临床实验诊断技术

1、临床实验诊断技术第一节 临床血液学检验和尿液检验随着基础医学和科学技术的飞速发展,临床血液学检验和尿液检验的新仪器的大量引进,因其具有检测精密度高、分析速度快、操作易标准化等优点，正好弥补了手工分析的弱点，使检验医学从传统的手工操作向自动化方向发展，更好地为临床服务。一血细胞分析仪 一）检测原理 现代血细胞分析仪虽然型号不一，但检测原理基本分二大类1 电阻抗检测原理根据血细胞非传导电性的性质，以对电介质溶液中悬浮颗粒在通过计数小孔时引起的电阻变化为基础。当一个细胞通过小孔时小孔感应区内电阻增加，于瞬间引起了电压变化而出现一个脉冲信号。经过对各种细胞所产生脉冲大小的电子选择，可以区分不同种类的细

2、胞，并进行分析。2 光学检测原理 当细胞悬液在鞘流液的约束下，细胞排成单列，由喷嘴喷出形成了细胞液柱，与入射的激光束垂直相交，使激光产生散射。低角前向散射光主要用于检测细胞大小；高角前向散射光主要用于检测细胞内部精细结构和颗粒物质。光散射的变化引起电脉冲信号的改变，其大小与细胞体积相关，其数量反映了通过激光检测区细胞的数量。二） 性能特点1. 检测速度快、样品用量少。2. 检测项目多，一般可检测的参数达20项左右。3. 高精密度，检测白细胞各参数的变异系数（CV）一般均低于5%-10%。4. 低污染率，一般均低于1%。5. 直观性强，有数值报告；直方图和散点图行显示及文字性提示。6. 完善的报

3、警功能，对异常检测结果能显示相应的报警信号。三） 临床应用1. 血细胞检验多参数化 通常包括红细胞(RBC)、白细胞（WBC）、血红蛋白（Hgb）、血小板（PLT）、红细胞压积（Hct）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞体积分布宽度（RDW）、平均血小板体积（MPV）、血小板体积分布宽度（PDW）、血小板压积（PCT）、白细胞三分类或五分类的数值和百分比（%）等。2细胞直方图的应用 （1）白细胞直方图 从图形的变化可故计被检血样中细胞群体的变化，但这种变化是无特异性的。如图中间细胞群可包括大淋巴细胞、原始细胞、幼稚细胞，其中

4、任一细胞增多均可使直方图产生相相似的变化。因此，异常直方图的出现就提示要进行血片镜检。（2） 红细胞直方图 直方图行的变化再与其他参数结合分析，对贫血的鉴别诊断颇有价值。（3） 血小板直方图 当待检样本中小细胞增多或出现细胞碎片，或血小板聚集时，会影响实验结果，血小板体积直方图均能反映这些变化。二全自动血液凝固分析仪 血栓与止血的检测从传统的手工方法发展到全自动血液凝固分析法,可定量分析与凝血、抗凝及纤溶有关的多种因子，使血栓与止血的检测变得更为简便、迅速、准确而可靠。（一） 基本原理 目前凝血仪使用的凝固法大致分为三类：1生物学(凝固)法(1) 光学法 又分成二种：散射比浊法和透射比浊法 散

5、射比浊法 根据待检样品在凝固过程中散射光的变化来确定凝固终点的检测方法。 透射比浊法 根据待检样品在凝固过程中吸光度的变化来确定凝固终点的检测方法。(2) 电流法 将待检样品作为电路的一部分，由于纤维蛋白具有导电性，可利用电路的连通与否来判断纤维蛋白的形成与否，即判断凝固终点。(3) 黏度法 又称磁珠法。在待检样品中加入小铁珠，利用变化的磁场使小铁珠产生运动，随着血浆的凝固，血浆黏度增加，小铁珠的运动强度减弱，仪器根据小铁珠运动的变化来确定凝固终点。2生物化学法 通过测定产色物质的吸光度变化来推算所测定物质的含量。3免疫学法 以被测物质作为抗原，用免疫动物的方法制备相应的抗体或应用单克隆技术制

