兔实验性心肌缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡的关系

1、壁剖堂盟窒坚至筮堑鲞箜！塑丛煎坠：咝：巡堑：！论著兔实验性心肌缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡的关系李国营刘靖田素民于连发郭志坤（新乡医学院解剖教研室，新乡）【摘要】目的探讨实验性心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞是否凋亡及凋亡率的大小。方法阻断左冠状动脉的左室支建立家兔心肌缺血模型，达到预定的缺血时间后，使血管再通，建立心肌的缺血再灌注模型。采用透射电镜、原位末端探针标记，图像分析，对缺血再灌注损伤区心肌细胞的损伤情况进行研究。结果电镜观察显示缺血再灌注损伤区呈现明显的心肌细胞凋亡征象，检测结果显示缺血再灌注损伤区出现心肌凋亡阳性细胞，平均凋亡率为。结论心肌缺血再灌注损伤的发生与凋亡机制有关，并可能是

2、其发生的重要原因。【关键词】缺血再灌注损伤；超微结构；凋亡；原位末端标记；兔蚴，劢疏酰伽删，瓜凡妇胱出划，西厶叫昭，厶皿，【】，】仃（，【】；近年来，临床上对心肌缺血性疾病的治疗取得亡机制发生的关系。了重要进展。如冠状动脉的搭桥术、溶栓疗法、心脏体循环方法的建立等，这些方法的应用使对心脏缺材料与方法血性疾病的治疗，提高到一个新的水平。所有这些家兔心肌缺血再灌注损伤模型的制备疗法使心脏经历了一个同样性质的过程，即缺血后选择雄性家兔只（雄性心脏表面沉积脂肪较恢复血流灌注。但是，理论研究和临床实践都证实，少动脉血管清晰易辨），体重，的氨基有时在成功恢复心脏血流，即心肌得到血液再灌注甲酸乙酯按耳缘静脉

3、麻醉。开胸暴露心后，不仅功能未得到恢复，反而使心肌损伤加重，出脏，保持胸膜腔完好，动物行自主呼吸（如伤胸膜腔现心率失常，梗塞面积扩大等，这就是心肌的缺血再行呼吸机替代）。找出左冠状动脉的左室支。眼科灌注损伤【，。这种损伤很难区别于缺血性损伤，或的针线缝扎左室支，内径为人们对持续的、严重的缺血导致心肌坏死没有疑义，的硅胶管套线，束紧后在贴紧硅胶管的上端用止血但在再灌注本身是否引起这种不可逆的致死性损害钳夹紧线，造成心肌缺血。心电图出现明显的段存有较大的争议【，。本研究旨在利用实验性心肌抬高（、导联）。缺血后，夹线钳松缺血再灌注损伤模型研究缺血再灌注损伤与心肌凋开，去掉硅胶管，抽出结扎线，原结扎血

4、管恢复再通，基金项目：河南省卫生厅资助课题（）缺血再灌注模型建立。再灌注后，剪取心脏，河南科技大学医学院解剖教研室在心肌缺轿再灌注损伤区取材，作为光镜、电脑和原生理教研室位末端标记材料。万方数据光镜标本处理多聚甲醛缓冲液固定，流水冲洗，蒸溜水浸洗。上行酒精脱水至，二甲苯透明、浸蜡包埋、常规切片、伊红染色、光镜观察。原位末端标记染色方法本实验所用凋亡检测试剂盒由德国公司提供。方法如下：（）常规石蜡组织切片（玻片须经防脱处理），脱蜡入水，洗×次。（）加的蛋白酶溶液于组织切片上，约片，孵育，洗次。（）用新鲜配制的覆盖切片，室温孵育，洗×次。（）加一枸缘酸钠混合液，孵育，洗

5、5;次。（）加反应液，片，湿盒孵育，洗×。（）用新鲜配制的覆盖切片，室温卵育，洗×次。（）加新鲜配制的显色液覆盖切片，室温下孵育。（）常规脱水、透明、封片、镜检，细胞核呈现棕褐色颗粒者，为染色阳性的凋亡细胞。阳性反应定量测定将反应切片经高清晰自动图像分析仪处理。取例样本中染色切片各张，每张随机选取两个视野，总计个视野，计算凋亡细胞总数。用同一部位染色组织切片在同一放大倍数下随机选取个视野计算出细胞总数，计算出细胞平均凋亡率（心肌凋亡细胞总数和心肌细胞总数的比）。超微结构观察（）瑚的组织块在的戊二醛磷酸缓冲液内固定，保存，冲洗。（）的锇酸缓冲液后固定，冲洗。（）酒精上行脱水至

