骨髓间充质干细胞体内定向诱导分化与治疗肝功能损伤的实验研究_图文

1、骨髓间充质干细胞体内定向诱导分化与治疗肝功能损伤 的实验研究 1陆海华,滕皋军,居胜红,孙军辉,李爱梅,张爱凤东南大学附属中大医院放射科,分子影像实验室 南京(210009E-mail :摘 要:目的 观察骨髓间充质干细胞 ( Mesenchymal Stem Cells, MSCs 在肝脏特定微环境下是否 向具肝细胞表型与功能的细胞横向分化 (transdifferentiation并探讨其治疗肝功能损伤的可行性。 方法 20只裸小鼠 , 随机分为四组 , 每组 5只 :A组 : CCl4与橄榄油 1:1混合,按 1ml/kg腹腔注射, 每周两次。一周后经尾静脉移植 1×106 G

2、FP阳性 MSCs ,术后继续注射 CCl4,每周 2次; B 组: CCL4注射同 A 组,经尾静脉注入等量生理盐水; C 组:正常小鼠,细胞移植同 A 组; D 组:正 常对照。术后 4 周处死全部受试动物 , 血清检测肝功能 , HE、 Masson 染色行组织学观察,双荧光 染色确认 GFP 阳性细胞并观察其是否表达肝细胞特异性蛋白。 结果 A 、 B 组受体肝纤维组织增 生显示肝功能损伤模型制作成功,二组胶原分布百分比并无明显差异(10.5±1.5 vs. 12.7±1.6, t = -2.238, P >0.05 。 A 组镜下可见 GFP 阳性细胞主要分

3、布于汇管区 (portal area及小叶间隔周围 , 部 分同时表达白蛋白(35±7% ;B 、 C 、 D 组镜下均未见绿色荧光细胞。 A 组白蛋白水平明显高于 B 组(24.4±3.3 vs. 18.6±2.9, P <0.05 ,两组 ALT 水平亦有统计学差异 (121.2±20.8 vs. 191.8±28.9, P<0.05。 结论 持续肝功能损伤可以有效诱导 MSCs 向肝迁移增殖,部分 MSCs 在肝细胞持续损 伤的微环境下有向肝样细胞 (hepatocyte-like cells横向分化的潜能, MSCs移植可以

4、在一定程度上 修复受损肝功能。关键词:间充质干细胞 ; 移植 ; 肝功能损伤 ; 横向分化与原位肝移植(orthotopic liver transplantation, OLT 相比,肝细胞移植(hepatocyte transplantation , HCT 操作简单,费用低廉,风险小。 HCT 不仅可以作为原位肝移植手术前的一 种过渡疗法,在逆转急性肝功能衰竭及治疗代谢缺陷性肝病等方面也显示了巨大的潜力。细胞来源是目前制约 HCT 临床应用的关键问题。 成年肝细胞植入受体后长期存活和增殖困难, 只能提供暂时的功能支持。胎肝细胞增殖能力旺盛,免疫源性低,耐受低温储存,但其来源受到限制。骨髓

5、源性肝干细胞(bone marrow-derived hepatocytestem cells,BDHSC 因其取材方便,自体来源无免疫排斥,能在体外扩增并进行基因修饰,在肝细胞移 植领域显示了广阔的应用前景本实验拟分离培养绿色荧光蛋白小鼠 (green fluorescent protein-expressingmouse,GFP-expressing mouse骨髓间充质干细胞 (mesenchyal stem cells,MSCs,植入经四氯化碳 (carbon tetrachloride,CCl4 诱导肝功能损伤的裸小鼠体内 , 观察移植细胞在受体肝组织内分布、 增 殖与分化 , 及肝

6、功能恢复状况 , 为临床应用提供理论依据。1. 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物:绿色荧光蛋白小鼠 , 遗传背景 C57BL/6,本校分子遗传中心提供,一月龄,体重 18-22g, 雌雄不限。 Balb/c裸小鼠,购自上海实验动物中心,鼠龄 5-6周,体重 20g 左右,雌雄不限, 饲养于 SPF 级动物房,室温 25 ±2 ,无菌饲料与水自由饮用。1.1.2 主要试剂和仪器:DMEM 培养液(Dulbecco , s Modified Eagle, s Medium (美国 GIBCO 公司 , 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所 , Percoll 分离液(美国 Pha

