流式细胞仪的原理与应用2

1、焦焦 鹏鹏 流式细胞术流式细胞术(flow cytometry, FCM)是是2020世纪世纪7070年代发展起来的一种以流式细胞仪为年代发展起来的一种以流式细胞仪为工具，能快速测量细胞的物理或化学性质，工具，能快速测量细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、如大小、内部结构、DNADNA、RNARNA、蛋白质、抗、蛋白质、抗原等，并可对其分类、收集的高新技术。原等，并可对其分类、收集的高新技术。 流式细胞术（FCM）借鉴了荧光显微镜技术, 同时利用计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术的发展, 将荧光显微镜的激发光源改为激光, 使之具有更好的单色性与激发

2、效率, 因而大大提高了检测灵敏度, 同时将固定的标本台改为流动的单细胞悬液, 用计算机进行数据处理, 从而大大提高了检测速度与统计精确性, 而且从同一个细胞中可以同时测得多项参数, 被誉为是细胞分析领域的“CT”。 流式细胞术（FCM）以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。 流式细胞术流式细胞术 是一种能快速测量细胞的物理或化学性质的高技是一种能快速测量细胞的物理或化学性质的高技术。术。利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中利用流式细胞仪对处在快速、直

3、线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。与传统与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，优点， 成为当代最先进的细胞定量分析技术。成为当代最先进的细胞定量分析技术。6一流式细胞仪的原理一流式细胞仪的原理二流式细胞仪在生物医学中的应用二流式细胞仪在生物医学中的应用81973年世界第一台商用流式细胞仪年世界第一台商用流式细胞仪FACS I（Fluorescence Activated Cell

4、 Sorter）1980年中国第一台流式细胞仪年中国第一台流式细胞仪FACS II北师大北师大生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领域域流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理 待测样品制成待测样品制成单个细胞的悬液单个细胞的悬液，经特异性荧光染料对细胞（或表面抗，经特异性荧光染料对细胞（或表面抗原等）原等）染色染色后放入上样管中，在清洁气体的压力下将待测样品压入流动室，后放入上样管中，在清洁气体的压力下将待测样品压入流动室，与此同时，不含细胞的磷酸盐缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液与此同时，不含细胞的磷

5、酸盐缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照 在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。 10 前向角散

6、射，即前向角散射，即FSC，与细胞直径成正相关，所以我们平时上机的时与细胞直径成正相关，所以我们平时上机的时候，有时用候，有时用FSC做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。 侧向角散射，即侧向角散射，即SSC，是指与激光束正交是指与激光束正交90度方向的散射信号，它对度方向的散射信号，它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的信息信息 这两种信号同时被前向光电二极管和这两种信号同时被前向光电二极管和90方向的光电倍增管接收。前方向的光电倍增管接收。前向光散射信号在前向

7、小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的向光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小。大小。 荧光信号荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号荧光信号。 这些荧光信号的强度代表这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面了所测细胞膜表面抗原抗原的强度或其的强度或其核内物质核内物质的浓度。的浓度。11121314液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱15 另外，通过选择不同的单另外，通过选择不同的单克隆克隆抗体及荧光染料，我们抗体及

8、荧光染料，我们可以利用可以利用FCM同时测定一个细胞上的多种不同特征；同时测定一个细胞上的多种不同特征； 如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。究。 16应用范围应用范围凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞仪检测。仪检测。前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发激发在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机

9、多一机多用用的仪器。的仪器。17流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，可以每秒钟分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。其应用范围非常广泛，而且还在不断增加。当然，细胞分选也是它的重要应用之一。它能够根据每个细胞的光散射和荧光特征，将特定的细胞从细胞群体中分选出来。每次一个细胞。所以人们又常常将流式细胞仪称为荧光激活细胞分选仪（fluorescence-activated cell sorter, FACS）1819流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细

