡诱导效应，与HT联合应用有明显的协同作用。 【关键词】 硼替佐米； 三尖杉酯碱； 凋亡 Induction of Apoptosis in HL60 Cells by Bortezomib aloneorin Combination with Harringtonine In VitroAbstractThe aim of this study was to investigate the effect of bortezomib alone and in combination

3、 with harringtonine on apoptosis of HL60 cells. HL60 cells were treated with bortezomib, harringtonine in different concentrations for 12-48 hours. Cell proliferation was analyzed by MTT assay； the apoptosis of HL60 cells was observed by DNA gel electrophoresis， fluorescence microscopy and flow cyto

4、metry. The results showed that 10-50 nmol/L bortezomib could effectively inhibit HL60 cell proliferation, and induced its apoptosis. After treating for 12 hours, 10 nmol/L bortezomib could trigger cells apoptosis. With time prolongation ordose increase, HL60 cell apoptotic rate significantly increas

5、ed. Furthermore, coadministration of bortezomib (10 nmol/L) with harringtonine (30 nmol/L) resulted in a higher cell apoptotic rate when compared with that induced by those agents used alone. It is concluded that the bortezomib can induce HL60 cells apoptosis in a timeanddosedependent manner and syn

6、ergistic effectiveness can be found when bortezomib combined with harringtonine.Key wordsbortezomib; harringtonine; apoptosisJ Exp Hematol 2007; 15(2):233-236急性白血病是一类恶性克隆性疾病，虽然其治疗水平近年来已有了明显提高，但仍有相当一部分患者因疾病复发或耐药而转变成难治的白血病，因此积极寻求新的治疗方法在当前仍然显得尤为重。硼替佐米（bortezomib，Bor）是一种新型抗肿瘤靶向治疗药物，目前主用于复发或难治的多发性骨髓瘤的治疗，

7、并已显示出良好的疗效1。研究显示Bor在体外对多种恶性肿瘤细胞均具有良好的疗效，但在急性白血病方面的研究至今报道很少，更未见与三尖杉酯碱（harringtonine, HT)联合应用的研究报告。本研究首次揭示Bor与HT联合作用于HL60细胞的效果，为临床用于治疗白血病提供理论依据。材料和方法试剂RPMI 1640培养液为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品，MTT、Hoechst33342、碘化丙锭（PI）、RNA酶A、蛋白酶K均为Sigma公司产品。硼替佐米（bortezomib、Velcade、万珂）为美国Millennium公司产品（西安杨森制药有限公司惠赠），用无菌水配

8、成1 mg/ml浓度备用。三尖杉酯碱注射液为北京协和制药厂产品，使用时稀释到实验所需的浓度。细胞培养HL60白血病细胞株购自天津血液病研究所，用含10%小牛血清RPMI 1640培养液，在37、5% CO2条件下培养，1-2天换液1次，取对数生长期细胞用于实验。中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)硼替佐米或联合三尖杉酯碱诱导HL60细胞凋亡实验研究研究方案 依预试验结果，选择Bor（10-50 nmol/L）和HT（7.5-75 nmol/L）分别单独处理HL60细胞12-48小时，观察药物剂量反应效应。根据药物反应结果，选择HT IC50剂量与Bor各浓度联

9、合，观察药物联合后对HL60细胞的协同效应。细胞增殖活性MTT检测对数生长期细胞调整密度为1105 cells/ml，每孔100 l接种，按求加入不同浓度处理药物，终体积200 l/well，每个浓度设3个复孔。培养至相应的时间后加入20 l MTT（5 mg/ml），继续孵育4小时。离心并吸弃上清，加DMSO 170 l/well,轻震荡，酶标仪测570 nm OD值（A）。细胞活力计算:细胞活力（%）=（A处理组A调零组/A对照组A调零组）100% 细胞形态学观察Hoechst33342以终浓度10 g/ml加入培养板各处理组细胞中，避光染色15分钟，倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化。DN

10、A提取及电泳 参照文献2,分别收集各浓度药物处理的细胞5105个，用PBS洗涤1次，加入20 l裂解缓冲液EDTA 20 mmol/L, Tris 100 mmol/L, pH 8.0, 0.8%(w/v) SDS和10 l RNA酶A（10 mg/ml）, 37水浴60分钟。再加入10 l蛋白酶K（20 mg/ml）,55水浴120分钟。取20 l样品加6 l 10DNA上样缓冲液，80 V，电泳50分钟。紫外灯下显示，拍照。流式细胞术分析 分别收集各浓度药物处理的细胞1106个，用PBS洗涤后，70%乙醇4固定。24小时后用PBS再洗涤1次，加1 ml PI(100 g/ml)和RNA酶A

