发酵灭菌、染菌知识(理论篇)

1、发酵灭菌染菌理论培训v发酵灭菌篇发酵灭菌篇 1.基础知识2.发酵设备v发酵染菌篇1.基础知识2.染菌原因分析3.案例分析灭菌v生物化学工程是以活细胞或由细胞提取出来的酶为催化剂的反应过程 ,所以必须进行纯种培养 ,也就是只允许生产菌存在、生长和繁殖 ,不允许其他微生物共存。 1.1培养基灭菌v培养基灭菌是指杀灭培养基中具有生活能力的细菌营养体及其孢子 ,工业规模上的液体培养基灭菌比除去杂菌更为常用 ,其中热灭菌最为简便、有效和经济。微生物受热被杀死 ,主要原因是高热能使蛋白质变性。 1.1.1分批灭菌v分批灭菌也称实罐灭菌 ,全过程包括升温、保温、降温3 个阶段 v分批灭菌的温度随时间的变化过

2、程取决于加热方式、换热面积的大传热系数的高低、换热介质的温度、培养基的质量因素。v热阻v死亡活化能(E) 很明显，最不想死的是细菌孢子！v阿伦尼乌斯方程kAe-E/RT(式中A为指前因子;R为气体常数；T为热力学温度),以反应速率常数k表示的反应速率主要决定于反应活化能E,若催化使反应活化能降低E,则反应速率即提高e-E/RT倍。v试验证明 ,细菌孢子热死灭反应的E很高 ,而有些有效成分热破坏反应的E 较低,因而提高灭菌温度 T 会加快细菌孢子的死亡速率 ,从而缩短高温下的灭菌时间 ,由于其他有效成分的死亡活化能很低 ,温度提高只能稍微增大其热破坏程度 ,但灭菌时间显著缩短 ,其结果是有效成分

3、的破坏量反而大为减少。 1.1.2 连续灭菌v连续灭菌的加热、保温和冷却 3 个阶段分别在不同的专有设备中进行。 v板式热交换器连续灭菌装置的特点是单位体积的热交换器具有较高的传热面积 ,且可根据生产需要改变其换热面积的大小;蒸汽喷射连续灭菌装置的特点是加热、冷却极为短暂 ,缺点是培养基会被蒸汽的冷凝水稀释。下面是组合式1.2空气除菌v在发酵过程中 ,微生物的生长和繁殖需要大的氧气 ,这就需要输入大量的空气来提供氧气。气中的微生物多为细菌、细菌孢子 ,也有真菌、酵和病毒 ,其大小从几微米到几百微米不等 ,小的微生物附在空气中的灰尘上 ,灰尘的平均尺寸约为 0.1m。粗滤器可将粗的微粒除去 ,0

4、.52.0m 的粒及细菌微生物由空气过滤器除去。v过滤器1.2.1空气除菌方法v(1)加热灭菌。v(2)辐射灭菌。波长226.5328.7 nm的紫外v(3)化学灭菌。灭菌后续工作比较麻烦 v(4)静电除尘。 还是设备问题，效果很好v(5)介质过滤。 也就是过滤器1.2.2空气除菌流程2.1阀门的选用阀门的选用v发酵罐物料对输送阀门的要求甚严 ,既要保证运行时绝对不漏(否则将造成整批物料的染菌) ,同时又要承受定期蒸汽灭菌高温的影响。 常用阀门v截止阀 v针形阀 v旋塞阀 v球形阀 v手动隔膜阀 截止阀 v也叫球心阀，截阀。优点：密封面摩擦力小，耐用；严密性能好，易于开关，维修方便；开启高度可

