-7人禽流感实验室检测技术方案

1、附7禽流感实验室检测技术方案 一、实验室网络设置实验室网络由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心和省级流感实验室两级组成。二、实验室条件及生物安全操作的要求1省级流感实验室实验条件及生物安全的操作要求1实验生物安全要求：安全级+BSL-2级+或安全级BSL-3级。2特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测、血清学检测中用到的血凝抑制实验HI可以在安全级+BSL-2级+实验室里操作。3特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测在安全级+BSL-2级+实验室的生物安全柜里提取病毒的核酸，进行病毒核酸检测的实验室要求请参照国家有关核酸检测要求的规定。4微量中和实验、特异性H5 的 RT-P

2、CR病毒核酸检测阳性的采样标本的病毒别离、尸检标本的检测必须在安全级BSL-3级实验室里操作。5省级流感实验室实验条件：具备进行禽流感相关临床标本初筛所需的生物安全柜、离心机、PCR仪、电泳仪、紫外线检测仪等配套设备。2国家流感中心实验生物安全要求：生物安全级+BSL-2级+和生物安全级BSL-3级实验室。3省级流感实验室职责1禽流感标本特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测；2禽流感H5的血清学检测工作; 3特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒别离必须在生物安全级BSL-3级实验室；4没有生物安全级BSL-3级实验室的，将标本送国家流感中心做病毒的别离工作。4国家流感中心

3、实验室职责1国家流感中心设立在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感室；2对各省报告的禽流感疑似病例或确诊病例进行复核、确认；3对不具备禽流感病毒别离条件的省份送检标本的检测、别离和确认；4对需要做微量中和实验的血清标本进行微量中和试验；5对各省级实验室检测人员的培训；6对各省级流感实验室的质量控制。三、原始标本采集1标本采集人员医疗机构的医生、护士或当地疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照禽流感职业暴露人员防护指导原则做好个人防护。2标本采集种类和时限1采集标本的种类：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物。（2） 采

4、集标本时间：1咽、鼻拭子或含漱液在发病的头3天采集；2急性期血清在发病后7天内采集，恢复期血清在发病后2-4周采集；3尸检标本尸检时采集。3标本的运送：所有采集的标本应在医院采集时立即分装，一式二份，其中一份单独保存，以备复核。采集的标本假设不能在24小时内送达，则应尽快在70 以下保存。无70 条件的需在20 冰箱短时间暂存，并尽快联系递送标本。4标本采集的方法：详见国标流行性感冒诊断标准及处理原则四、送流感中心的标本包装、运送与接收1标本的包装1标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧。2将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一份标本。3直接在塑料管上用油性记号笔

5、写明样本的种类、采样时间、编号、，同时也将标本有关信息填在禽流感人体标本送检登记表，连同塑料管用另一塑料袋密封。4将装标本的密封袋放入专用运输箱内或疫苗冷藏包，放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密封。假设将进行病毒别离，可将密封好的装有标本的容器直接放入液氮运输罐内运输。所有容器必须印有生物危险标识。2标本运送1航空或铁路运送。2专人专车运送：主要用于近距离样品运送。3标本的接收1各省级中心实验室应公布标本接收联系方式，并实行24小时标本接收制；2国家实验室标本接收：需送国家流感中心实验室检测的原始标本、病毒别离物

6、、可疑阳性标本、血清等，填写标本送检登记表，在低温保存条件下，于24小时内送至中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感中心进行复核。国家流感中心标本接收联系方式为：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，地址：北京市宣武区迎新街100号，联系人：郭元吉、王敏，联系 010-63581337， ：01063534632。五、标本检测方法1禽H5病毒核酸检测： 材料：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等。方法： RT-PCR，用于禽H5亚型流感病毒的快速检测、测序及排除工作试剂：特异性H5及甲型流感病毒的引物、病毒RNA 提取试剂盒、逆转

7、录酶、Taq DNA聚合酶等试剂, 建议使用德国QIAGEN的Rneasy Mini Kit (病毒核酸提取 ) 和QIAquick Gel Extraction KitPCR产物纯化产品。2病毒别离及鉴定：材料: 疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等。方法：采用鸡胚和MDCK细胞别离方法，血凝及血凝抑制试验HAI具体方法详见国标流行性感冒诊断标准及处理原则。经特异性H5 RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒别离及鉴定工作必须在安全级BSL-3级实验室里操作。试剂：鸡胚接种采用SPF鸡胚，MDCK细胞等。3疑似病例的血清学检测：材料：疑似病例的急性期和恢复期