6、备单克隆抗体，利用抗原、抗体的特异性反应对被测物质进行定量分析。（二） 临床应用 1 凝血系统 凝血系统的筛选试验，包括凝血酶元时间（PT）、活化部分凝血酶元时间（APTT）、凝血酶时间（TT）测定；也可进行单个凝血因子含量或活性的测定，如纤维蛋白原（Fib）及凝血因子：II、V、VIII、IX、X、XI、XII。2 抗凝系统 抗凝血酶（AT）、-抗纤溶酶、蛋白C（PC）、蛋白S（PS）、抗活化蛋白C（APCR）。3 纤维蛋白溶解系统 抗纤溶酶原、可溶性纤维蛋白单体、纤维蛋白降解产物（FDP）、交联型纤维蛋白降解终末产物，又称D-D二聚体（D-dimer）。4 临床用药（生物制品）的监测 当临

7、床应用普通肝素、低分子肝素及口服抗凝药物如华法令及输注血液制品（因子VIII浓缩剂等）时，可用血凝仪进行监测。三 血液流变仪 血液流变学主要研究血液及其组成成分的流动与变形的规律, 血液流变性能异常可导致血液循环和微循环的障碍，故血液流变学在某些疾病的诊断、预后判断和预防等方面有重要应用价值。（一） 血液黏度测定方法 黏度是血液的重要力学性质，也是血液流变学重要的研究内容之一，常用黏度计来测定，按其原理可分为两大类： 1毛细管黏度计 一定体积的血液通过具有一定长度与内径的特制的玻璃毛细管所需要的时间与相同体积的水通过同一玻璃毛细管所需要时间的比值。所测的黏度为比黏度。2 旋转黏度计 应用两个共

8、轴柱面（或锥面）间充满被测液体，一个柱面静悬，另一柱面以某种角度旋转，被测液体内摩肩接踵力的作用带动静悬柱面旋转一定的角度。根据这一角度即可计算出被测液体的黏度。是比较理想的测定全血黏度的黏度计。 （二） 血液流变学指标及其临床应用 1血液黏稠度指标（1） 红细胞压积 红细胞压积反映血液流变特性： 血液黏度与红细胞比积成正比, 红细胞压积影响红细胞聚集与血沉： 红细胞压积增高则血沉减慢； 红细胞压积降低则血沉增快；红细胞压积反映血液流动性： 红细胞压积降低则血液流动性增加,反之,则降低。（2） 血浆成分 血脂增加，血液变得黏稠，反之，则血液稀薄；免疫球蛋白增加也可导致血浆黏稠度增加。 2血液黏

9、滞性指标 血液黏度是血液流变学最重要的指标，现介绍下列有关名词：（1）全血黏度 又称表观黏度，反映血流变基本特性，与流场切变率有一定相关性。（2）运动黏度 是血液全血表观黏度和血液密度的比值。（3）相对黏度 是某一切变率下的全血表观黏度与血浆黏度的比值。（4）比黏度是某一切变率下的全血表观黏度与水黏度的比值。（5）还原黏度 为全血黏度与红细胞压积的比值，即单位红细胞比积的全血黏度值。3血液聚集性指标（1）血沉 血沉快、慢与血浆黏度，尤其与红细胞间的聚集力有密切关系。红细胞聚集力大，血沉就快；红细胞聚集力小，血沉就。（2）血沉方程K值 血沉除了受血浆黏度及红细胞聚集的影响外，还与红细胞比积之间有

10、密切关系，即血沉随红细胞比积的减少而增大，反之则减少。4血液凝固性指标 （1）纤维蛋白原 纤维蛋白原与血液中的清蛋白、球蛋白等相互间的作用，使血浆黏度增加。（2）血液凝固时间 血液凝固时间的长短可以部分地反映纤维蛋白原含量的多少。5血细胞变行性指标 血液流变特性的恶化，如红细胞变行能力的异常可直接影响肾小球毛细血管的微循环及滤过性，造成肾功能的进一步损害。 从目前临床实践看，某些疾病与血液流变学指标改变有较为密切的关系，这些疾病大多与血液循环系统有关，如心血管病、脑血管病、糖尿病、血液病等。四尿液干化学分析仪尿液干化学分析仪按照检测项目的多少分为8、9、10和11项尿分析仪。（一） 基本原理