10、胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNARNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/ /胞浆胞浆/ /核的核的特异性抗原特异性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体20 1流式细胞仪的分析速度：流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测一般流式细胞仪每秒检测3000 6000个细胞个细胞, 大型机可达每秒几万个大型机可达每秒几万个细胞。细胞。 2流式细胞仪的荧光检测灵敏度：流式细胞仪的荧光检测灵敏度： 一般能测出单个细胞上一般能测出单个细胞上6

11、00个荧光分子个荧光分子, 两个细胞间的荧光差两个细胞间的荧光差5%即可区分。即可区分。3前向角散射光（前向角散射光（FSC）检测灵敏度：）检测灵敏度： 前向角散射光（前向角散射光（FSC）反映被测细胞的大小）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测一般流式细胞仪能够测量到量到0.2m.5m。211923经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波的光学

12、系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。长的荧光信号送入到不同的电子探测器。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。为了进一步使检测的发和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片滤片。带阻或带通滤片带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使是有选择性地使某一

13、滤长区段的光线滤除或通过。例如使用用525nm带通滤片只允许带通滤片只允许FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）异硫氰荧光素）发射的发射的525nm绿光通过。绿光通过。长长(短）波通过二向色性反射镜短）波通过二向色性反射镜只允许某一波长以只允许某一波长以上（下）的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫上（下）的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。或二向

14、色性分光器，来有效地将各种荧光分开。 光学系统光学系统24FACSCalibur 光路图25我中心检测型流式细胞仪：BD FACSCalibur激光：488nm,633nm常用荧光标记：FL1：GFP;CFSE;FITC;Alexa Flouro 488FL2：PE;PIFL3：7-AAD;PE-Cy5;PerCP;PerCP-Cy5.5;PE-Cy5.5;PE-Cy7FL4：APC; Alexa Flouro 647一般检测项目：细胞凋亡检测细胞周期检测细胞内活性氧检测细胞表面标记检测细胞内因子检测26=激光激光 (Laser)(Laser)=荧光素与荧光荧光素与荧光=FACSFACS检测的

15、信号参数检测的信号参数27激光激光-=激光激光 (Laser)(Laser)是一种相干光源，它能提供是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照单一波长、单一方向、同步的稳定光照=单色性好，方向性好，亮度高，可提高分单色性好，方向性好，亮度高，可提高分辨力辨力=激光波长激光波长: 488nm, 635nm: 488nm, 635nm细胞微弱荧光快速分析的理想光源细胞微弱荧光快速分析的理想光源28FACSCalibur的激光系统的激光系统=FITC Fluorescein isothiocyanateFITC Fluorescein isothiocyanate=PE Phycoe

16、rythrinPE Phycoerythrin=PerCP Peridinin chorophyllPerCP Peridinin chorophyll protein protein=APC AllophycocyaninAPC Allophycocyanin=PI PropidiumPI Propidium iodide iodide600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm457350514610 632488Common Laser Lines=荧光素标记特异抗体荧光素标记特异抗体=荧光素吸收激光能量，产生跃迁荧光素吸收激光能量，产生跃迁=回到基态，荧光素将吸收能量释

17、放，转换回到基态，荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能，释放较入射光波长更长为振动能和热能，释放较入射光波长更长的光量子的光量子=荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强光信号越强=双激光，两点激发，实现双激光，两点激发，实现4 4色荧光分析色荧光分析=最大程度地减少荧光信号之间的最大程度地减少荧光信号之间的补偿补偿，提，提高检测灵敏度高检测灵敏度=双激光的应用大大扩展了染料的选择范围，双激光的应用大大扩展了染料的选择范围，亦相应地扩大了仪器的应用领域亦相应地扩大了仪器的应用领域33 当细胞携带两种荧光素如当细胞携带两种荧光素如PEPE和和FITC

18、, FITC, 受激光激发而发射受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上，可选择滤片使每种荧出两种不同波长的荧光时，理论上，可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，的重叠，FITCFITC探测器会探测到少量的探测器会探测到少量的PEPE光谱，而光谱，而PEPE探测器探测器则检测到较多的则检测到较多的FITC