8、的双份血清方法：血凝抑制实验具体方法详见国标流行性感冒诊断标准及处理原则。试剂：H5灭活病毒。4微量中和试验材料：疑似病例的急性期和恢复期的双份血清试剂：H5活病毒，必须在生物安全级 (BSL-3级)实验室里操作。六、检测结果确实认以下情况的原始标本及别离物送国家流感中心检测、复核、确认。1标本别离物血凝试验HA阳性，同时H5血凝抑制试验HI阴性，H5的RT-PCR检测阳性。2标本别离物血凝试验HA阳性，同时H5血凝抑制试验HI阳性或H5的RT-PCR检测阳性。3标本别离物血凝试验HA阳性，同时H5的RT-PCR检测阳性。4病人恢复期血清比急性期血清的H5抗体有4倍或以上增高。5标本别离物血凝

9、试验HA阳性，H5血凝抑制试验阴性，并已排除了是当前流行的甲、乙型毒株的可能。七、检测结果报告一般情况下, 实验室收到的样本立即进行实验，并于收到标本后24小时内出具RT-PCR检测报告，3-5天出具病毒别离培养结果，于别离到病毒后的3-5天出具流感病毒的血凝抑制结果，微量中和实验须3-5天完成。当实验过程中出现不可预测情况或意外事件，影响了按时出具报告时，应及时报告和说明。附件ICS GB中华人民共和国国家标准GB流行性感冒诊断标准及处理原则Diagnostic criteria and principles of management of influenza (报 批 稿)发布 实施国家

10、质量技术监督局发布目次前言31 范围42 诊断原则43 诊断标准44 处理原则5附录A 标准附录 病原学诊断方法5附录B标准附录 血清学诊断方法7附录C资料附录 红细胞凝集抑制试验8附录D资料附录神经氨酸酶活性抑制试验12附录E资料附录 对流免疫电泳及琼脂凝胶沉淀试验16附录F资料附录 流感快速诊断方法19GB前 言流行性感冒(简称流感)为一种人、禽、畜共患的病毒性急性传染病。流感病毒根据其核蛋白NP和M1蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常以流行形式出现，能引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，并也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒能引起流感局

11、部爆发，不会造成世界性流感大流行，至今除在人以外还能在海豹中别离到它。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，它也能感染猪。流感常突然发生，迅速蔓延，涉及面广，发病率和死亡率均高但病死率低。至今仍严重威胁着人的身心健康，甚至夺走性命，常给国民经济带来巨大损失，我国被世界公认为是流感的多发地。受卫生部传染病防治监督管理办公室委托，由郭元吉同志负责对流行性感冒诊断标准及处理原则GB15944-1995进行修改，其目的：把过时的，不适用的删除，加入适用新的内容。具体修改之处如下：1 前言中强调了流感为一种人、禽、畜共患病，同时考虑到禽流感病毒在人群中可引起的流感，其传播途

12、径不清楚，故把传播途径删除。2 诊断原则中增加了或从患者采集的标本中查到病毒颗粒特异的蛋白或特异核酸成分。3 实验室诊断中去掉白细胞计数指标，因该指标不能做为流感的试验诊断依据。4 附录A。病毒别离中，因甲型流感病毒“O”相特性的出现，故强调了细胞系统别离病毒的重要性；在HA测定中不应用鸡红细胞，而应用豚鼠或人的红细胞。5 把B3神经氨酸酶抑制试验改为附录D。把B3中不标准的一律改为当今国际上统一使用的方法。6 删除B2已过时，操作复杂，易受实验条件影响的“型特异性补体结合试验，改为附录E“对流免疫电泳”，同时考虑到对禽血清抗体测定时，常用琼脂凝胶沉淀试验。因此，在附录E中也加入后者的内容。7

13、 快速诊断为附录C改为附录F。同时加入FLU OIA Kit 和RT-PCR法。本标准的附录A和B是标准的附录。本标准的附录C-F是资料的附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所本标准主要修订人：郭元吉本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。中华人民共和国国家标准流行性感冒诊断标准及处理原则 GBDiagnostic criteria and principles of management of influenza1 范围本标准规定了流感的诊断标准及处理原则。本标准适用于各级医疗、卫生、保健机构和人员。对流感的

14、诊断，报告和处理的应用。2 诊断原则流感流行时一般可根据临床症状，结合流行病学资料可对患者作出初步诊断。如确诊则需要病毒别离阳性或病人双份血清抗体测定，其恢复期抗体滴度较急性期增高4倍或以上，或从患者采集的标本中查到病毒粒特异的蛋白或特异核酸成分。3 诊断标准31流行病学资料在流行季节一个单位或地区同时出现大量上呼吸道感染病人；或近期内本地区或邻近地区上呼吸道感染病人明显增多；或医院门诊呼吸道感染病人明显增多；或挨家挨户上呼吸道感染患者明显增多。32临床症状321 出现急起畏寒、高热、头痛、头晕、浑身酸痛、乏力等中毒症状。322 可伴有咽痛、干咳、流鼻涕等症状。323 少数病例有食欲减退、伴有