11、常采用反光度法原理，即一束光线照射到已发生化学反应的试带上，其反射光强度与试带表面颜色深浅成正比，经光电管接收以后转变成电信号，通过微机处理得出结果。（二） 尿液干化学分析仪的参数和临应用1尿比重（SC） 监测肾脏的浓缩功能。2酸碱度（PH） 了解体内酸碱平衡状况。3蛋白质（PRO） 检测各种生理性、体位性和病理性的蛋白尿。4葡萄糖（GLU） 用于各种生理性、病理性和糖尿病尿糖检测。5酮体（KET） 用于糖尿病酸中毒和其他酮症的治疗监控。6胆红素（BIL） 筛选早期可疑肝胆系统疾病和黄胆的鉴别诊断。 7亚硝酸盐（NTT） 泌尿系统菌尿症的过筛试验。8尿胆原（URO）筛选早期可疑肝胆系统疾患和黄

12、胆的鉴别诊断。9白细胞（WBC或LUE）肾脏和泌尿系统疾患的检测。10红细胞（RBC或ERY）肾脏和泌尿系统疾患的检测及血管内溶血的监测。五尿沉渣分析仪 自动尿有形成分分析仪可检测尿液有形成分并报告定量值。（一） 基本原理 采用流式细胞术原理，获取尿中细胞的前向散射光和前向荧光参数。尿液样本经荧光染色后经流体动力学聚焦，从喷嘴出口进入鞘流室，每个细胞以单排列方式通过流动室的中轴。细胞受氩离子激光束照射，各自发射的荧光和散射光程度不同。每个细胞的 散射光强度和荧光强度被转换成电信号，并产生1个直方图和2个散电图。仪器可对尿红细胞、白细胞、上皮细胞、管型和细菌加以分类和定量显示。（二） 尿沉渣分析

13、仪的临床应用1 鉴别血尿来源 检测RBC的变异性和均一性以判断血尿来源。2 诊断泌尿系统感染 急性泌尿系统感染，白细胞>60/ul；慢性泌尿系统感染白细胞>10/ul ，还可根据白细胞在散点图中所出现的位置来判断疾病的急、慢性。仪器还可提供尿液中实际细菌含量，以细菌数105 /mL为泌尿系统感染的判定值。3 药物治疗疗效观察 仪器可对满视野红、白细胞进行计数，作出定量报告，有助于血尿、尿路感染患者的疗效观察。4 电导率指标提示尿液状态 尿液的电导率反映渗透压水平，从而能间接了解肾功能状态。尿沉渣分析是对尿液干化学分析的補充，也是尿液常规检验中十分重要的过筛试验。. 第二节 临床生物

14、化学检验 随着科学技术和医疗事业的发展,临床生物化学检验的样本种类和数量迅速增长,新的检验项目不断增添, 自动生化分析仪提高了工作效率,也提高了试验的精密度与准确度,降低了室内和室间变异系数,增加了结果的可比性和可信度。由于生化分析仪可以快速为临床医生提供综合性信息,已成为临床实验室最常用的检验仪器。现介绍临床生化实验室最常用的几种仪器。一 自动生化分析仪自动生化分析仪按其结构不同，主要可分为连续流动式、离心式和分立式生化仪三类，它们的结构装置和工作原理各式之间也有差别, 分立式生化分析仪是目前应用最多的一类生化分析仪,有单通道和多通道,可采用动力学、终电法、两点终电法、两点速率法等多种方法。

15、（一） 基本原理和功能 仪器的机械动作均与计算机结合，具有以下功能1 探针系统 智能化探针系统包括样本探针和试剂探针.用于吸加样品及试剂。2 搅拌和冲洗系统 搅拌系统须使样品与试剂混合后迅速分布均匀,以测定反应系统中的吸光度。现均采用激流式单向冲洗和多步骤冲洗。3恒温系统 目前应用较为广泛的是水浴式恒温和空气浴。在反应杯内的各类化学反应尤其是酶类的检测需要一个恒定的温度，大多数仪器的恒温有37C、30C或25C三挡可选择。4反应盘 目前自动生化分析仪都用硬质玻璃比色杯，其透光性好，不易磨损。仪器有自动清洗站进行清洗，清洗后读取吸光度/透光度结果在屏幕上显示出不洁净的反应杯位置，便于更换。5操作