5、以使用丝扣拉杆控制，易于调节流量；耐受高温及压力，不易损坏。缺点：截止阀阀芯阻力大，影响流量和流速；截止阀不易于在黏稠的物料中使用，这样回造成阀门的密封面不严密而泄漏；截止阀安装时有方向性，逆向安装会造成阻力更大，但在发酵罐的连接上，必须注意与发酵罐为正向，与管路流向为逆向安装。 针形阀 v一般是用来控制微量调节的小型阀门，它的一般通径有15mm和10mm两种。v优点：耐受高温、高压、不易腐蚀；易于控制微量流速和流加、滴加补料；操作方便，易于更换。缺点：易于损坏，尤其是阀头容易掉头；因为结构小，通道小，所以容易被堵塞。 旋塞阀 v也称考克，是一种不耐受高温和高压，但又易于操作的阀门。材质一般以

6、铸铁为主，这就决定了它不能耐受高温（一般要求小于等于100 ）和高压，不能猛力开关，以免扭断、变形。 球形阀 v也称球阀。特点：流体阻力小，流量大，极小有压差的表现；不受安装的方向性的制约；能耐受高温高压，耐腐蚀，严密性好，阀体本身不存在死角，结构简单，极少有渗漏点。缺点：不能做微量调节使用，最好是全开或全闭；尽管能耐受高温，也不要在长期高温管路上使用。 手动隔膜阀 v也称隔阀，它是依靠橡胶隔膜和聚四氟隔膜，通过手动拉杆的紧密压合而达到开启和密闭的。特点：流体阻力小，流速不受影响；可以在黏稠或有颗粒的介质上；介质不会于阀头部分接触，因此不存在阀头填料密封处泄漏的弊端；结构简单耐受腐蚀。缺点：除

7、特制的耐高温高压的隔膜阀外，一般的手动隔膜阀不耐受高温高压，一般公称压力在6Kgf/cm2 ，温度为80，最高耐受温度180；容易损坏，渗漏，变形；必须定期更换隔膜阀垫。 止回阀 v又称止逆阀、单向阀等。止回阀是依靠液体本身的动力自动启闭阀门，它的作用是阻止介质的逆向流动。 v特点：介质在阀体内单向流动，阻止介质倒流；耐受高温、高压，不易变形。缺点：不能使用在黏稠和有颗粒的物料介质上，因为止回阀的密封面一旦有黏稠物或有颗粒物的时候，止回阀就会失去单向的意义，起不到防止物料倒流的作用；不能使用在有腐蚀性介质的管路上。 2.2 空气过滤器膜的介绍（了解）空气过滤器膜的介绍（了解）v分离机理：气体

8、阻留、沉积、扩散、拦截、静电v膜材料：醋纤三醋纤、磺化聚砜、磺化聚醚砜、芳香聚酰胺、陶瓷v供应厂商：PAUL DH MILIPOR 上海过滤器厂 上海一鸣上海一鸣 杂菌的类型v空气中的微生物大多数是细菌和芽孢,还有一定数量的霉菌、酵母和病毒。细菌的大小有零点几微米至几个微米.v根据以上特点我们应得出如下结论：vA：这些微生物在空气中极少单独游离存在,基本上是附着于灰尘、液滴等微粒的表面上。vB：介质过滤除菌就是把空气中的各种微粒和极少量的游离微生物捕集起来予以除掉。v请问我们通常所用的空气过滤器是多少um的？为什么0.3u可以保证无菌发酵生产的原因。 1.2无菌检查与染菌的处理v在抗生素生产过

9、程中,为了及早发现染菌并进行恰当处理,保证生产正常进行,对菌种制备、种子罐、发酵罐的接种前后和培养过程中,须要按工艺规程要求按时取样，进行无菌检验。 无菌检查 v培养液是否污染杂菌可从三个方面进行分析：va:无菌试验（主要依据）vb:培养液的显微镜检查vc:培养液的生化指标变化情况。 无菌试验v现在采用的无菌试验方法有肉汤培养法、双碟培养法、斜面培养法。其中以酚红肉汤培养法和双碟培养法结合起来进行无菌检查用的较多。v无菌试验的结果一般需要812小时才能作出判断。为了缩短判断时间,有时向培养基中加入赤霉素、对氨基苯甲酸等生长激素以促进杂菌的生长 肉汤培养法 v 直接用装有酚红肉汤的无菌试管取样,