19、FITC光谱。克服这种误差的最有效方法是光谱。克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路使用荧光补偿电路光谱重叠的校正光谱重叠的校正343536=前向角散射光（前向角散射光（FSC, Forward ScatterFSC, Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射（侧向角散射（SSC, Side ScatterSSC, Side Scatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性细胞粒度及细胞内相对复杂性Right Angle Light Detector Cell ComplexityForward Light Detector Cell Surfa

20、ce AreaIncident Light Source38 FSC和和SSC两种信号都是来自于激光原光束，其波长与激光相同，目前两种信号都是来自于激光原光束，其波长与激光相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中单核细胞和粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。找出血小板和红细胞等细胞群体。 外周血细胞散射光双参数点图（裂解红细胞后）外周血细胞散射光双参数点图（裂解红细胞后）39 测

21、得的测得的FSFS与与SSSS信信号通过计算机处理，号通过计算机处理，可得到可得到FS-SSFS-SS图，由图，由此可仅用散射光信号此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进对未染色的活细胞进行分析或分选。行分析或分选。 此为血细胞分类此为血细胞分类的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群 使用不同荧光素标记不同单克隆抗体对细胞进行染色，做多色分析使用不同荧光素标记不同单克隆抗体对细胞进行染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了

22、细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量双色直接染色双色直接染色394043液流系统：流动室、液流驱动系统液流系统：流动室、液流驱动系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。 液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱流式细胞仪

23、的电子系统流式细胞仪的电子系统进行信号检测和分析进行信号检测和分析= 当细胞携带荧光素标记物当细胞携带荧光素标记物, ,通过激光照射区时通过激光照射区时, ,受到激发受到激发, , 产生不同波长的、代产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号表细胞内不同物质的荧光信号= 经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。 = 从从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。

24、 = 数字信号传送到计算机，计算机把所测量到的各种信号进行处理、储存、数字信号传送到计算机，计算机把所测量到的各种信号进行处理、储存、 作图、作图、 统计分析统计分析, ,将分析结果显示将分析结果显示 在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。=MacintoshiMacintoshi系统，灵活多样的图形处理能力系统，灵活多样的图形处理能力 目前公认的最佳图像处理系统,使流式细胞仪的功能发挥更加完美。 强大的软件支持，灵活方便的数据处理功能强大的软件支持

25、，灵活方便的数据处理功能=仪器自动校检软件仪器自动校检软件FACSCompFACSComp=主软件主软件CELLQuestCELLQuest=全面的自动化临床应用软件全面的自动化临床应用软件：淋巴细胞自动检测软件淋巴细胞自动检测软件SimulSETSimulSET；MultiSETMultiSET干细胞自动检测软件干细胞自动检测软件ProCOUNTProCOUNTHLA-B27HLA-B27； ModFITModFIT；47 根据分析目的不同，对制备好的样本在流式细胞仪上根据分析目的不同，对制备好的样本在流式细胞仪上测量其光散射和荧光强度。一般在测样本前先应用荧光标测量其光散射和荧光强度。一般

26、在测样本前先应用荧光标准微球校准仪器，多色分析准微球校准仪器，多色分析 时还应进行颜色补偿，以避免时还应进行颜色补偿，以避免多色荧光间信号的相互干扰。多色荧光间信号的相互干扰。 仪器校准后测量样本，每个细胞的光散射及荧光测量仪器校准后测量样本，每个细胞的光散射及荧光测量数据一般以列表或矩阵方数据一般以列表或矩阵方 式储存于计算机中，然后进行数式储存于计算机中，然后进行数据的显示、图象分析和结果统计处理，最终获得所分析细据的显示、图象分析和结果统计处理，最终获得所分析细胞的信息，也可在测定的同时进行结果分析。胞的信息，也可在测定的同时进行结果分析。 =数据存储数据存储: List Mode: L