16、系统 操作系统可进行质控管理及参数修改，并显示所有反应曲线；还可进行项目计算、检测空白修正、正常参考值试剂吸光度等数据管理。 分析数据是通过仪器中微处理机与实验室信息系统（laboratory information system,LIS）进行联网管理。仪器还备有条形码系统，可自动对患者样品和试剂进行识别，在整个测定过程中，计算机能将条行码信息转换成相应的动作，直至最后报告发出。6光栅系统 无相差蚀刻凹面光栅系统是当今最先进的全息光栅,是生化分析仪的核心部分.使用寿命长，无需保养。结合后分光技术大大降低了杂散光的干扰。（二） 自动生化分析仪的种类 随着科学的进步和临床医学的发展，临床化学有了长

17、足的进步和发展机遇。在20世纪50年代后期，第一代连续流动式自动生化分析仪问世。又随着自动化仪器制造相关技术的进步,使自动生化分析仪在智能化、速度、精密度和准确度等方面一代胜一代。目前市场上应用较广泛的自动生化分析仪的种类繁多，如：日本Olympus AU 系列；美国Beckman Coulter Synchron LX系列;日本日立Hitachi 7000系列;美国Abbott Aeroset 和C8000; 瑞士Roche Cobas integra 、Bayer ADVIS1650等等。（三） 临床应用肝胆疾病 ALT 、AST、 ALP、 GGT、 LDH、 Bilirubin、 Al

18、bumin、 Pre-albumin、 CHO血脂测定 胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、APO A1、APO B、Lp(a)电解质测定 钾、钠、氯、钙、镁、磷、二氧化碳心肌酶谱 乳酸脱氢酶、肌酸磷酸激酶、肌酸磷酸激酶同功酶、羟基丁酸脱氢酶肾功能测定 尿素、肌酐、尿酸；血糖测定等等 二 干式生化分析仪干化学（dry chemistry）属于固相化学（solid phase chmistry）范畴。是将液体样品（血清、血浆、全血、尿液等）直接加到已固化于特特殊结构的试剂戴体（reagen carrier）中，以样品中的水为溶剂，将固化在戴体上的试剂溶解后与样品中的待测成分进行化学反应

19、，从而进行分析测定的一种方法。（一） 基本原理和功能1.反射光度法 主要为漫反射（diffuse reflection）,它有两个主要的特点 ： （1）因显色反应发生在“固相”，后者对透射光和反射光均有明显的散射作用，因而不服从Lamber-Beer定律。（2）固相反应膜的上下界面之间存在多重内反射（multiple internal reflection）。2.差示电位法 多层膜法对于无机离子（K、NA、CL、和 CO2）的测定，采用基于ISE原理的差示电位法。此种多层膜片包括两个完全相同的“离子选择性电极”，其一为样本电极，其二为参比液电极。测定时将血清和参比液分别加由此两电极构成的加样槽

20、内，即可测定此两者的活度，并由差示电位的相应值计算待测离子的活度。（二） 干式生化分析仪的种类最早的干化学分析的反射光度仪是血糖仪,至今仍不断向更小巧实用发展.在实验室应用较广泛的干式生化分析仪是Roche 的 Reftron、美国强生Vitro系列、 Kodak Ektachem 和Dade Behring Dimension生化分析仪等。（三） 临床应用在干化学检测项目中，从血糖、血酮体、血氨、血乳酸等单项干化学分析仪发展到多项组合式，包括：血糖、胆固醇、肌钙蛋白T、肌红蛋白、血钾、钠、氯、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇等；现已发展到每小时可测定多达950个项次，可测定的项目多达70余项，可