10、然后放入37恒温室(箱)内培养。定时观察试管内肉汤培养基的颜色变化,同时进行显微镜观察。 斜面培养法 v先用空白无菌试管取样,然后在无菌条件下接种于斜面培养基上,置于37恒温室(箱)内培养。定时观察有无杂菌菌落生长。 双碟培养法 v种子罐样品先取入肉汤培养基中,然后在无菌条件下在双碟培养基上面划线,剩下的肉汤培养物在恒温室(箱)内培养6小时后复划线一次,发酵罐培养液直接取入空白无菌试管中,于37下培养6小时后在双碟培养基上划线。24小时内的双碟定时在灯光下检查有无杂菌生长。24小时48小时的双碟1天检查一次,以防生长缓慢的杂菌漏检。正常生产过程中,种子罐和发酵罐每隔8小时取样一次,进行无菌检查

11、。该方法经常用于单菌落挑选，可以从染有杂菌的培养液中经多次划线挑取单菌落进行分离培养，得到纯种的种子 染菌的判断 v培养基的染菌判断是错综复杂的工作,又是一种细微观察、认真分析的王作。染菌罐的判断方法v以无菌试验中的酚红肉汤培养和双碟培养的反应为主,以镜检为辅。每个无菌样品的无菌试验，至少用2只酚红肉汤或斜面同时取样培养。要定量或用接种环蘸取法取样，公司现阶段基本都直接从发酵罐直接取样。因取样量不同,影响颜色反应和浑浊程度的观察。如果连续3个时间的酚红肉汤无菌样发生颜色变化或产生浑浊,或斜面连续3个时间样品长出杂菌即判断为染菌。有时酚红肉汤反应不明显,要结合镜检确认连续3个时间样品染菌，即判为

12、染菌。各级种子罐的染菌判断亦参照上述规定。v对肉汤和无菌斜面的观察及保存期的规定,发酵培养基灭菌后应取无菌样，以后每隔8小时取无菌样一次，直至放罐。无菌试验的肉汤和双碟应保存并观察至本罐批放罐后12小时，确认无杂菌污染后方可弃去。无菌检查时间应每6小时观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。染菌率的统计染菌率的统计 v以发酵罐染菌罐批(次)为基准, 染菌罐批(次)应包括染菌重消后的重复染菌的灌（批）次在内。发酵总过程(全周期)无论前期或后期染菌,均作“染菌”论处。v 发酵罐染菌罐批(次)v染菌率()X100%v 总投罐批(次)染菌后的处理 v污染杂菌的处理v发酵罐污染杂菌后,依据染菌时间、所

13、染杂菌的危害性及时进行处理,同时对所涉及的设备也要及时处理 v种子罐染菌后都不能往下道工序移种,要及时用高压蒸汽直接灭菌后经过滤处理放下水 发酵罐染菌的处理 v发酵罐前期染菌,污染的杂菌对产生菌的危害性大,采用蒸汽灭菌经过滤处理后放掉;如果危害性不大,可用重新灭菌、重新接种的方式处理,如营养成分消耗较多,可放掉部分培养液补入部分新培养基后进行灭菌,重新接种；如污染的杂菌量少且生长缓慢,可以继续运转下去,但要时刻注意杂菌数量和代谢的变化。在发酵的中后期染菌,一是加入适量的杀菌剂,如呋喃西林或某些抗生素,抑制杂菌的生长。二是降低培养温度或控制补料量来控制杂菌的生长速度。如果采用上述两种措施仍不见效

14、,就要考虑提前放罐 染菌后的设备处理 v 染菌后的罐体用甲醛等化学物质处理,再用蒸汽灭菌包括各种附属设备。在再次投料之前,要彻底清洗罐体、附件,同时进行严密程度检查,以防渗漏。染菌后的处理尤为重要，很多大面积染菌都是由于处理不彻底而造成的系统污染，造成无法及时处理好各个环节出现连续污染。 污染噬菌体的处理 v抗生素等产品发酵过程中有时出现噬菌体污染,轻者造成生产能力大幅度下降,重者造成停产。v一般噬菌体污染后往往出现发酵液突然转稀,泡沫增多,早期镜检发现菌体染色不均匀，在较短时间内菌体大量自溶,最后仅残留菌丝断片,平皿培养出现典型的噬菌斑,溶氧浓度回升提前,营养成分很少消耗,产物合成停止等现象