11、（100 g/ml）染液，于4避光染色30分钟，400目筛网过滤后，流式细胞仪检测。统计学分析 所有实验至少重复3次，应用SPSS 10.0软件进行数据分析，均数比较采用t检验，设定P0.05为显著性差异。结果HL60细胞增殖活性10-50 nmol/L Bor 对HL60细胞的增殖均有一定抑制作用，表现为时间剂量依赖关系，随浓度增加和时间延长抑制效果逐渐增强（图1），其24小时的IC50为20 nmol/L。30 nmol/L剂量处理12-48小时，细胞抑制率与对照组相比差别均有显著性意义（P0.01）；作用24小时时，抑制效果达到最大，但与48小时相比差别无统计学意义（P=0.328），而

12、与12小时或18小时相比，抑制效果明显增强，有显著性意义（P=0.002、P=0.011），其余浓度也均可见类似规律。以7.5、15、22.5、30、37.5、56.2、75 nmol/L HT处理HL60细胞24小时，细胞活力分别下降为对照的92%、82%、61%、47%、33%、23%、21%，也显示出明显的剂量依赖性抑制效应，其24小时的IC50剂量约为30 nmol/L。选择30 nmol/L HT与Bor各浓度联合，可见在达到最大抑制效果前，联合处理组对细胞的抑制作用比同剂量两药任一种单独使用时都显著增强(P0.01）（图2）。作者：孙启鑫，孟凡义，扶云碧，李利【摘】 本研究探讨硼替

13、佐米（bortezomib， Bor）单用或联合三尖杉酯碱（harri 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。细胞形态学改变Hoechst33342染色显示，经24小时培养后对照组细胞无凋亡发生，细胞核呈均匀、弥散的蓝色荧光（图3A）；而Bor（图3B）与HT（图3C）单独或联合处理组均可见细胞凋亡现象，表现为细胞核凝集、固缩，形成质密明亮的蓝色荧光颗粒；且单位视野下10 nmol/L Bor与30 nmol/L HT联合处理组凋亡细胞数量明显多于

14、同剂量Bor或HT单独处理组（图3D）。DNA凝胶电泳 10-50 nmol/L Bor 处理细胞12小时，DNA凝胶电泳均可见明显DNA Ladder出现, 其中10 nmol/L Bor处理组还可见正常基因组DNA条带和凋亡DNA Ladder共存。相同条件下，延长作用时间至24小时，各处理组仍可见明显DNA Ladder，但10 nmol/L处理组正常基因组条带消失，显示随时间延长Bor作用效果增强。此外，30 nmol/L HT单独或与10 nmol/L Bor联合处理细胞24小时，DNA凝胶电泳也均显示出明显DNA Ladder。流式细胞术检测对照组经12小时和24小时培养细胞无明显

15、凋亡，亚G1期、G0/G1期、G2/M期细胞比率分别为2%、53%和24%，而 Bor与HT各处理组则均可见凋亡亚G1峰出现，其中Bor各处理组细胞凋亡率还呈现随剂量增加而明显增高的规律。10 nmol/L Bor处理细胞12小时和24小时，凋亡率分别为5%和19%。30 nmol/L Bor处理12小时和24小时，凋亡率分别为59%和62%，显著高于同时间10 nmol/L处理的效果（P值均0.01）。HT 30 nmol/L处理细胞24小时，细胞凋亡率、G0/G1期比率明显增加，分别为11%和65%，与10 nmol/L Bor联合应用后，细胞凋亡率进一步增至44%，显著高于各药物单独处理

16、时效果P0.01（图4）。讨论Bor是一种新型抗肿瘤靶向治疗药物，主通过抑制真核细胞26S蛋白酶体对蛋白质的降解，促使多种与细胞增殖、分化、存活、凋亡密切相关的蛋白代谢发生紊乱，诱导细胞凋亡3。研究表明，Bor能有效抑制放疗、化疗引起的NFB激活，阻止多种抗凋亡蛋白和细胞因子的转录，增加细胞对放疗、化疗的敏感性；同时，通过稳定多种细胞周期蛋白（P53，P21，P27）的表达，促使细胞发生周期阻滞，诱导细胞凋亡4。目前，作为第一个被FDA批准应用于临床的蛋白酶体抑制剂类药物Bor对复发或难治的多发性骨髓瘤患者已显示出良好的疗效，对白血病的疗效也正在评价之中。Gatto等5报道，多种髓系白血病细胞

