粉防己碱对实验性心肌缺血再灌注损伤影响的研究

1、粉防己碱对实验性心肌缺血再灌注损伤影响的研究摘要为探讨粉防己碱(Tet)对心肌缺血再灌注损伤的影响，将16只杂种犬制作动物模型随机分为用药组和对照组，观察两组白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、血小板激活因子(PAF)、心肌内髓过氧化物酶(MPO)活性、心肌梗死范围(MIS)等指标。结果表明：用药组MIS较对照组明显缩小，同时IL-1、TNF、PAF、MPO等炎性指标也较对照组明显为低，IL-1、TNF、PAF与MIS存在明显复相关关系，心肌MPO与MIS呈密切正相关。提示Tet具有抗心肌缺血再灌注损伤作用，其机理可能与其抗炎作用有关。关键词粉防己碱心肌缺血再灌注损伤炎性递质心

2、肌梗死范围 Influence of Tetrandrine on myocardium injury indogs with experimental ischemia reperfusionGuan Huaimin?Yiu RuiyunHuang Zhengwenet al(?Henan Provincial Chest Disease Hospital,Zhengzhou 450003)AbstractTo investigate the influence of Tetrandrine (Tet) in treating myocardial ischemia reperfusion

3、injnry,16 dogs models were divided randomly into Tet group and control group.The changes of interleukin-1 (IL-1),tumor necrosis factor(TNF),platelet activating factor(PAF),endocardiac myeloperoxidase(MPO) and myocardial infarction size(MIS)were observed in the 2 groups.The results showed:MIS in Tet

4、group was obviously small than that in control group,likewise IL-1,TNF,PAF and MPO in Tet group were obviously lower than that in control group.MIS or MPO was found to have a close coefficient of multiple correlation with the three inflammatony factors(IL-1,TNF,PAF),and between MPO and MIS there was

5、 a close positive correlation.The results indicated that Tet played an important role in protecting reperfusion of ischemic myocar-dium,this mechanism might relate to anti-inflammatory function of Tet.Key wordsTetrandrineMyocardium ischemia reperfusion injuryInflammatory agentsMyocardium infarction

6、size粉防己碱(Tet)和小檗碱、蝙蝠葛碱同属异喹啉类生物碱，实验研究已证实小檗碱、蝙蝠葛碱对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。本研究以Tet作为保护剂，在犬心肌缺血再灌注模型上，观察白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、血小板激活因子(PAF)、髓过氧化物酶(MPO)含量等指标，评估Tet对心肌缺血再灌注损伤的保护作用并探讨其机理。1材料和方法1.1动物模型杂种犬16只，体重1320 kg，雌雄不拘。3%戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)肌注麻醉，用多导生理记录仪监测标准导联心电，气管插管行正压人工呼吸，在无菌操作条件下于胸骨左缘第4、5肋间开胸，暴露心脏，缝制心包吊床，

7、在冠状动脉(冠脉)左前降支(LDA)第一分支远端分离LDA置线，心大静脉内置管采血标本用，用无创血管夹阻断冠脉1.5 h然后松开6 h。以冠脉阻断前所采双序号标本的测出结果为基础值，以冠脉阻断后1.5 h，再灌注后2、4、6 h为采血标本时间。将动物随机分为两组，每组8只。用药组于冠脉阻断前5 min静脉注射0.3%Tet溶液(3 mg/kg，浙江金华制药厂提供原粉，批号890815)，对照组于冠脉阻断前5 min静脉注射等量生理盐水。两组在观察过程中均静脉滴注生理盐水(2 ml/min)维持。1.2IL1测定无菌采血2.5ml装入预备无菌肝素抗凝瓶中，常规分离单个核细胞，配成5109/L浓度

8、，在CO2培养箱中培养2 h后洗去不粘附细胞，加入1%新生小牛血清和含有内毒素的1640营养液，置培养箱中再培养40 h，收集上清液经0.22 m滤膜过滤后分装，-20冰箱中保存待测，以C 57/BL纯系小鼠胸腺细胞作为靶细胞，用四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma)细胞增殖法测定IL-1活性，结果以u/ml表示，IL-1标准品由中国人民解放军医学科学院提供。1.3TNF测定无菌采血2 ml，将单个核细胞调整成浓度为4109/L，加入内毒素后在CO2培养箱中培养18 h，过滤分装低温保存。TNF测定用酶联吸附法，结果以g/L表示，TNF药盒由中国人民解放军医学科学院提供。1.4PAF测定采血3

9、ml立即注入预先加有甲醇15 ml的试管中，摇匀，振荡10 min，3000 r/min离心，取上清液加氯仿7.5 ml、蒸馏水7.5 ml振荡1 min，静置到分层清晰后取出氯仿相，低温保存。测定前将氯仿用氮气冲干，高效薄层层析法测定(岛津CS-930型薄层扫描仪)血中PAF含量，结果以g/L表示，PAF标准品购自Sigma公司。1.5心肌MPO测定心肌缺血再灌注时心肌内有多形核粒细胞浸润，在其胞浆嗜天青颗粒中含有MPO。处死动物后立即取再灌注区心肌12 g，低温保存。测定按罗武生等1改良方法，取心肌组织100 mg加入2 ml 0.05 mol PBS缓冲液中，经电动匀浆后用超声粉碎仪粉碎

10、细胞及亚细胞成份，于04、4 3000 r/min离心15 min，取上清0.1 ml加入2.9 ml反应液(盐酸邻联碱茴香胺16.7 mg、0.05 mol PBS缓冲液10 ml、蒸馏水9 ml加30% H2O2使终浓度为0.0005%)混合，在721分光光度计460 nm波长下立即进行2 min扫描，以第30 s至90 s的1 min内吸光度变化代表酶活性改变。1单位MPO活力以25时分解1 mol H2O2表示，结果以u/g表示。1.6心肌梗死范围(MIS)测定采用TTC大体标本染色法，将左心室横切成0.5 cm薄片，浸泡在37、1% TTC磷酸缓冲液中孵育30 min，剪去未染组织后