15、。v发酵过程中污染噬菌体后，一般做如下处理：1.发酵液用高压蒸汽灭菌后放掉,严防发酵液任意流失；2.全部停产,对环境进行全面的清洗和消毒,断绝噬菌体的寄生基础；3.更换生产菌种,不断筛选抗噬菌体菌种,防止噬菌体的重复污染。v污染烈性噬菌体时出现上述现象。如果污染温和噬菌体时,其反应温和,平皿培养不出现明显的噬菌斑,只出现部分菌体自溶,生化指标变化不显著,生产能力降低,对生产的危害亦是严重的,但不易被发现。防止温和噬菌体污染的方法同上所述。染菌原因分析染菌原因分析 v从染菌的规模和时间分析 v在发酵过程中,如果是种子罐和发酵罐同时大面积染菌,杂菌的主要来源可能是空气净化系统,如空气过滤器失效或空

16、气管道渗漏造成的。其次考虑种子制备工序。如果只是发酵罐大面积染菌,除考虑空气净化系统带菌外,还要重点考查接种管道、补料系统。发酵培养基采用连续灭菌工艺时,还要严格检查连消系统是否带入杂菌。v如果是部分发酵罐在发酵早期染菌,可能是培养基灭菌不彻底,或种子罐带菌,或接种管道灭菌不彻底造成的。如果是发酵的中后期染菌,重点分析补料系统和加消沫剂系统，个别发酵罐连续染菌,就从单个罐体查找杂菌来源,如罐内是否有“死角”或冷却系统有渗漏。当然还要检查附件,个别罐批的散在性染菌,其原因很难追查,要具体情 从杂菌类型分析 v发酵过程染菌,多种菌型出现的机率多,单菌型机率较少。染的是耐热芽孢杆菌时,这与培养基灭菌

17、不彻底或设备内部有“死角”关系甚大。空气中也存在芽孢杆菌,污染的杂菌是不耐热的球菌或杆菌时,可从空气净化系统和冷却系统进行追查。制服染菌的要点 v1.种子带菌或怀疑种子带菌 9.64 8.接种管穿孔。 0.29v2.接种时罐压降至大气压力 0.19 9.阀门泄漏 1.45v3.精养基消毒不透 0.791 10.搅拌轴封的泄漏 2.09v4.总空气系统带菌 l9.6 11.罐盖泄漏 l.54v5.泡沫升至罐顶 0.48 12.其它设备泄漏 10.13v6.央套穿孔 12.36 13.操作问题 l0.15v7.蛇管穿孔 5.89 14.原因不明 24.91v从上表可以看出的抗生素发酵染菌原因分析的

18、统计资料看,空气净化系统带菌是导致染菌的主要因素。但仔细分析,设备穿孔和渗漏等造成的染菌占33.85，占第1位。对空气净化系统的要求 v防止空气净化系统带菌的主要措施有提高空气进口的空气洁净度；除尽压缩空气中夹带的油和水,保持过滤介质的除菌效率。现在公空气系统应该有了很大的进步，不存在油的问题，但在夏秋两季，由于空气湿度较大可能出现预过滤器放出水的现象，因此各个车间应根据车间情况，定时放水。另外,在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻或烧灼,还要防止发酵液倒流入空气过滤器内。对设备的要求 v发酵罐及其附属设备应做到无“渗漏”,无“死角”。设备、管道等存在死角有以下几种可能：发酵设备由于如焊接等制作