27、ist ModeFSC SSC FL1 FL2Eventvent 210016024585Event 330065016072049 数据的显示数据的显示 储存的数据文件虽然易于加工、处理、分析，但由于数据大，储存的数据文件虽然易于加工、处理、分析，但由于数据大，又缺乏直观性，不利于观察各参数及其相互的关系。因此，将又缺乏直观性，不利于观察各参数及其相互的关系。因此，将数据用图形显数据用图形显 示更直观，然后再进行统计分析，这是示更直观，然后再进行统计分析，这是FCM结结果分析中最常用的分析方法。果分析中最常用的分析方法。FCM数据显示通常有一维直方图、数据显示通常有

28、一维直方图、二维点图、二维密度图、二维等高图、假三维图等。二维点图、二维密度图、二维等高图、假三维图等。50 由一维参数由一维参数( (散射光或荧光散射光或荧光) )与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。单参数直方图单参数直方图51单参数直方图单参数直方图细胞相对数量细胞相对数量荧光信号相对强度值（对数） 图中已根据阴性对照设定适当的“门”（直线门），仪器的计算机就会给出测定值（包括阳性细胞%和平均荧光强度） 52图中100101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞 53n双参数双参数散点

29、散点图：纵轴和横轴分别代表被测图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。就可以确定细胞在图上的表达位置。n双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。双参数散点图双参数散点图541.双参数散点图双参数散点图绿色荧光强度绿色荧光强度红色荧光强度红色荧光强度55双参数点图双参数点图562. 二维

30、等高图二维等高图n由类似地图上的等高线组成，其本质也是由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。双参数直方图。n等高图上每一条连续曲线上具有相同的细等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即胞相对或绝对数，即“等高等高”。n曲线层次越高曲线层次越高( (越里面的线越里面的线) ) 所代表的细胞所代表的细胞数愈多。数愈多。n等高线越密集则表示细胞数变化率越大。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。57=等高图和密度图分析等高图和密度图分析二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高

31、”。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。 583. 假三维等高图假三维等高图59三参数直方图三参数直方图三个荧光数据关系用分光图（prism）表示，分光图可直接给出8个数据（如用ABC代表3种荧光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。 60流式细胞计是对细胞进行自动分析和分流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重示悬

32、浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预设的参量范围把指定量，并可以根据预设的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。的细胞亚群从中分选出来。样品分选61细胞分选的原理当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自

33、的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 62流式细胞分选的特点1. 少量细胞分选时，流式细胞分选精确度高（99%以上），速度快。目前，先进的流式细胞仪的分选速度可达25 000个细胞/秒以上，比传统的分选速度提高了很多倍，原来需要一天的工作现在只需要几小时就能完成。不过流式细胞仪分离细胞的量还是有一定的限制，一次分离的最大合理量约为108个细胞。如果细胞量超过109个，则需要耗费10小时以上，分选后细胞的活力会受到很大的影响。2. 可以同时进行多个Marker分选，正选负选同时进行。以前的流式细胞仪只能给液滴充上正电荷或负电荷，因此在电场中只能向左或向右偏转，即两

34、路分选。现在的仪器可以给液滴充以不同的电量，从而调整液滴的偏转角度，实现多路分选。BD的FACSAria流式细胞仪就可以进行四路分选。633. 不仅仅限于表面抗原，流式细胞仪可以根据任何能检测到的发光度（如细胞体积）或荧光（如DNA、RNA或蛋白含量，酶活性，特异抗原）散射度差异来分离细胞。如果能保证流式细胞仪的无菌状态，那么分选后的细胞还可以进行培养或其他分析。4. 如果只是偶尔做几次细胞分选的话，用流式分选还是比较划算的，只需要准备样品和抗体，交纳一定的仪器使用费即可，不需要购买配套的设备。=数据处理系统数据处理系统MacintoshiMacintoshi系统系统=AutoloaderAu

35、toloader自动进样系统：自动进样系统： 4040管轮盘，软管轮盘，软件支持，简单易操作，真正实现无人操作件支持，简单易操作，真正实现无人操作=样本制备仪：样本制备仪：=免疫样本制备仪免疫样本制备仪=DNADNA样本制备仪样本制备仪666768大型机大型机 FACS Vantage SE FACS Vantage SE=多激光多波长多激光多波长=八特征参数八特征参数=设计灵活设计灵活=高速分选高速分选=单细胞点对点分选单细胞点对点分选69台式机台式机 FACSCalibur FACSCalibur=双激光：双激光：488nm/635nm488nm/635nm=四荧光六分析参数四荧光六分析参