7、rmarcia 公司 ,胰酶(Trypsin (美国 AMRESCO 公司 , 四氯化碳 (CCl4(上海试剂三厂 ,兔抗鼠白蛋白多克隆抗体 (丹麦 DAKO 公司,兔抗 GFP 多克隆抗体(美国 eBioscience 公司 ,Cy3标记羊抗兔 IgG(美国 CALTAG LABORATORIES,Masson三色试剂盒 (福州迈新公司 。 CO 2培养箱(德国 HERABUS 公 司 ,荧光倒置相差显微镜与激光扫描共聚焦显微镜(德国 Zeiss 公司 , 冰冻切片机(德国 Leica 公 司 , 全自动生化分析仪(美国 Beckman 公司 。1.2 方法1.2.1 GFP(green f

8、luorescent protein阳性 MSCs 分离、培养和传代:断颈处死绿色荧光蛋白小 鼠,无菌条件下取出股骨与胫骨, DMEM 培养液冲洗出骨髓,密度梯度离心获得单个核细胞,加 入含 10%胎牛血清的低糖 DMEM 培养液, 调节细胞浓度至 1×106/ml, 接种于 25cm 2培养瓶内, 5 %CO 2、 37 培养箱中培养, 3天后首次换液,以后每隔 3-4天换液 1次,待贴壁细胞长满至 80 %左右时,以 0.25%胰蛋白酶消化, 1 2传代后继续培养。培养过程中倒置相差显微镜动态观察 细胞。1.2.2. 小鼠肝功能损伤模型的制备与细胞移植:20只裸小鼠, 随机分为

9、4组, 每组 5只。 A 组: CCl 4与橄榄油 1:1混合,按 1ml/kg腹腔注射,每周两次。一周后经尾静脉以 27G 针头注入第三 代 GFP 阳性 MSCs 悬液(200µl,约含 1×106个细胞 ,术后继续注射 CCl 4,每周 2次; B 组:经尾 静脉注入等量生理盐水, CCL 4注射同前; C 组:细胞移植同 A ,但手术前后未加任何药物干预; D 组:正常对照,未作任何处理。 。1.2.3 标本准备:术后四周, 受试小鼠戊巴比妥钠麻醉, 后眼眶静脉丛采血待测。 剪开胸腹腔, 经左心室生理盐水灌注冲洗血细胞直至肝脏发白, 再以 4%多聚甲醛灌注固定, 剪

10、取各叶肝组织制 成约 3mm 厚组织块继续浸泡于 4%多聚甲醛中固定 12小时。取部分组织块石蜡包埋切片 , 余再用 30%蔗糖 PBS 溶液浸泡三天, PBS 洗涤后将组织用 OCT 包埋剂包埋, 置于液氮罐中 10-30秒冻结 成块,冰冻切片机内放置片刻切片(片厚 10µm 。1.2.4 HE染色:石蜡切片脱蜡水化, Harris 苏木素染液染核, 1%盐酸酒精分化数秒;再以伊 红复染后逐级脱水、透明及封固。1.2.5 Masson染色:石蜡切片脱蜡水化,滴加 Masson 复合染色液 100µl,室温 5分钟;滴加 磷钼酸溶液 100µl,室温 5分钟;滴加

11、苯胺蓝溶液 100µl,室温 5分钟;蒸馏水轻轻冲洗后滴加分 化液分化 30-60秒,逐级脱水、透明及封固。光学显微镜下观察照相, A 、 B 两组各随机选取 50个视野 (×400,利用 Simple PCI图像分析系统软件计算胶原分布百分比。1.2.6免疫荧光染色:冰冻切片常温干燥 30min , PBS 洗, 2min×3次; 5%正常山羊血清封闭, 室温, 10min ;倾去后一部分切片滴加兔抗 GFP 多克隆抗体, 1:500;其余滴加兔抗鼠白蛋白多 克隆抗体, 1:500; 4 过夜, PBS 洗, 2min×3次;弱光下滴加二抗(Cy3标记