21、满足常规临床实验室的需求。三 血气分析仪 血气分析是诊断患者酸碱平衡紊乱及缺氧状态的主要检测项目,它包括动脉血的PH、 Pco2、和PO2等直接测定值和一系列通过计算获得的参数。(一) 基本结构和原理 1. 基本结构 大致包括:(1) 电极和测量室 有PH电极、甘汞电极、PCO2电极和氧电极(2) 恒温装置 由加热元件及温控装置组成(3) 电子控制系统 控制测定数值的放大、泵转动和阀的开关(4) 混合气配气装置 气体混合仪使CO2 和O2按一定比例混合，用于气体定标(5) 阀门和泵 泵的转动速度和方向控制血液和试剂的流动方向和强度(6) 显示屏和打印装置 用于显示和打印数据2. 基本原理 电极

22、测定的原理是血气分析仪器的基本原理之一,有pH电极、PCO2电极 和O2电极三种。血气分析方法是一种相对测量方法，在测量之前，先要用标准的液体及气体来确定pH、PCO2 和PO2三套电极的工作曲线，通常把这一过程称为定标或校准（Calibration）。每种电极都要有两种标准物质进行两点定标，以建立工作曲线。（二） 血气分析仪的种类1 AVL OMNI 由Roche公司生产的AVL OMNI系列多参数分析仪是一台集血气、电介质、血氧于一体的综合性分析仪。它采用液体定标系统和包括参比系统在内的全部免保养电极。2 ABL 系列 由丹麦雷度公司生产。ABL系列产品有ABL5型、ABL500和ABL7

23、00系列。ABL700系列采用模块设计，仪器是由执行不同功能的模块组成。可设置测定pH、血气、代谢物及血氧，可任意组合。3Nova Stat Profil Ultra 是有美国Nova公司生产，该系列有13种型号，分别标为A-M型。该型分析仪有13个直接测量的参数，即pH、PCO2 、PO2、K、NA、CL、CA、MG、BUN、Glu、 Lact、 So2 和Hct。4。Rapidlab 800系列 由Bayer公司生产，目前还有845型、855型和865型。该机采用100%免换膜的免保养电极，全智能自动进样系统。5Rapidpoint 400系列 由Bayer公司最新推出的免维护急诊检测仪用

24、于血气分析，电介质和血糖测定。仪器采用多功能、长寿命、含电极的测量试剂包，无需外带任何试剂及气瓶。（三） 血气分析仪的临床应用 血气分析是诊断患者酸碱平衡紊乱及缺氧状态的主要检测项目，它包括动麦血的pH、PCO2 、PO2等直接测定值和一系列通过计算获得的参数。在临床上主要用于：1 手术 尤其是体外循环进行的心胸手术等引起的酸碱平衡紊乱及其纠正。2. 多种疾病引起的急、慢性呼吸功能衰竭和代谢性酸碱平衡紊乱。3 呼吸心跳骤停后通过心肺复苏等挽回生命后的患者，其严重的酸碱平衡紊乱的诊断和纠正。4 血气分析的连续监测是混合型酸碱平衡紊乱的诊断前提，也是其它各型作为合理治疗的分析基础。5 离子选择性电

25、极和酶固相电极的应用，使血气分析仪有向其它急诊项目扩展；目前的模块化组合，血气分析仪常具有四大模块组成，有需要时可以加装任何模块，以满足临床需要。四 电解质分析仪 离子选择性电极（ion selective electrode,ISE）的电解质分析仪已广泛用于电解质测定，它是一类对某种特定离子具有选择性响应的电化学传感器。（一） 基本结构和原理1基本结构 离子选择电极法的电解质分析仪一般由进样传送系统、离子选择电极和离子计等部件组成。2 基本原理 电解质分析仪的工作原理和血气分析仪相同，采用一个毛细管测试管路，让待测液体同时和所有的测量电极相接触。这样，不同的电极和样品中相应的离子起作用而建立