36、数=自动化程度高自动化程度高=分析速度快分析速度快=灵活的设计灵活的设计=细胞分选系统细胞分选系统细胞富集系统细胞富集系统7071最简化的样本处理过程，很好地防生物污染最简化的样本处理过程，很好地防生物污染完善的自动采样，自动分析出报告系统，防人为因素干扰完善的自动采样，自动分析出报告系统，防人为因素干扰严格完整地质控及对照系统，确保结果的准确性，可靠性严格完整地质控及对照系统，确保结果的准确性，可靠性完善的完善的CD4CD4，CD8CD8，CD3CD3绝对计数系统绝对计数系统专为专为HIVHIV监测设计的经济普及型流式细胞仪监测设计的经济普及型流式细胞仪727374双激光五色七参数分析双激光

37、五色七参数分析自动补偿自动补偿Windows Windows 操作系统操作系统757677流式细胞术样本来源流式细胞术样本来源 流式样品的制备中应注意的几个问题流式样品的制备中应注意的几个问题荧光染色的步骤荧光染色的步骤=细胞悬液：细胞悬液：=培养细胞、细胞系培养细胞、细胞系=灌洗液、体腔积液灌洗液、体腔积液=分离分离PBMCPBMC、PRPPRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差定群体丢失，并可能引入某些误差=直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小本

38、用血量小=实体组织：实体组织：MedimachineMedimachine (Medimachine (Medimachine 系统是一套安全的系统是一套安全的, ,标准化的样本制备系统标准化的样本制备系统, ,可对植物或动物的实体组织进行自动机械分离可对植物或动物的实体组织进行自动机械分离 )=病理组织：新鲜样本病理组织：新鲜样本/ /石蜡包埋样本石蜡包埋样本=针吸组织：新鲜样本针吸组织：新鲜样本=鞘液、洗液、鞘液、洗液、PMAPMA等：清洁无颗粒杂质等：清洁无颗粒杂质808182838485合适？合适？8687荧光染色荧光染色染色步骤染色步骤v表面染色：细胞表面抗原抗体反应表面染色：细胞表

39、面抗原抗体反应v溶血溶血：溶解红细胞：溶解红细胞v破膜破膜：细胞膜打孔，使胞内染料渗入：细胞膜打孔，使胞内染料渗入v清洗：除去多余的染料及打孔剂清洗：除去多余的染料及打孔剂v胞内染色：细胞内抗原抗体反应胞内染色：细胞内抗原抗体反应v清洗：清洗：除去多余的染料除去多余的染料v固定：固定细胞，准备上机分析固定：固定细胞，准备上机分析88 样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞 悬液 标记荧光抗体检测表型测定细胞分选流式细胞术操作流程统计学 分析继续培养 FCM提供了一种简捷地监测细胞亚群的方法。即通提供了一种简捷地监测细胞亚群的方法。即通过荧光抗过荧光抗体体和抗和抗原原检测技术对淋巴细胞膜表面分化抗原

40、检测技术对淋巴细胞膜表面分化抗原(CD分子分子)、细胞分类和各亚群进行分析，并计算出淋巴、细胞分类和各亚群进行分析，并计算出淋巴细胞各亚群的百分比，从而对人体细胞免疫状态进行评细胞各亚群的百分比，从而对人体细胞免疫状态进行评估。在某些病毒性疾病的感染血液病、原发性和继发性估。在某些病毒性疾病的感染血液病、原发性和继发性免疫缺陷病、肿瘤的疗效观察和预后判断以及器官移植免疫缺陷病、肿瘤的疗效观察和预后判断以及器官移植的监测上起着重要的指导作用。的监测上起着重要的指导作用。 根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为B B淋巴细胞（淋巴细胞（CD19+CD19+），与体液免疫有关），与体液