12、羊抗兔 IgG , 1: 100, 37 , 30min ; PBS 充分冲洗, 50%缓冲甘油封片,激光扫描共聚焦显微镜下观察照相, 利用 Simple PCI图像分析系统软件计数阳性细胞。1.2.7 血清肝功能检测:主要指标包括白蛋白 (Albumin,谷丙转氨酶(ALT ,谷草转氨酶 (AST 。1.2.8 统计分析:数据用 SPSS11.5处理,结果以均数 ±标准差表示。 A 、 B 两组胶原分布百分比 均数比较采用 Independent-Sample T Test;本实验中尽管每组仅有 5只动物,但各组血清肝功能指 标未出现明显极端值, 且符合方差齐性要求, 故均数比较采

13、用 one-way ANOVO中的 SNK 法, P 0.05认为有显著性差异。2. 结果2.1 体外细胞形态学观察原代培养 72小时后首次换液即可见到贴壁的纺锤状细胞, 4天左右形成克隆。传代后分布均 匀,密集生长的细胞两极常有规律地排列成束状,折光性强(图 1a 。荧光镜下观察可见贴壁细 胞均发出明亮的绿色荧光,以胞核为著(图 1b 。2.2 组织学观察HE 染色 A 组镜下沿汇管区或门静脉小分支可见大量类圆形,胞质少 , 核大而深染的细胞散在 或多个聚集呈克隆样增生(图 2a ,而 B 组镜下此类细胞少见(图 2b 。 C 、 D 组未有上述发现。 A 、 B 组 Masson 染色显示

14、肝小叶大量纤维间隔形成,提示动物模型制作成功。二组胶原分布 百分比并无明显差异(10.5±1.5 vs. 12.7±1.6, t =-2.238, P >0.05 (图 3a 、 b 。2.3 双免疫荧光染色含 GFP 细胞呈绿色荧光,抗 GFP 与抗鼠白蛋白间接免疫荧光染色阳性均呈红色荧光,细胞同时 表达两种荧光者,在激光扫描共聚焦显微镜下叠加呈现黄色荧光。 A 组镜下可见:绿色荧光细胞主要 分布于汇管区 (portal area及小叶间隔周围,接近圆形,直径 20µm左右,双荧光标记使移植细胞进一 步得到确认(图 4a 、 b 、 c 。部分 GFP 阳

15、性细胞同时表达白蛋白(图 4d 、 e 、 f :随机观察 100个 视野 (×400,每个视野均以汇管区为中心 , 平均每个视野约见 11±3个 GFP 阳性细胞 , 其中同时表达白蛋 白的比率为 35±7%。尽管 C 组与 A 组一样移植了 GFP 阳性 MSCs ,但其镜下所见与 B 、 D 组相似, 肝内均未发现绿色荧光细胞存在(图 4g 、 h 、 y 。2.4 血清肝功能检测A 、 B 组受试小鼠血液生化指标较之 D 组均有明显改变 ( P < 0.05 。A 组白蛋白水平明显高于 B 组(P <0.05 ,两组 ALT 水平亦有统计学差异

16、(P <0.05 ,而 AST 水平无明显差异 (P>0.05.(详见表 1 。3. 讨论1999年 Petersen 1首先发现:骨髓中存在肝细胞的前体细胞。 Lagasse 2等将成年骨髓细胞植入患 有先天性 I 型高酪氨酸血症的 FAH 缺陷小鼠体内 , 受试小鼠生长状况良好 , 肝脏生化功能基本恢复 , 并 进一步证明 :只有经过严格筛选即 c-kit high Thy low Lin Sca-1+(KTLS的造血干细胞 (hematopoietic stem cells,HSCs 才能分化为肝细胞。 Avital 3的研究表明:从人和大鼠的骨髓中分离出的 2m -/Thy

17、-1+细胞 能够稳定表达肝细胞特异基因和功能。 Schwartz4则描述了骨髓中一种多能成体干胞 :MAPCs(muitipotent adult progenitor cells,经成纤维细胞生长因子 -4(fibroblast growthfactor-4,FGF-4 和肝细胞生长因子 ( hepatocyte growth factor,HGF诱导分化为肝样细胞的过程。也有 一些学者认为所谓骨髓干细胞跨胚层向肝样细胞的横向分化 (transdifferentiation仅仅是细胞融合的 结果 5, 6。骨髓肝干 /祖细胞的起源究竟为何 ? 骨髓干细胞中哪一部分更能促进肝组织再生从而更适合