19、不当引起的死角，管道安装不当造成的死角，罐底部堆积的固形物形成硬块从而包埋脏物，罐底的加强板长期受压缩空气顶吹而腐蚀受损或裂缝等造成灭菌不彻底的死角。所以凡与物料、空气、下水道连接的管件阀门应保证严密不漏,蛇管和夹层应定期试漏。连续灭菌设备要定时拆卸清洗。无菌操作室和菌种培养间定期消毒,以保持无菌状态。分析案例分析案例大观霉素 v大观霉素发酵生产的染菌率较低。个别发酵罐染菌后，生长代谢所受影响也较小，大多能正常周期放罐，发酵单位所受损失也不大。99年出现的几批染菌罐却表现出了很大异常：确定染菌后，发酵罐PH开始急剧下降，糖耗快，氨氮降低，发酵单位开始下滑，只能提前放罐。严重影响正常。本文从染菌

20、原因分析，给制服无菌提供了一个新思路，为国内抗生素生产厂家对制服染菌有借鉴作用。一：染菌特征v1：发酵罐培养至50小时左右，33小时后的无菌肉汤跟踪样开始变色，确认染菌。此后，发酵罐PH开始急剧下滑，糖耗快，氨氮下降，发酵单位停止增长，60小时左右提前放罐。v2：变色肉汤涂片镜检：短杆菌。v3：发酵液（周期60小时左右）涂片镜检：杆菌，已经形成芽孢。 二：杂菌分离、培养v1：把变色肉汤接入无菌红色肉汤，37恒温培养。24小时后肉汤变黄，表明这种菌代谢产生酸性物质。v2：向变色肉汤中加入2滴5M的NaOH溶液，摇匀（PH为10），放置10分钟。把该肉汤接入无菌肉汤，37恒温培养48小时，肉汤仍不

21、变色。说明这种杂菌对碱性环境的耐受性较差。v3：用细菌培养基对这种杂菌进行平板分离，杂菌菌落具有细菌菌落的典型特征。挑取单菌落接入肉汤，培养特征与直接从染菌罐接入的肉汤中的杂菌一致。镜检，杂菌呈短杆状，可观察到部分菌体进行二分裂繁殖。v4：把杂菌接入菌种效价跟踪用的发酵瓶，培养情况与发酵罐的代谢情况类似。v5：把杂菌接入空白发酵瓶，培养24小时后进行平板分离及肉汤检测，结果证明这种菌能在发酵瓶中存活、生长繁殖。由于发酵瓶和发酵罐的营养成分、培养条件一致，因此可以用发酵瓶来模拟杂菌在发酵罐中的生长情况。 三：杂菌耐热性实验v用牛肉膏蛋白胨液体培养基培养这种菌，吸取定量体积的菌液分别接入11支无菌

22、肉汤。取1支作对照，另10支每2支为1组，分别在100沸水浴中加热5分钟，10分钟，15分钟，20分钟，25分钟。37恒温培养24小时，只有加热25分钟的两支肉汤不变色。说明这种菌的耐热性较强。 四：染菌时间判断v把杂菌接入空白发酵瓶，在不同培养时间取样，进行平板菌落计数，计算出发酵瓶内的菌体数。该菌的繁殖方式为二分裂，根据培养时间和菌体数目的对应关系，可以计算出该菌在发酵瓶内繁殖一代所需的时间（代时）。v1：制备菌体稀释液（浓度约每毫升几百个）v从平板上挑取单菌落，按梯度稀释法制得菌体稀释液（约520个/毫升）。v2：代时的确定v吸取1毫升稀释液接入空白发酵瓶（30毫升培养基），发酵瓶培养条件与发酵罐培养条件保持一致。在不同时间取样，进行平板菌落计数。计算出对应的菌浓和菌体数，如下表。根据公式X2=X12（t2t1）/T, t2-t1=3.322Tlg（X2/X1）和上表数据，计算得到代时（T）约为1.1小时。其中，X1为时间t1时的菌体数量，X2为时间t2时的菌体数量，T为代时（繁殖一代所需的时间）。培养时间(小时) 取 样 量（毫升） 菌 落 数（个） 菌 浓（个/毫升） 菌 体 数(个 )00.516329601.50.5408024