26、起来各自相应的电位；离子计或离子浓度计将电极产生的电位放大后显示或打印出来。（二） 电解质分析仪种类1 国产900系列电解质分析仪 由上海迅达医疗仪器公司生产。应用离子选择性电极直接测定血浆、全血、脑脊液等生物体液中的钾、钠、氯、离子钙、锂、pH和总CO2等电解质浓度。2 Nova CRT16分析仪 是美国Nova Biomedical 采用生物传感器推出的一台全自动电解质分析仪，并可计算渗透压，尿素/肌酐比和阴离子间隙（AG）。3 AVL918X系列 可按需要选择不同类型的分析样品，采用试剂包方式提供试剂，电子线路由微机控制。（三） 临床应用 具有重要临床意义的电解质包括：钾、钠、氯、离子钙

27、、镁、磷和碳酸氢根浓度等。 当机体某些器官发生病变或受到外源性因素的影响，都可能引起或伴有电解质代谢紊乱。必须及时纠正。为此，及时准确分析体液中的电解质浓度非常重要。 五 自动电泳仪 各种先进的电泳仪和电泳技术的不断发展，使它在生物化学实验技术中占重要地位,临床检验领域中也是最常用的实验技术之一。（一） 基本原理 各种携带电荷的粒子依据其所带电荷量或分子大小的不同，在电场作用下,在特定介质中分别向与其电荷性相反的电极泳动，称为电泳。有机化合物是两性物质，在不同介质中的电荷受p H的变化而不同。蛋白质在其等电点以下时带正电，在等电点以上时带负电荷。（二） 实验室常用电泳技术的种类1. 区带电泳

28、区带电泳技术 (zone electrophoresis)是在临床检验领域中应用最广泛的技术。现均采用琼脂糖凝胶为介质进行血清蛋白电泳、同功酶电泳、血红蛋白电泳等。2. 等电聚焦电泳 等电聚焦电泳(isoelectric focusing)是一种利用具有pH梯度的电泳介质来分离等电点(pI)不同的蛋白质的技术。其分辨率较不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳更高，特别适合于分离分子量相同而电荷不同的两性大分子。等电聚焦电泳分辨率高特别适合次级同工酶的分离。3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 是利用聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel，PAG）作为介质，具有分子筛的作用，分辨率比其它方法更为清晰。再加

29、上十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）使蛋白质分子均带负电，在电场作用下向正极泳动。通常称作SDS-PAGE电泳。4免疫固定电泳 免疫固定电泳是一种包括琼脂糖凝胶电泳和免疫沉淀两个过程的操作。检测标本可以是血清、尿、脑脊液或其它体液。已在医学研究、法医学、基因诊断和临床实验室中得到了广泛的应用。（三） 电泳技术在检验医学中的应用1 血清蛋白电泳 新鲜血清经电泳后可精确地描绘出患者蛋白质的全貌，各种病理现象所显现的图像的描述，有助于许多临床疾病判断的参考，尤其是对单株丙球血症的单克隆蛋白（M蛋白）的检测，可在电泳区带的a2区呈现致密而深染且高度集中的蛋白克隆增生

30、的区带，称其为M,蛋白,血清蛋白电泳是首选的实验。2同工酶电泳：（1）血清乳酸脱氢酶同工酶(lactate dehydrogenase isoenzymes, iso-LDH)经电泳后可分离出五种同工酶区带，根据其电泳迁移率的快慢，将速度最快的命名为 LDH1，依次LDH2、LDH3、LDH4和LDH5，不同组织的LDH同工酶分布不同，存在明显的组织特异性。急性心肌梗死发病后平均6小时LDH1即开始升高，LDH1/LDH21为心肌损伤的阳性决定性水平。（2）血清肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes，iso-CK）其原理是根据CK-同工酶分子结构不同，所带电荷各异

31、，从阴极到阳极将CK不同组份予以分离，其分别为CK-MM，CK-MB和 CK-BB。当出现一些异常同工酶如巨CK(Macro-CK)、巨CK称线粒体-CK(CK-MT)，从电泳图谱上很容易发现。由扫描仪对各条酶谱进行扫描，报告各条区带所占百分比，结合总酶活力，求得区带的酶活力定值结果。3 非浓缩尿蛋白电泳 采用SDS-PAGE电泳进行非浓缩尿蛋白电泳，电泳后呈现出中、高分子蛋白区带主要反映肾小球病变；呈现出低分子蛋白区带可见于肾小管病变及溢出性蛋白尿；混合性蛋白尿则可见到大、中、小各种分子量区带，示肾小球及肾小管均受累及。4 免疫固定电泳 主要用于血清M蛋白的分型与鉴定实验和尿本周蛋白的分型与