18、未 来应用于临床 ? 最近的体内外研究 7, 8, 9, 10似乎更倾向于间充质干细胞 (mesenchyal stem cells,MSCs。 Lee 8的体外实验证实 :经 HGF 与 oncostatin M相继诱导 4周 ,MSCs 呈现典型的矩形肝细胞样形态 , 表 达肝细胞标志性基因 , 随后开始具备肝细胞功能 :包括白蛋白合成 , 糖原贮存 , 尿素分泌等 .Sato 10比较三种骨髓细胞 :hMSCs、 CD34+细胞、 非 -hMSCs/CD34-细胞异种肝内直接移植结果 : MSCs显示了更 强的肝细胞分化潜能。故本实验选择 BMSC S 作为供体细胞。过去通过体外转染报告

19、基因, Brdu ,核素或荧光染料标记移植细胞应用较多,但其标记效率或 长期效应难以确定。本实验供体选择显性遗传的表达绿色荧光蛋白的小鼠,因转基因动物表达的报 告基因普遍存在,体外扩增或体内分化不会导致报告基因关闭,可以提供简单、直观、稳定的标记 细胞。本实验制备的肝损伤模型与文献报告的方法 11相同,通过持续注射 CCl 4诱导肝硬化, Masson 染色显示肝小叶大量纤维间隔形成, 提示动物模型制作成功。 为了避免受体肝组织自发荧光的干扰, 我们做了二抗标记 Cy3的抗 GFP 间接免疫荧光染色, GFP 与抗 GFP 双荧光标记进一步确认了移植 细胞的身份。本移植实验结果表明:移植细胞并

20、不见于健康小鼠肝内, 这一结果提示持续肝损伤刺激可能是 供体 MSCs 增殖分化的必要条件 ,Dabeva 12在一项胎肝细胞移植实验中也证实了这一点。另一方面, 肝损伤引起的某些因子如 SDF1和 MMP9(matrix metalloprotease 的升高, 可能是 MSCs 向肝归巢的 重要原因 13, 14。研究表明 (15 ,把人 MSCs 移植到处于发育阶段的动物模型体内的接受环境后,在多种组织 中观察到 MSCs 位点特异性的分化。因此,通过干细胞小生境(niche 提供的微环境信号可以从外 部控制干细胞分化趋势 16, 17 。这一结果支持了这样的观点:植入环境而非内在的分化

21、程序,决定 了 MSCs 的分化趋势。本实验发现,在细胞植入受体后 4周,肝内约有三分之一的供体 MSCs 表达 白蛋白;从形态学看: GFP阳性细胞呈类圆形,直径多在 20µm左右。而一般认为 MSCs 体积小, 核浆比大, 根据我们的观察, 其最大径不会超过 10-15µm。 这一结果与 Lee 8等的体外观察结果吻合: MSCs 向肝样细胞分化的过程中也经历了形态的增大变化。那么为什么还有三份之二的移植细胞白 蛋白表达阴性呢?我们推测原因可能为:(1 . 植入 MSCs 的增殖分化并非同步,彼此处于不同的分 化阶段,随着观察时间的延长,将有更多的 MSCs 分化为成熟

22、肝细胞; (2 . MSCs中真正具备肝细 胞分化潜能的只是其中的一个亚群; (3 . 从 MSCs转化而来的肝细胞同样受到了 CCl 4的损伤。具 体原因仍然有待进一步研究。MSCs 会否转化为肝内其他类型细胞如肝星状细胞、 内皮细胞、 Kupffer 细胞呢? Sato 10否定了 这种可能性,本实验未作这方面的相关研究。虽然本实验未作相关检测,但我们推测:MSCs 作为 潜在的肝干细胞,也有可能转化为胆管细胞,本课题组的前期研究已证明:大鼠胎肝干细胞 CK-19表达阳性 (18 。肝功能检测结果表明:虽然与健康裸鼠相比各指标值仍有差异,但在 CCL 4注射相同的情形下, 细胞移植组术后