41、免疫有关T T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+CD3+），与细胞免疫有关），与细胞免疫有关NKNK细胞（细胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能），行使免疫监控功能 根据根据CD4CD4、CD8CD8表达，表达，T T淋巴细胞又分为淋巴细胞又分为ThTh T T辅助辅助/ /诱导细胞（诱导细胞（CD3+CD4+CD3+CD4+）Ts TTs T抑制抑制/ /细胞毒性细胞细胞毒性细胞（CD3+CD8+CD3+CD8+）Th/TsTh/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLESLE） Th/TsTh/Ts降低：病毒感染、恶

42、性肿瘤、再生障碍性贫血降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血 了解在不同情况下体内免疫功能状态了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案监测、指导临床治疗方案 免疫系统疾病免疫系统疾病 免疫缺陷病，免疫缺陷病，AIDSAIDS 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免疫力检测肿瘤病人化疗后免疫力检测 样本使用样本使用EDTAEDTA抗凝全血，用血量抗凝全血，用血量600uL600uL 使用双色分析试剂使用双色分析试剂 使用

43、使用SimulSETSimulSET自动软件，进行样本的获取和分析自动软件，进行样本的获取和分析 SimulSETSimulSET软件自动做质量检查，帮助发现样本运软件自动做质量检查，帮助发现样本运输、处理等过程中造成的错误输、处理等过程中造成的错误 医生报告医生报告T T、B B、NKNK淋巴细胞及淋巴细胞及ThTh、TsTs百分含量百分含量和和ThTh / Ts / Ts比值，并报告参考值范围比值，并报告参考值范围=CD45/CD14 (LeucoGATECD45/CD14 (LeucoGATE) )：自动定义淋巴细：自动定义淋巴细胞的光散射门，并评估其有效性胞的光散射门，并评估其有效性=

44、IsotypeIsotype Control ( Control ( 1 1/ / 2a2a) )：阴性对照，确：阴性对照，确定定FL1FL1和和FL2FL2的非特异性结合水平，界定阴性的非特异性结合水平，界定阴性和阳性细胞群体和阳性细胞群体=CD3/CD19CD3/CD19：鉴别：鉴别T T淋巴细胞和淋巴细胞和B B淋巴细胞淋巴细胞=CD3/CD4CD3/CD4：鉴别：鉴别T T辅助辅助/ /诱导淋巴细胞诱导淋巴细胞=CD3/CD8CD3/CD8：鉴别：鉴别T T抑制抑制/ /毒性淋巴细胞毒性淋巴细胞=CD3/CD16+56CD3/CD16+56：鉴别：鉴别T T淋巴细胞和淋巴细胞和NKNK

45、细胞细胞97 CD45/CD14 LeucoGATECD45/CD14 LeucoGATE： Back-GatingBack-Gating，准确圈定淋巴细胞门，并，准确圈定淋巴细胞门，并评估门的有效性评估门的有效性 IsotypeIsotype Control ( Control ( 1 1/ / 2a2a) )： 阴性对照，确定阴性对照，确定FL1FL1和和FL2FL2的非特异性结合的非特异性结合水平，界定阴性和阳性细胞群体水平，界定阴性和阳性细胞群体 CD3/CD19CD3/CD19： 鉴别鉴别T T淋巴细胞和淋巴细胞和B B淋巴细胞淋巴细胞 CD3/CD4CD3/CD4： 鉴别鉴别T T

46、辅助辅助/ /诱导淋巴细胞诱导淋巴细胞=CD3/CD8CD3/CD8：=鉴别鉴别T T抑制抑制/ /毒性淋巴细胞毒性淋巴细胞 CD3/CD16+56CD3/CD16+56： 鉴别鉴别T T淋巴细胞和淋巴细胞和NKNK淋巴细淋巴细103BD SimulTEST IMK-Lymphocyte Kit (反反向设门法双色淋巴细向设门法双色淋巴细胞表型分析胞表型分析)健康中国人参考范围健康中国人参考范围（使用（使用SimunlSET自自动软件）动软件）项项 目目百分含量（百分含量（%淋淋巴细胞）巴细胞）Total B lymphocyte (CD19+) 5-18%NK cell (CD3-/CD16