15、腹痛，腹胀、呕吐和腹泻等消化道症状。 33实验室诊断331 从病人鼻咽分泌物中可别离到流感病毒见附录A。332 患者恢复期血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期高4倍或以上见附录B。333 在患者呼吸道上皮细胞查到流感病毒颗粒特异的蛋白成份或特异的核酸见附录F。334 采集标本经敏感细胞将病毒增殖一代后，查到流感病毒粒特异的蛋白或特异的核酸见附录F。3 4病例分类341 疑似病例流感样病例 具备腋下体温38，加上其他临床症状两项或以上，或加3、1及胃肠道症状两项或以上。342 确诊病例疑似病例加3.3.1或3.3.2或3.3.3或3.3.4。4. 处理原则4.1 早期隔离病人,服抗流感病毒药物,对症

16、治疗和防并发症.早期发现病人,早期隔离(因地制宜,就地适当隔离)病人是重要的措施.对病人治疗一般采用对症疗法,发病早期(48小时内)可服用抗流感病毒药物,严重患者如严重肺炎,呼吸极度困难,高热不退等需住院治疗.防治并发症主要应防止流感病毒性肺炎和细菌性肺炎,尤其对年迈体衰者或伴有心血管,糖尿病,慢性呼吸道疾病者或婴幼儿等流感高危人群因他们由于流感本身或其它合并症可造成死亡,故应特别注意加强治疗护理. 4 2 预防措施一般采用综合性措施，讲究卫生，注意体格锻炼和营养，保持室内空气流通；对易感人群应采取相对隔离措施，如防止接触病人，不去公共场所等；对年迈和健康状态差，尤其带有慢性病的人必要时可采用

17、灭活疫苗接种，对疫苗过敏者或可能已被感染如密切接触病人者应及时服用抗流感病毒药物。 附录A标准附录 病原学诊断方法A1 病毒别离从疑似流感病人呼吸道采集标本别离病原体A2 标本的采集病毒别离成功与否很大程度上取决于采集标本的质量，时间应于发病的头3天，越早越好，及其保存运输等环节。标本主要取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物，有时也采用肺活检材料等。常用的采样液为：普通肉汤，pH 7.4-7.6的Hanks氏液或Eagle氏液或水解乳蛋白液。在采样液中需加入抗菌素，以往多用青、链霉素，近来发现不少种类细菌对它们具有耐药性，故近来多用庆大霉素其终浓度为每ml采样液中加入0.1 ml的

18、10mg/ ml和抗真菌素终浓度为每ml采样液中加入0.008 ml的250ug/ ml。A21标本采集方法A 221 鼻拭子 将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入4-5 ml采样液的管中，尾部弃去。然后，塞紧或盖好管盖。A222咽拭子 用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入4-5 ml采样液的管中，尾部弃去，塞紧或盖好管盖。 注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高别离率，减少工作 量。A223鼻咽抽取物或抽取气管和支气管分泌物 用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取气管和支气管分泌物。先将收集器头部插入鼻腔或气管

19、，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。近来国内有用小孩导尿管接在50 ml注射器上来替代收集器。A224漱口液 用10 ml采样液漱口。漱时让患者头部微后仰，发噢声，让洗液在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集漱液。 注：取漱口液时，需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史，如有，含漱液中不应含抗菌素。A225 肺活检材料肺活检组织在无菌条件下，用灭菌过的乳钵磨碎，用生理盐水配成20%悬液，2000rpm离心10min，取上清加入上述提到的抗菌素。A3 标本运送标本应在4条件下，尽快送至实验室。标本至实验室后，病毒别离标本应尽快进行接种别离，48h内能进行接种可

20、置4保存，如未能接种应置-70下保存。A4 标本处理 标本至实验室后，含棉拭子的标本，先将棉拭子在管壁反复挤压后取出。然后用干净灭过菌的毛细吸管反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液。置4待其自然沉淀5-10min。注：如采样液中尚未加抗菌素应补加之，所加的量同前，加完并混匀，置4 1-2h后方可用于接种。A5 接种与培养最常用的为细胞接种和鸡胚接种法，有条件的应两法并用。近来由于“O”相毒株的出现，MDCKMadin Dardy Canine Kidney等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。同时“O”相毒株几乎不凝集鸡红细胞，故近来在红细胞凝集和凝集抑制试验中常用豚鼠或人的“O”