17、株对Bor均敏感，单独应用时其IC50剂量均在10-15 nmol/L之间。Horton等6发现，Bor不但对各型急性白血病细胞株有效，对白血病原代细胞也具有明显抑制作用，但不同细胞类型对其敏感性略有差异。急性淋巴细胞白血病细胞株（Jurkat、Molt4等）敏感性最高（平均IC50为7.5 nmol/L），急性髓系白血病原代细胞敏感性最差（平均IC50为30 nmol/L）。本研究显示，对于急性髓系白血病HL60细胞，Bor 的有效抑制浓度为10-50 nmol/L，其中10 nmol/L剂量处理12小时即可抑制HL60细胞增殖，30 nmol/L处理24小时达最大抑制效果，这与国外文献报告

18、基本一致6。Dai等7、8报道，Bor与细胞周期激酶抑制剂flavopiridol联合应用，对U937细胞和Bcr/Abl 的K562细胞具有明显的协同诱导凋亡效应。Horton等4报道，Bor体外联合地塞米松、热休克蛋白抑制剂格尔德霉素（geldanamycin），可明显增强它们对各自敏感细胞株的细胞毒作用；Bor分别与长春新碱、阿霉素、阿糖胞苷、门冬酰胺酶，Bcl2抑制剂（HA 14.1）联合应用时，细胞毒作用也均比各自单用时明显增强。另外，Smolewski 等9报道，对于BCLL原代细胞，小剂量5 nmol/L Bor单用时细胞抑制率即为48%，联合CD52单克隆抗体应用后抑制率显著增

19、至64%，如果将用药顺序改为预先应用CD52单克隆抗体作用24小时，再加入Bor，结果细胞抑制率比它们同时应用时还高。本研究中，我们首次将HT与Bor进行联合应用，研究它们对HL60细胞增殖、凋亡的影响，结果发现10 nmol/L Bor 与30 nmol/L HT单用24小时，细胞凋亡率分别为19%和11%，而联合后凋亡率显著增至44%，显示两者之间具有明显的协同作用。但在临床急性白血病治疗中，如HA 方案联合Bor同时应用，对患者是否会产生更好的疗效，值得进一步探讨。目前，Bor单独或联合各种化疗治疗白血病的临床试验已经展开，已有期临床试验报道10，对于难治或复发的急性白血病患者，Bor单

20、药最大耐受剂量为1.25 mg/m2，常见的剂量相关性副反应有恶心、呕吐、 直立性低血压、血小板减少等，最终在参加试验的15人中，5人获得了明显的血液学改善。此外，另一项评价Bor与阿糖胞苷（100 mg/m2，1-7天）、去甲氧柔红霉素（12 mg/m2，1-3天）方案联用安全性的期临床试验也正在进行之中11，初步结果显示: 1.0 mg/m2 剂量Bor与阿糖胞苷、去甲氧柔红霉素联合应用，患者的耐受性均良好。在目前可评价的12名急性髓系白血病患者（均为18岁以上复发或60岁以上初发）中，有7例获得完全缓解。总之，本研究显示Bor能够有效地诱导白血病HL60细胞凋亡，与HT联合应用，凋亡效果

21、显著增强，显示了很好的临床应用前景。【参考文献】1Boccadoro M, Morgan G, Cavenagh J. Preclinical evaluation of the proteasome inhibitor bortezomib in cancer. Cancer Cell Int, 2005; 5: 18-272D. L.斯佩克特著 (黄培堂等译). 细胞实验指南. 北京: 科学出版社. 2001：108-1093兰雨,张学敏,胡美茹等. 阻断泛素蛋白酶体通路诱导白血病细胞凋亡及机制探讨. 中国实验血液学杂志, 2001; 9:105-1094Voorhees PM, Dees

22、 EC, ONeil B, et al. The proteasome as a target for cancer therapy. Clin Cancer Res， 2003; 9:6316-63255Gatto S, Scappini B, Pham L， et al. The proteasome inhibitor PS341 inhibits growth and induces apoptosis in Bcr/Ablpositive cell lines sensitive and resistant to imatinib mesylate. Haematologica, 2

23、003; 88:853-8636Horton TM, Gannavarapu A, Blaney SM, et al. Bortezomib interactions with chemotherapy agents in acute leukemia in vitro. Cancer Chemother Pharmacol, 2006; 58:13-237Dai Y, Rahmani M, Pei XY, et al. Bortezomib and flavopiridol interact synergistically to induce apoptosis in chronic myeloid leukemia cells resistant to imatinib mesylate through both Bcr/Abldependent and independent mechanisms. Blood, 2004; 104: 509-518作者：孙启鑫，孟凡义，扶云碧，李利【摘】 本研究探讨硼替佐米（bortezomib， Bor）单用或联合三尖杉酯碱（harri 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或