23、4周的血清白蛋白及 ALT 水平明显好于未行细胞移植组, 这证明了干细胞移植的作 用。但是,由于移植细胞在受体肝组织中所占比例极少(粗略估计仅在 5%左右 ,其作用机制不能 仅仅归因于供体 MSCs 本身转化为肝样细胞后发挥的作用,可能还有其它因素的作用,例如是否通 过某些机制促进了受体肝干 /祖细胞的招募、活化及分裂和 /或患肝残存肝细胞的增殖。本课题组前 期所做的同种异体成年大鼠肝细胞经腹腔移植治疗急性肝衰的实验也提示:尽管植入肝细胞短期内 即遭免疫排斥,仍然显著提高了实验组的生存率,免疫组化揭示肝卵圆 细胞大量增生(甘向阳, 滕皋军等,待发表 。虽然有文献报道 (19 :在 CCl 4注

24、射后立即行细胞移植,可以减轻肝纤维化程度。但是,本实验 Masson 染色显示 MSCs 移植并不能明显改善持续 CCl 4注射所致的肝纤维化,提示肝星状细胞一旦 大量活化,肝纤维化过程难以逆转令我们感到困惑和难以解释的现象是:HE 染色片中, A 组沿汇管区出现的大量异形细胞,我们曾以为是经过增殖的供体 MSCs ,但却与绿色荧光细胞不完全符合,而且未行细胞移植的 B 组也 可见到类似细胞, 但较为稀少。 正常裸鼠则未有上述现象。 我们难以解释这一现象, 勉强的解释是:受体自身的骨髓干细胞在持续肝损伤刺激下迁移至汇管区周围增殖分化,供体 MSCs 有促进这种迁 移即 “ 召唤 ” 的作用。作

25、为一种潜在的新的肝干细胞来源, MSCs 的优点是显而易见的:可自体获取,避免了免疫排 斥问题; 体外扩增容易和黏附贴壁性强, 在 3个 /cm2下, 经过两周 MSC 可以扩增 600倍 (20 。 巨大的增 殖性是应用其进行细胞治疗的基础,而良好的贴壁性则有利于细胞的分离纯化。本实验的研究结果 初步证实:持续肝功能损伤可以有效诱导 MSCs 向肝迁移增殖,部分 MSCs 在肝细胞持续损伤的微环 境下有向肝样细胞 (hepatocyte-like cells横向分化的潜能, MSCs移植可以在一定程度上修复受损肝 功能。目前仍然需要解决的问题是:MSCs 横向分化与修复受损肝功能的具体机制;

26、未来临床应用的 安全性、适应证以及临床疗效的评估,与其它治疗方法的关系等。参考文献1. Petrsen B E, Bowen W C, Patrene K D, et al. Bone marrow as a potential sourse of hepatic oval cellsJ.Science, 1999, 284: 1168-1170.2. Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate intohepatocytes in vivo.Nat

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38、 Gao-jun, JU Sheng-hong,et al.Laboratory of Molecular Imaging, Department of Radiology, Zhong Da Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, ChinaAbstractObjective To observe whether bone mesenchymal stem cells (MSCs have the potential to transdifferentiate into functional hepatocyte-like cells

39、in the special “niche” as well as the therapeutic feasibility to repair damaged liver. Methods 20 nude mice were randomly divided into four groups (n=5 in each group: Group A:. 1.0mL/kg of carbon tetrachloride(CCl4 (dessolved in olive oil by ratio of 1:1 was injected into the peritoneum of mice twic

40、e a week for 5 weeks. GFP-positive MSCs(1×106cells were injected into the caudal tail vein 1 week after the first dose of CCl 4;Group B: treated with CCl4 as in A,but received the same volume of saline; Group C:normal nude mice with GFP-positive MSCs Transplanted in the same way as in A. Group

41、D: normal controls.4 weeks after the cell transplantation,all animal subjects were killed. Liver function tests (LFT , histologyof HE and Masson stainingas well as double immunofluorescent staining for GFP and albumin were studied in all groups. Results The hepatic fibrosis in group A & B confir

42、med the success of model for liver damage and there was no marked difference in the percent of the area occupied by collagen between two groups(10.5±1.5 vs. 12.7±1.6, t =-2.238, P >0.05 . GFP-positive MSCs were mainly observed around portal area or interspace of lobules in group A. Some of GFP-positive cells also express albumin(35±7% .While in group B,C or D,there is no such findings. The level of serum albuminin group A wa