32、鉴定。当样本内存在单克隆成份时，通过抗IgG、A、M重链和抗、抗轻链抗血清可检出单克隆条带并予以分型；当存在两种或两种以上的单克隆成份，可通过免疫固定电泳检出两种或两种以上的单克隆条带并予以分型，可能为双克隆丙种球蛋白血症，或是寡克隆丙种球蛋白血症。该实验现已列入临床实验室的常规检测工作。5高效毛细管电泳 高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis, HPCE）是在传统电泳基础上继现代高效液相色谱技术之后发展起来的一种新型高效分离技术。是一种在空芯的、微小内径的毛细管（内径 10200m ）中进行的大、小分子的高效分离技术。由于它具有无

33、法比拟的高效和快速性，因而受到越来越多科学家们的青睞，在临床应用方面具有广阔前景。第三节 临床免疫学检验 自20世纪80年代杂交瘤技术和基因重组技术创建以来,现代免疫学的研究手段也从细胞生物学、遗传学深入到蛋白质组学和基因调控水平。免疫学的新知识很快渗透到临床各个学科，为对许多疾病的诊断和鉴别诊断开展的新项目提供了理论依据。随之也要求免疫学检测手段和测定仪器向高灵敏度、高精密度和高自动化方向发展。本节就临床免疫学常用的检测技术和自动化仪器的临床应用作一介绍。一. 免疫比浊分析(一) 基本原理 免疫浊度法是可溶性抗原和抗体在液相中特异性结合,产生一定大小的复合物,形成光的折射或吸收,测定这种折射

34、或吸收后的透射光或散射光作为计量单位.(二) 免疫浊度法的分类与仪器1. 透射光免疫浊度法 当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱,在光源的光路平行方向测量透射光强度，从而得知被检溶液中微粒浓度的方法称透射光免疫浊度法或透射比浊法(turbidimetric immunoassay或turbidimetry),读数以吸收光单位(A)或OD值表示。如：各类大型自动生化分析仪。2. 速率散射比浊法 是指抗原与抗体在某单位时间内形成的最大速率，而仪器是测定当某单位时间内呈现速率下降即形成速率峰时，该峰值的高、低，即代表抗原的量。如Beckman Coulter公司的Arr

35、ay360和Image即是此型.3. 终点散射比浊法 利用激光二极管(840nm)作为光源,以13-24前向角度测量散射光信号, 散射光的强度与抗原、抗体形成的免疫复合物浓度成正比, 散射光电信号与贮存在计算机内的标准曲线进行比较，转换成检测物的浓度单位。如由Dade Behring公司生产的 Nephelometre BN 100即此型。4动态定时散射比浊法 是介于速率和终点之间的一种散射比浊法，通过线性回归方.式确定反应的最大速率，具有抗原过量的检测，以避免高剂量HOOK效应。并利用在两个不同时间内获得的光散射信号的差别,可排除干扰,以提高检测的敏感性和特异性。如Dade Behring公

36、司生产的BN Prospec和 BN II。5胶乳增强免疫浊度法 (latex particle enhanced immunoassay) 用直径较小的化学胶乳颗粒与特异性抗体共价结合，扩大了与抗原的接触面，抗原和抗体形成的免疫复合物的直径>1000nm,使检测灵敏度提高了十倍,使微量物质的测定成为可能。(三) 临床应用免疫功能: IgA、IgG、IgM、C3、C4、Kap、Lam、IgG subclasses 1-4、IgE、C1抑制物肾脏功能:白蛋白、转铁蛋白、IgG 、 a1-微球蛋白、 B2-微球蛋白、a2-巨球蛋白、 Kap-& Lam-轻链、Cystatin C炎症

37、: CRP、a1-酸性糖蛋白、 触珠蛋白、a1-抗胰蛋白酶、铜兰蛋白、纤维蛋白原、SAA类风湿性疾病: RF、ASL、CRP、ADNaseB心血管疾病: ApoA-I、ApoB、ApoA II、ApoE、Lp(a)、肌红蛋白、纤维蛋白原、hsCRP营养监测: 前白蛋白、白蛋白、视黄醇结合蛋白、转铁蛋白、铁蛋白出 / 凝血疾病: 纤维蛋白原、AT3、纤溶酶原贫血: 触珠蛋白、转铁蛋白、铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体脑脊液: IgA、IgG、IgM 白蛋白 二。 固相酶免疫分析酶免疫测定(enzyme immunoassay,EIA)是以酶作为标记物的免疫测定法,利用酶的高效催化作用提高检测的敏感度.