21、型红细胞，而不用鸡的红细胞。A51 MDCK细胞接种和收获 成片的MDCK细胞弃生长液，用Hanks氏液洗两遍，将残余的牛血清洗净，每瓶加入接种标本0.5-1.0 ml，接种量要根据瓶的大小，一般2瓶/标本，轻晃细胞瓶，使标本完全覆盖细胞，置35吸附1-2h；倒掉感染液，再用Hanks氏液洗1-2遍，每瓶加入3 ml随瓶的大小而异维持液不含小牛血清，而含终浓度为2ug/ml胰酶的Eagle氏溶液，置35培养；次日起每天观察有无细胞病理变化CPE；当CPE出现+ +号时，即75%-100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可将细胞冻融1-2次以提高收获标本的病毒滴度。由于CPE不能证实就是流感病毒

22、所造成。最后还需检查维持液中是否有红细胞凝集活性HA，用毛细吸管取细胞维持液3-4滴，放入血凝板孔中，而后加入等容量的1%豚鼠或人红细胞，轻摇混匀，置室温或4，1h后观察结果。出现红细胞凝集的为阳性标本，收获所有的维持液进行病毒鉴定。 如收获的维持液HA滴度不高或量不够用于鉴定，需在MDCK细胞中传代，把HA滴度提高或量增加后，方可进行病毒鉴定。 如HA阴性，应在MDCK细胞上盲传一代，如HA仍阴性，可认为是阴性标本，弃之。注： CPE出现时间随感染病毒的型别，甚至毒株的差异以及感染量的大小而异。一般标本接种后7-10天还不出CPE，维持液中又查不出HA活性，基本上可认为阴性标本，弃之。同时要

23、注意MDCK细胞的代数，因随MDCK细胞代数增加，其对流感病毒的敏感性下降。A52鸡胚接种和收获取9-11日胚龄鸡胚，经羊膜腔和尿囊腔接种标本0.2 ml，每份标本接种3-4只胚，置33-35培养72h。然后将鸡胚置4过夜或置-20冰箱1h再置4数小时，分别收获尿囊液和羊水并检查HA活性用毛细吸管分别取3-4滴尿囊液和羊水，分别置大孔塑料板不同孔内，再加入3-4滴1 %豚鼠或人红细胞，摇匀后置室温或4 1h后观察结果。如HA为+ +时，再按系列倍比稀释测定HA滴度，如具有一定的HA滴度即可进行病毒鉴定。如HA阴性，可盲传一代，如HA仍为阴性则弃之。A6病毒鉴定至今对流感病毒鉴定最常用的方法为红

24、细胞凝集抑制HI测定，因该法简便易行，结果可信具体方法见附录C。其次为神经氨酸酶活性抑制NI测定具体方法见附录D。进行型鉴定时常用对流免疫电泳具体方法见附录E。附录B标准附录血清学诊断方法B1 血清标本采集血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集，一般不晚于发病后7天。恢复期血样则在发病后2-4周采集。单份血清一般不能用作诊断。血液标本2000-2500rpm离心15min。收集血清，弃血凝块。B2 血清标本运送和保存血清标本在4下运送，置-20下长期保存。B3 抗体测定测定用抗原一般为当前人群中流行的H3N2 和H1N1亚型及乙型流感病毒。测定方法为HI法见附录C。B4 结

25、果判断 凡恢复期血清抗体滴度比急性期增高4倍为阳性结果，其余的均为阴性结果。附录C资料附录红细胞凝集抑制试验C1原理流感病毒粒外表的血凝素HA蛋白，含有识别和结合宿主细胞外表受体的结构，能够与一些哺乳类动物和禽的红细胞发生凝集，这就是红细胞凝集现象。虽然多种哺乳动物和禽类的红细胞均能被流感病毒凝集，但目前应用最广的是豚鼠、鸡和人“O”型的红细胞。“O”相毒株是指只能在鸡胚羊膜腔或敏感细胞中生长，感染的羊水或细胞维持液只凝集人或豚鼠的红细胞，而几乎不凝集鸡的红细胞的流感毒株。这种毒株在鸡胚尿囊腔适应传代后，获得了在鸡胚尿囊腔复制的能力，同时还获得了对鸡红细胞凝集能力与人及豚鼠的一样好，这种生物学