11、称重，获取梗死心肌重量占左室重量的百分比表示MIS。1.7统计学处理各参数以s表示，同一指标间比较、不同指标间直线相关分析用t检验，复相关分析用F检验。2结果2.1两组不同时间IL-1、TNF、PAF水平变化比较见附表。2.2两组心肌MPO含量比较每克湿重心肌组织中含有MPO，对照组为16.553.51u/g，用药组为10.572.61 u/g，两组差异极显著(P0.01)。2.3两组MIS比较对照组为35.312.81(%)，用药组为18.22.27(%)，两组差异极显著(P0.001)。附表两组IL-1、TNF、PAF水平变化比较项目组别阻断前阻断后1.5 h再灌2 h再灌4 h再灌6 h

12、IL-1(u/ml)对照组用药组136.2514.4177.8820.022720.725316.527515.86153.1216.4*18815.8*219.915.3*24516*TNF(g/L)对照组用药组6.640.7637.263.9861.303.4270.303.6176.534.1332.133.33*53.283.12*66.253.48*69.943.38*PAF(g/L)对照组用药组185.316.742850582.736.7317.346.7208.736.534741*461.353.2*232.733.3*203.326.7与同组前一时间值相比，P0.001；与

13、对照组同一时间相比*P0.05，*P0.01，*P0.0012.4相关分析IL-1、TNF、PAF三种炎性因子间相互存在着密切的复相关关系(均P0.05)；心肌内MPO含量与三种炎性因子间存在着显著复相关关系(r=0.958，P0.05)，MPO与MIS存在着密切的正相关关系(r=0.853，P0.005)。3讨论急性心肌缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，它不仅是由于血流阻断或代谢产物蓄积，而且是因为缺血引发了一系列反应，而这种反应的结果是，再灌注时白细胞进入缺血区，与内皮细胞相互作用，诱发和释放炎性递质，致使缺血性损伤加重2。有资料证实，急性心肌缺血或(和)再灌注时具有强烈致炎作用的I

14、L-1、TNF和PAF均显著升高，且其升高程度愈明显，炎症反应愈重，预后愈差3，4。本研究结果与上述报道一致，三种炎性因子在缺血期已有明显升高，再灌注更显著。相关分析表明，三种炎性因子间相互存在着密切的复相关关系，说明三者相互影响，形成网络，在迅速放大炎症效应中起重要作用。MPO系心肌浸润白细胞内所含的一种重要溶酶体酶，它既能间接反映心肌浸润PMN的数量，又能反映其激活程度，MPO与三种炎性细胞因子存在着明显的复相关关系，提示系其共同导致了白细胞激活和心肌内白细胞浸润，这也正与它们炎性因子的生物活性相吻合。细胞浸润的结果造成了：机械阻塞心肌内毛细血管；释放溶酶体酶；产生自由基；释放花生四烯酸代

15、谢产物；促进血小板聚集；产生更多的IL-1、TNF和PAF5，6。因而加速或促成心肌变性坏死，使MIS扩大。MIS与MPO呈密切正相关支持这种观点。已知Tet具有广泛的钙离子拮抗作用和较强的非特异性抗炎作用，可以有效地防治心肌缺血再灌注时的炎症反应，从而达到减轻心肌损伤、缩小MIS的效果。本研究结果显示，Tet能有效抑制IL-1、TNF、PAF的产生，减轻由此诱发的心肌炎性反应，使心肌内MPO含量明显下降，MIS缩小。体外细胞培养发现Tet对正常单核类白细胞分泌IL-1、TNF具有显著抑制作用7；而Tet对PAF的抑制功能，可能与其钙拮抗作用有关，因为细胞膜磷酯酶(PLA2)是合成PAF的关键

16、酶，而PLA2的激活是靠细胞内高浓度Ca2+来完成的。Tet和其它的钙调素(CaM)抑制剂一样，可通过抑制或竞争CaM机制，而降低CaM依赖性PLA2的活性，进而减少PAF合成8。Tet还可对抗PAF所致的细胞Ca2+内流而抑制其自分泌作用9，也能降低急性炎症期血管通透性，抑制中性粒细胞的激活、游走和溶酶体酶释放10，使缺血局部无菌性炎症降低到最低程度，从而缩小MIS。总之，Tet对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，机理除有与其已知的钙拮抗作用外，可能与抑制IL-1、TNF、PAF等炎性因子产生以及抑制白细胞游走激活、降低心肌内炎性细胞浸润和溶酶体酶释放等抗炎作用有关。 参考文献1罗武生，

17、郭兆，汤显良.缺血心肌嗜中性白细胞浸润及维帕拉米的保护作用.中国药理学报，1990，11：4352Engler RL.Free radical and granulocyte-media-ted injury during myocardial ischemia and reperfusion.Am J Cardiol,1989,63:193关怀敏，刘瑞云，张延荣，等.实验性AMI时IL-1的变化及其意义.中国危重病急救医学，1996，8：5184Spuadrito F,Saitta A,Altavilla D,et al.TNF in myocardial ischemla and reperfusion.Cardiologia,1993,38:455蒲岷综述.白细胞与心肌再灌注损伤，国外医学心血管疾病分册，1989，16：3216李晓辉，唐汝愚综述.白细胞与心肌梗塞的关系中国药理学报，1990，6：657Ferrante A,Seow WK,Rowan-Kelly B,et al.Tetrandrine,a plant alkaloid,inhibits the production of tumor necrosis