47、+56+) 7-40%Total T lymphocyte (CD3+) 50-84%T helper/inducer cell (CD3+/CD4+) 27-51%T supressor/cytotoxic cell (CD3+/CD8+) 15-44%Th/Ts0.71-2.78=T T淋巴细胞总数减少淋巴细胞总数减少=T T细胞亚群比例倒置，细胞亚群比例倒置，Th/Ts1.0Th/Ts1.0=ThTh细胞细胞(CD4+(CD4+细胞细胞) )绝对计数绝对计数200200个个/ml/ml=TsTs细胞增高细胞增高=NKNK细胞减少或活力下降细胞减少或活力下降=B B细胞正常细胞正常68%3

48、.6%3.4%6.7%10%8.9% 凋亡（或程序性细胞死亡）是一个生理性的细胞自我毁灭凋亡（或程序性细胞死亡）是一个生理性的细胞自我毁灭的过程，在胚胎发育、生物体内环境的稳定及多细胞生物防御的过程，在胚胎发育、生物体内环境的稳定及多细胞生物防御外在及内在伤害方面均起着非常重要的作用。凋亡过程的紊乱，外在及内在伤害方面均起着非常重要的作用。凋亡过程的紊乱，可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性变及局部损伤等。能够诱发细胞凋亡疫性疾病、神经退行性变及局部损伤等。能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、能够引起染

49、色体损伤的药物、细胞自身的因素很多，如射线、能够引起染色体损伤的药物、细胞自身表达的一些受体分子等。表达的一些受体分子等。 细胞凋亡的主要检查手段细胞凋亡的主要检查手段形态学检查形态学检查LaddersLadders实验实验流式细胞仪检查流式细胞仪检查110n流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。由于流式细胞流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。由于流式细胞仪固有的特点仪固有的特点可以准确的进行凋亡细胞的计数。可以准确的进行凋亡细胞的计数。因此，具有其它方法无可比拟的优越性。因此，具有其它方法无可比拟的优越性。111线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司

50、出售的盒Apo-Alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧光染料。原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。可以在荧光显微镜下，或流式检测。采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。含量DNA周期检测原本是用来反应细胞各个期，即细胞增殖状况的。利用细胞内DNA能够和荧光染料，如PI结合的特性。细胞各个时期由于其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同，流式检测的荧光强度也不一样。G2M期DNA含量是G0G

51、1的两倍，而S期介于两者之间。但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少，因而可以在细胞G0G1期前面有一个亚二倍体峰，从而认为是凋亡细胞。但是由于死亡的细胞本身其DNA含量也是减少的，因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞。在90年代，该方法曾经风靡一时，现在看来，那时的实验结果需要推敲。尽管，经典的流式检测资料给出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着G0G1期峰的一个峰，死亡的细胞峰离G0G1期峰较远，但是这种典型的结果似乎很难获得。有其它的替代方法，完全可以不用这种方法。下图横轴代表PI的荧光强度，纵轴代表细胞数目，各个期根据荧光强度可以简单的进行区分。117 磷脂酰丝氨酸（磷脂酰丝氨酸（Phosphati

52、dylserine, PS）正常位于细胞膜的）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为是一种分子量为3536KD的的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结高亲和力特异性结合。将合。将Annexin-V进行荧光素（进行荧光素（FITC、PE）或）或biotin标记，以标标记，以标记了的记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微

53、镜可检测细胞凋亡的发生。可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与与PI匹配使用，就可以将匹配使用，就可以将正常细胞、凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开正常细胞、凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开磷脂酰丝氨酸外翻分析磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法法)联合联合PI法法118结果判断： 正常活细胞Annexin V 、