26、特性发生改变的病毒为“D”相毒株。流感病毒能从凝集的红细胞外表释放下来，释放下来的病毒还能凝集新的红细胞，而被凝集和释放后的红细胞不能再被相同的病毒颗粒所凝集。于病毒悬液中加入特异性的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象出现，即为红细胞凝集抑制实验。目前，红细胞凝集和凝集抑制实验为流感各方面工作中应用最广泛的一种技术。C2实验器材C21 大孔或小孔塑料板C22 10ml或1ml 或1000ul和200ul或多排吸管C23 200ul和1000ul吸头C3试剂C31 0.85% 无菌生理盐水C32 Alsever氏液 葡萄糖 2.08g 柠檬酸钠 0.80 g 柠檬酸 0.055 g

27、 NaCl 0 .42g 加蒸馏水至 100ml 8磅20分钟高压灭菌，置4备用。C33 1% 红细胞悬液 以鸡红细胞为例：于10或20ml注射器中先吸入约3 ml 阿氏液Alsever's Solution，然后从鸡翅静脉或心脏采集，用生理盐水洗涤3次，前2次1500r/ min离心5min，最后1次同速度离心10min， 弃上清，用无菌生理盐水配成1%悬液，置4待用。一般置4能保存7天左右，一旦发生溶血应弃掉。C34受体破坏酶RDEC35 免疫血清或测定血清C4红细胞凝集实验C41 操作步骤C411 取一干净的大孔塑料板，标记所要测定的标本名称C412 于第一孔加入0.25ml1：

28、2开始稀释或0.4ml1：5开始稀释，从第二孔开始一律各加0.25ml 0.85%生理盐水。C413 如1：2开始稀释，于第一孔中加入0.25ml病毒悬液；如1：5开始稀释，于第一孔中加入0.1ml病毒悬液。用吸管吹打，使充分混匀，吸出0.25ml至第二孔，依次类推作倍比稀释，直至最后一孔，吹打后吸出0.25ml弃掉。C414 于每孔中加入0.25ml 生理盐水，然后再加入0.25ml 1% 红细胞悬液。相混后置室温或4 30-60min，而后观察结果。 注：如采用微量法，应用小孔塑料板和稀释枪，总量为75ul病毒25ul，25ul生理盐水和红细胞悬液25ul，其余同常量法。C42 观察结果

29、结果以+、+、+、+、±和 表示之。 一层红细胞均匀地铺于孔上者为+。 基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+。 红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为+。 红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为+。 红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动象人的眼泪滴样者为 。但用豚鼠或人“O”型红细胞时常见不到孔底形成一个小团和眼泪滴样结果出现。 “±”即为可疑，计算时以“”阴性处理。C43 红细胞凝集滴度计算 结果以+为终点，亦即一个凝集单位。也就是说最高稀释度病毒能引起+号的红细胞凝集为终点，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度，简称

30、血凝滴度。下面以表1为例，进行计算。表 红细胞凝集单位计算标本号病毒稀释度滴度备注1:101:201:401:801:1601:3201:6401:12801+480取均数2+560小1/83+640不必算4+800大1/45+640先整后算6+>1280或19207<10或7.5口诀：1 先整后算。表1中，1-4，6和7不必进行整理，而5中，必须将1：640处一个加号挪到1：320处为4个加号，而1：160处变成两个加号，然后再进行计算。2 两个加号不用算。如表1中的3，滴度为640。3 小，小本身的1/8。如表1中的2，1：640处仅一个加号，故血凝滴度一定小于640，应为64

31、0-640/8=560。4 大，大本身的1/4。同理4中血凝滴度一定大于640，应为640+640/4=800。5 两个极端取中间。如1，1：320为4个加号，1：640为阴性，应为320+640/2=480。C5红细胞凝集抑制实验C51操作步骤C511 血清中非特异抑制素的去除 受体破坏酶RDE处理法：1容量血清，加4容量RDE，37水浴1618h，然后，置56水浴50min(以破坏残余的RDE活性)；置4保存待用，勿冻存。经此法处理的人、鸡和山羊血清对甲、乙型流感病毒的非特异性抑制素均可完全去除。RDE处理对特异性抗体无影响。但有时经处理的血清对测定的红细胞有非特异性凝集。如发现时应在处理

32、后血清中加入终浓度为20%的浓的测定用红细胞，摇匀，置室温60min或4过夜，1000r/min离心5min，收存上清。对人血清抗体测定时，一般均经此步处理。C512 四个血凝单位抗原的制备 四个血凝单位计算：将血凝单位除以4，如表1中标本1，它的四个血凝单位应为：480/4=120，即将标本1进行1：120稀释时，其稀释液就是含四个血凝单位。配成后必须进行复核测定：取一块干净的大孔塑料板，在前三孔，也可任意连续的三孔，每孔加入0.25ml生理盐水，用一根1ml的吸管，取0.25ml四个血凝单位的抗原放入第一孔，倍比稀释至第三孔，吸出0.25ml弃之，然后每孔加入0.25 ml生理盐水，再加入