6、，然后无水丙酮脱水×。（）树脂包埋，常规方法制备超薄切片，载膜铜网捞片，醋酸双氧铀和柠蒙酸铅双重染，日本一透射电镜观察拍照。结果染色光镜及电镜观察结果正常供血区心肌细胞染色及电镜观察显示正常心肌细胞的形态学特征。缺血再灌注损伤区可见核浓度、核变小。核膜皱缩、异形，有伪足样突起。染色质凝集成块，边集等典型的凋亡细胞特征（图万方数据堡型堂盟筮坚堡箜堑鲞筮！塑丛煎坠：螋：型堑：）。也可见染色质凝集不完全，核固缩，核异形等较轻型早期细胞凋亡的特征（图）。原位末端标记及定量结果缺血再灌注损伤区心肌可见染色阳性细胞，棕褐色的染色质凝聚明显，呈强阳性反应。有的整个细胞核都呈现棕褐色，有的沿核膜呈新

7、月形凝集，有的呈梭形或哑铃形凝集，有的显现不轨现凝集，体现了处于不同阶段的凋亡细胞的多形性（图、）。对染色切片的定量结果为：样本各取一张切片，每张随机选取个视野，总计个视野中凋亡细胞总数个，细胞总数个，平均凋亡率为。正常供血区及本实验所做的对照实验显示为阴性。讨论持续性的心肌缺血可导致心肌坏死，并可进一步导致心力衰竭和死亡。限制和解除心肌缺血性疾病最有效方法是恢复血流灌注，但再灌注本身也会引起心肌的损害。目前理论研究和临床实践都证实了缺血再灌注损伤的存在，但在再灌注本身是否会引起这种致死性损害，以及再灌注损伤的机制等方面存有较大的争议【。本实验通过建立心肌缺血再灌注模型，利用透射电镜、原位末端

8、标记技术、自动图像分析仪及统计处理对缺血再灌注损伤区心肌进行研究。结果显示，缺血再灌注损伤区心肌细胞有核浓缩、核变小、核膜皱缩、染色质凝集成快的典型凋亡细胞的特征。也有核膜轻度异形，细胞染色质凝聚不完全，部分已凝聚的染色质嗜碱性增强，核固缩不明显等心肌细胞凋亡早期的征象。原位末端标记显示该区有较多的染色阳性细胞，凋亡率为。这说明在心肌缺血一定的时间后，给予血流再灌注，诱导了心肌细胞凋亡的发生。这可能是由于再灌注后虽然心肌得到了氧的供应，但增加了氧自由基的形成，也加重了钙离子的超载，从而触发了心肌细胞凋亡的始发环节及核酸内切酶激活途径。内源性的核酸内切酶将核小体间降解，使之断裂为寡核小体产生了不

9、同倍数的碱基对核酸片段，并表现为断裂的染色质凝聚，边集帕娟。因而在缺血再灌注损伤的病理损害表现为凋亡细胞的特征，这与单纯的心肌缺轿性损伤机制不同旧。这说明心肌的缺血再灌注损伤是在心肌缺血性损伤的基础上又诱发了心肌细胞凋亡的发生机制，产生了心肌凋亡细胞。并可能是心肌缺血后再灌注产生继发堡麴堂煎塞！丝生筮堑鲞箜！塑丛堕堕：避：坝堑：！性损伤也即缺血再灌注损伤的主要原因。正常供血区心肌组织的光、电镜结构正常，原位末端标记检测未见阳性细胞。这说明在缺血再灌注血管所支配区域以外的心肌组织由于存在正常的血液循环而未受模型制备的影响，这说明了模型制备及实验结果的有效性和可靠性。本实验研究利用缺血再灌注损伤模

10、型，应用透射电镜、原位末端标记、图像分析和统计处理对缺血，：，：，：，：，再灌注损伤区的心肌凋亡情况进行了定性和定量研、究，从超微结构和原位末端标记两方面证实了缺血再灌注损伤时存在心肌细胞的凋亡现象，这也证明心肌细胞凋亡机制参与了缺血再灌注损伤。这对进，：一步研究缺血再灌注损伤的发生机制和治疗心肌缺血性损伤时预防再灌注损伤的发生具有重要的理论和实践意义。（本文图见图版）参考文献冯新为主编病理生理学北京：人民卫生出版社，：，：，：肛，：（收稿日期：）图版说明图缺血再灌注再灌注中心区心肌组织超微结构图缺血再灌注再灌注交界区心肌组织超微结构××图缺血再灌注再灌注中心区心肌组织，染色图缺血再灌注再灌注交界区心肌组织，染色×（上接页）在数量还是在神经元总面积上都比参考文献出），的表达更多，说明背根神经节神经元含有较为丰富的通道，可能是其对保持神经元细胞膜内外浓度的差异有重要的作用。在正常状态下通道的开放，使神经元细胞膜主要对有通透性，所以，通道可能是产生和维持背根神经节神经元静息电位的形态学结构基础。背根神经节是通过怎样的途径使和型钾通道开放？钾通道开放以后又通过什么具体途径导致背根神经节产生和外周传人相关的物质？这些工作的完成，将全面揭示和型钾通道在外周传人过程中的作用。我们的实验为外周传人机制的