54、PI均低染； 凋亡早期细胞Annexin V高染、PI低染； 坏死细胞 、凋亡晚期Annexin V/PI均高染。119 应用价值：应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于外露早于DNA断裂发生，因此断裂发生，因此Annexin V联合联合PI染色法检测早期细胞凋亡染色法检测早期细胞凋亡较较TUNEL法更为灵法更为灵敏。又敏。又Annexin V联合联合PI染色不需固定细胞，可避免染色不需固定细胞，可避免PI染色染色检检测细胞凋亡时测细胞凋亡时因固定造成的细胞碎片过多及因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出法因固定出现的现的DNA片段丢失。因此，片段丢失。因此

55、，Annexin V联合联合PI法更加省时，结法更加省时，结果更为可靠果更为可靠。是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。 120121TUNEL法检测细胞凋亡实验原理法检测细胞凋亡实验原理 细胞凋亡中染色体细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然的大片段。然后大约后大约30 的染色体的染色体DNA在在Ca +和和Mg+依赖的核酸内切酶作用下，在核依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形

56、成小体单位之间被随机切断，形成180200bp核小体核小体DNA多聚体。多聚体。DNA双双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的的3-OH末端可在脱末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的的3-末端，末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介

57、导的缺口末端标记法（酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有没有DNA的断裂，因而没有的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。形成，很少能够被染色。 流式细胞仪最初的应用之一便是检测细胞的流式细胞仪最初的应用之一便是检测细胞的DNADNA含量，它含量，它可快速将细胞循环中的其它阶段与有丝分裂期区别开来。这可快速将细胞循环中的其它阶段与有丝分裂期区别开来。这些检测是基于对细胞内些检测是基于对细胞内DNADNA以化学定量方式的染色（染料着色以化学定量方式的染色（染料着色数量直接与细胞内数量直接与细胞内DNADNA含量相关）。有

58、相当多的对含量相关）。有相当多的对DNADNA有有高亲合力的染料可用于此应用。而不同的染料与高亲合力的染料可用于此应用。而不同的染料与DNADNA分子结分子结合的位点不同。合的位点不同。 当运用当运用DNADNA结合荧光染料后，经流式分析可观察到一个有结合荧光染料后，经流式分析可观察到一个有特征的图谱，那就是由各种细胞组成的一个细胞周期分布图。特征的图谱，那就是由各种细胞组成的一个细胞周期分布图。细胞周期细胞周期0 200 400 600 8001000DNA含量含量细细胞胞数数量量细胞周期中各个环节在流式细胞仪上分析时的图谱特征细胞周期中各个环节在流式细胞仪上分析时的图谱特征 流式细胞术流式

59、细胞术PI染色进行细胞周期分析的原理染色进行细胞周期分析的原理 PI ,即碘化丙锭即碘化丙锭 ,可以与细胞内可以与细胞内DNA和和RNA结合结合 ,采用采用RNA抑制剂将抑制剂将RNA消化后消化后 ,通过流式细胞术检测到的与通过流式细胞术检测到的与DNA结合的结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周含量的多少。由于细胞周期各时相的期各时相的DNA含量不同含量不同 ,通常正常细胞的通常正常细胞的G1 /G0期具有二倍期具有二倍体细胞的体细胞的DNA含量含量 (2N) ,而而G2 /M期具有四倍体细胞的期具有四倍体细胞的DNA含含量量 (4N) ,

60、而而S期的期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此含量介于二倍体和四倍体之间。因此 ,通通过流式细胞术过流式细胞术PI染色法对细胞内染色法对细胞内DNA含量进行检测时含量进行检测时 ,可以将可以将细胞周期各时相区分为细胞周期各时相区分为G1 /G0期期 ,S期和期和G2 /M期期 ,并可通过特殊并可通过特殊软件计算各时相的百分率。值得注意的是软件计算各时相的百分率。值得注意的是 ,PI不能通过细胞膜完不能通过细胞膜完整的细胞整的细胞当细胞没有进入分裂过程时（我们机体中的绝大部分细胞），当细胞没有进入分裂过程时（我们机体中的绝大部分细胞），它们处于细胞周期的它们处于细胞周期的G1G1期的位置上