33、0.25ml 1%红细胞悬液，摇匀，置室温3060 min后，观察结果。正确结果，应第一孔出现+，第二孔+，第三孔阴性或+。如太大或太小都得重新配置。复核测定合格后，置4或冰上，当天使用。C513 血抑测定C5131 取一干净的塑料板，标明测定血清标本，最后一孔为血清对照孔。C5132 每孔加入0.25ml生理盐水。C5133 于第一孔和最后一孔中各加入0.25 ml经RDE处理过的血清，从第一孔起作倍比稀释至倒数第二孔，弃掉0.25ml。C5134 将最后一孔轻轻吹打后，亦弃掉0.25ml。C5135 于最后一孔加入0.25ml生理盐水，其余各孔一律加入0.25ml四个凝集单位抗原，轻轻摇匀

34、，置室温60 min。C5136 各孔加入0.25ml 1%的红细胞悬液，摇匀置室温30-60 min后观察结果。C5137 对照组 血清对照 血清0.25ml+生理盐水0.25ml 血凝素对照 分别加入4，2，1，1/2单位血凝素0.25ml+生理盐水0.25ml 红细胞对照 加生理盐水0.5ml 以上各对照组再分别加入1%的红细胞悬液0.25ml，摇匀，在同等条件下观察结果。C52 结果判断血凝的记录同血凝测定法，以能完全抑制红细胞凝集简称血抑的最高血清稀释度的倒数为血清抗体效价，即终点。以表2为例，加以说明。表2 血抑测定结果血清号血清稀释度效价1：101：201：401：801：160

35、1：3201：6401：12801+3202+2803+2404+2005+1606+320712808+<10或5 同样在计算抗体效价之前，应对结果进行整理，方法同前。如6中，必须把1：320处的一个加号移到1：640处，使1：320处变成“”，而1：640处变成“+”。 根据公式进行计算： X=Y+Y/4×Z X：血清效价 Y：能引起血凝全抑制最高血清稀释度的倒数 Z：4减去不能被抑制数全抑制高一个稀释度例如：2号血清效价：X=Y+Y/4×Z=160+160/4×4-1=280C53 交叉血抑测定和抗原比计算 为了确切了解抗原性变异的幅度，常用交叉血抑测

36、定进行抗原分析。测定中所用的免疫血清包括既往流行过的代表株和用新别离病毒制备的免疫血清。所用抗原都是和血清相应的同株抗原。每个抗原均必须准确调至四个单位，实验必须在同一条件下进行。 根据公式计算抗原比： R=r1·r2 r1=甲血清对乙抗原的血抑滴度/甲血清对甲抗原的血抑滴度 r2=乙血清对甲抗原的血抑滴度/乙血清对乙抗原的血抑滴度 R为抗原比，当R=1时，说明两株间抗原性相同；R<1.5/1或1/<1.5时，说明两毒株间抗原性无明显差异；R为1/1.51/2时说明两毒株的抗原性有小差异，R值越大，差异越大。附录D资料附录神经氨酸酶活性抑制试验D1反应原理：D11 自由的

37、N-乙酰神经氨酸N-acetylneuraminic acid经神经氨酸酶的作用，自胎球蛋白Fetuin底物中释放。D12 经过碘酸盐的氧化作用，将N-乙酰神经氨酸转化为ß-甲酰丙酮酸-formyl pyruvic acid 。D13 ß-甲酰丙酮酸经硫代巴比妥酸的作用形成生色团。D14 用有机溶剂提取生色团，便可用分光光度计测定之，这样可测知标本中神经氨酸酶活性，并可选择用于神经氨酸酶抑制试验的标准剂量。神经氨酸酶活性抑制实验是测定血清抑制标准量酶活性的效价。NI测定已成为流感病毒鉴定不可缺少的手段之一。因NI测定结果是流感病毒神经氨酸亚型划分的主要依据之一。有时该法也用

38、于了解流感病毒NA抗原性变异和血清诊断等方面。NI测定不受血清中非特异性抑制素的影响，但易受病毒粒血凝素抗体的影响即空间干扰。为解决这弊端，在流感病毒鉴定中，常使用单价血清只针对NA的或基因重配毒株所制备的免疫血清如使基因重配株NA抗原为N2或N1，其HA抗原为马1H7亚型的。D2 材料D21 试剂配制 D211 磷酸缓冲液甲液：400mmol/L 正磷酸氢二钠乙液：400mmol/L 正磷酸二氢钠丙液：60 mmol/L 氯化钙 甲液19 ml加乙液81 ml混之，将pH调至5.9±0.05，pH偏高用乙液调之，偏低用甲液调之。而后加入1 ml丙液，此时CaCl2的终浓度为6 mm

39、ol/L。置4或室温保存。注：常常加入CaCl2后，缓冲液出现沉淀，故我们一般不加它。甲、乙液为200 mmol/L。D212 胎球蛋白用蒸馏水把冰冻干燥的胎球蛋白配制成48-50mg/ml的溶液让其缓慢溶解。或将冰冻保存的胎球蛋白溶液用去离子水配成工作液。D213 过碘酸盐试剂428g过碘酸钠(NaIO4)溶于38ml去离子水中，加62 ml浓正磷酸，充分混合，存于带玻璃塞的棕色瓶中。D214 砷试剂10 g亚砷酸钠NaAsO4和7.1 g无水硫酸钠加去离子水至100 ml，混之，加0.3 ml浓硫酸，使之完全溶解。D215 硫代巴比妥酸试剂1.2 g硫代巴比妥酸和14.2 g无水硫酸钠加入

40、去离子水至200 ml，在沸水浴中加热溶解，用前新配，使用期为一周。D216 生理盐水 0.85g NaCl加入100 ml去离子水，溶解，置室温保存。D217酸化正丁醇试剂95ml正丁醇Butanol中加入5ml浓盐酸，存在带塞棕色瓶中置室温保存。D218 玻璃器材和煮锅等。D3 操作步骤D31 神经氨酸酶活性测定D311 病毒溶液用生理盐水作倍比稀释，一般新鲜尿囊液抗原作1：21：32稀释已足够。稀释好的病毒，每个稀释度加一管，0.05ml/管。于底物对照管中加入0.05ml生理盐水(不加病毒)。D312 于每管中加入0.05ml pH5.9的PBS(因流感病毒神经氨酸酶最适pH为5.9)

41、,每管中再加入0.1 ml胎蛋白溶液,充分混合后置37水浴16-18h。 注:加每样试剂均应送至管底;我们稀释病毒有时直接用200 mmol/L pH5.9的PBS,每管加0.1ml,这样做不正规,但操作方便，对测定结果影响不大;有些流感病毒株NA活性很高，于37水浴2-4h(与底物一起)就可测出酶活性.D313 从水浴中取出试管，放室温冷却，每管加入0.1ml过碘酸盐试剂，充分混合，置室温20 min这个时间要精确。D314 每管缓慢加入1ml砷试剂。由于碘的释放出现棕色，摇荡试管待棕色消失乳白色出现为止。必要时试验可在此步暂停，测定物置4冰箱保存。其余测定步骤一律不能暂停。D315 每管加

42、入2.5ml硫代巴比妥酸试剂，充分混合。该试剂在煮沸溶解时趁热加入管中。D316 立刻将试管置煮沸的水浴中煮15min，此时所出现的红色即为神经氨酸酶活性的反应。D317 将试管置冰水中冷却，然后加入4ml酸化正丁醇，塞上干净的胶皮塞，用手剧烈摇荡1-2min，使红色转到丁醇层。D318 1500r/min离心5min,上层到达透明不混浊。D319 将分光光度计波长调至549nm，用底物对照管调零点，而后，从高稀释度到低稀释度，将管中的上层溶液吸置透光池中，依次测出并记录它们的吸光度A值曾称光密度OD值，A值越高说明酶活性越强。D3110 一个酶单位确定：一般将A值为0.45-0.85的病毒稀

43、释度作为一个酶单位。我们常将A值为0.5的病毒稀释度为一个酶单位，用于酶活性抑制测定。一个酶单位确定方法如下：将上述测到的数据作直线回归，找出A值为0.5的病毒稀释度。但也可以下方法来确定：（1） 取一张半对数坐标纸，其纵轴对数表示病毒的稀释度，横轴算术表示吸光度。于吸光度值为0.5处画一条与纵轴平行的直线。（2） 将所得的A值一一标在相应的位置上，见图1示意图。（3） 在吸光值0.5附近找出4个点，其中2个点A值大于0.5，而另2个点小于0.5。在这4个点中找出一条直线，这条直线要使它一侧点至其垂直线的平均值与另一侧点到其垂直线的平均值相等。这条线与0.5的垂直线有一个交叉点图中X点。（4）

44、 从X点向纵轴线划一条与横坐标相平行的线图中虚线，这条线与纵坐标相交的点为Y。（5） Y点所示的数字如8，也就是说当测定病毒1：8稀释时就相当于一个酶单位。注：由于病毒鉴定时多为定性，一般做到步骤6D3.1.6已足够，接着可凭经验判断病毒所用的浓度；有些流感病毒株酶活性很低，经延长与底物孵育时间后仍很低，对这些毒株进行酶鉴定时，需灵活掌握，一般肉眼见到有一定的红色吸光度肯定小于0.5也就可以了。D32 神经氨酸酶活性抑制测定D321 测定血清作0.5Lg稀释一个0.5Lg稀释为1：3.16，它的近似值为1：3.2。具体稀释法举例如图2。稀释好的血清从高稀释度到低稀释度各取出0.05 ml于标好

45、相应稀释度的空管中.按同法做正常血清对照组。D322 将已测定的抗原用生理盐水配成一个酶单位，加入测定血清和对照血清中，0.05 ml/管。相混，37水浴孵育1h。D323 从水浴中取出试管，每管加入0.1 ml胎球蛋白溶液，混合，置37水浴16-18h。D324 从水浴取出，接着步骤同酶测定步骤3-9D3.1.3-D3.1.9。但吸上层溶液于透光池中，应从低稀释度血清到高稀释度血清。D325 计算血清对神经氨酸酶活性抑制效价：根据测定血清与正常血清两组的测定结果，求每组血清同一稀释度A值的商数，即为经血清作用后所剩的酶活性百分数。具体计算公式如下： 每一稀释度如1：10血清+病毒的A值 X

46、100% = %酶活性 同一稀释度1：10正常血清+病毒的A值D326 血清效价是能抑制50%酶活性的最高血清稀释度的倒数。它确实定方法如下：（1） 取一张半对数坐标纸，纵坐标对数表示血清稀释度，横坐标算术表示剩下神经氨酸酶活性的百分数。（2） 将“5”步骤D3.2.5所得的数放在坐标纸上应在的位置。如图3。3从酶活性剩余50%处划一条与纵坐标平行的直线，在50%酶活性处找出3-4个点，使其中1-2个点剩余酶活性不到50%，而其他1-2个点剩余酶活性大于50%，在这3-4个点间画一条直线，同样使这条直线一侧的1-2点至直线垂直线的平均值与另一侧的垂直线平均值相等。4从这条线与50%线相交处途中

47、x向纵坐标划一条与横坐标相平行线。这条线与纵坐标相交叉y处所表示的数字即为血清效价。如y处为1400，则该血清神经氨酸酶抑制效价为1：1400。当然也可用直线回归来计算。注：对流感病毒株鉴定时，我们对阳性血清常用200mmol/L pH5.9的PBS进行倍比稀释，一般从1：10开始，用量0.1ml/管，这样加上0.1ml抗原在加0.1ml底物，这时总量为0.3ml/管，与标准的0.2ml/管有出入，但对定性测定影响不大；正常对照血清用不同亚型或不同型免疫血清替代；结果常用肉眼判断，不测A值；至于血凝素抗体空间干扰问题，一般情况不加以重视，因它的干扰程度约为10%，我们所用的免疫血清血抑效价多为

48、1：640左右，这样当NI效价40时可判为阳性，一般就不受空间干扰影响了；当然对关键重要毒株鉴定时，需用单价的抗血清进行鉴定；在磷酸缓冲液中需加入终浓度为1的NaN3；Russ 等人曾报道用三硝基甲苯X-100Triton X-100，Yamane等人报道用多聚仙梨醇 Nonidet P40直接处理完整的病毒粒，就能排除空间干扰，根据我们的实践，这些方法效果不稳定。附录E资料附录对流免疫电泳及琼脂凝胶沉淀试验E1 对流免疫电泳 Counter- Immunoelectrophoresis E11 原理带电颗粒向着与它相反电荷的电极移动，称为“电泳”。胶体颗粒由于解离或吸附而使外表带电荷，在电场

49、中便发生移动。例如蛋白质由于有暴露在外表的极化基团，如-COO- 基和NH3+，在酸性溶液里-COO- 基和H+结合，生成不解离的-COOH，结果蛋白质分子外表的NH3+基过剩，使它带有正电荷；反之，在碱性溶液里，-OH-与-NH3+基作用生成H2O和不带电荷的-NH2基，结果，分子因-COO-基过剩而带负电荷。反应式如下： NH3+ NH3+在酸性条件下：蛋白质 +H+ 蛋白质 COO- COOH NH3+ NH2在碱性条件下：蛋白质 +OH- 蛋白质 +H2O COO- COO- 在某一特定pH时，蛋白质分子净电荷为零，这时的pH为该蛋白的等电点。在等电点的pH溶液中，蛋白质分子既不向正极也不向负极移动。根据