38、根据抗原与抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物,将酶免疫测定分为均相（homogenous）和异相(heterogenous)两种类型。（一） 均相酶免疫测定 均相EIA测定对象为小分子抗原或半抗原,主要用于药物浓度测定。曾有两种技术：酶扩大免疫测定技术（enzyme-multiplied immunoassay technique,EMIT）和克隆酶供体免疫测定（cloned enzyme donor immunoassay,CEDIA）,前者为竞争抑制法，后者为竞争法，反应后酶活力大小与样品中抗原含量成正比。其反应过程与一般生化分析无异，无须分离结合的与游离的酶，因此可直接用生化分

39、析仪进行测定。（二） 异相酶免疫测定 异相EIA测定需分离结合的与游离的酶标记物,分离的方法主要通过固相载体。采用洗涤、离心等方法与液相中的其它物质相分离。这类异相酶免疫测定称为固相酶免疫测定（solid phase EIA）或酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbert assay,ELISA）1. 测定模式（1） 双抗体夹心法 是检测抗原最常用的方法。测定原理是将特异性抗体包被于固相载体上，形成固相抗体；加入含待测抗原的样品，使之与固相抗体结合；再加入酶标记的另一特异性抗体，最后加底物显色。反应颜色深浅与样品中抗原含量成正比。（2） 间接法 主要用于检测抗体。测

40、定原理是将特异性抗原包被于固相载体上，形成固相抗；加入含待测抗体的样品，使之与固相抗原结合；再加入酶标抗人IgG作为第二抗体；反应后再加入底物显色。（3） 双抗原夹心法 测定原理是用酶标记特异抗原代替间接法中的酶标抗人IgG，以减少假阳性。如抗乙肝表面抗体和抗HIV抗体的检测均采用此法。（4） 竞争抑制法 可用于检测抗原，也可用于检测抗体，反应颜色深浅与样品中抗原或抗体的含量成反比。（5） IgM抗体捕获法 主要用于检测各类IgM早期抗体。先用抗人IgM（链）包被于固相载体上，使样品中所有IgM均固定在固相上,经洗涤后去除IgG后测特异性IgM抗体。如抗HAV-IgM常用此法。2 固相酶免疫测

41、定仪器 (1) 微孔板固相酶免疫测读仪 微孔板式ELISA使用的载体为96孔板,直接对板孔测定吸光度(A)的比色计称为ELISA测读仪。这种仪器均是开放式，适用于所有微孔板式ELISA试剂。检测结果的精密度主要取决于试剂的质量。（2）全自动酶免分析系统 是一套自动的微孔板处理系统，包括：测读仪、洗涤仪、多通道试剂分装器、温育仪、振荡仪和管理系统，以保证仪器运行的高度自动化,可避免由手工操作所带来的影响因素。 三。荧光标记免疫分析免疫荧光在检验医学中的应用可分为三大类型：第一是经典的荧光抗体法，采用荧光显微镜将荧光素标记的抗体来检测样品或组织中的靶抗原，现广泛用于自身抗体的检测和微生物的快速鉴定

42、及分子生物学的原位杂交。第二是利用荧光标记的抗体计数免疫细胞，归流式细胞仪来叙述。第三为各种荧光免疫法（immunofluorescence assay,IFA）用于体液中抗原或抗体的定量检测。现简述如下：（一） 时间分辩荧光免疫测定仪时间分辩荧光免疫测定（time-resolved fluoreimmunoassay,TRFIA）采用镧系稀土元素标记抗原或抗体作为示踪物，并与时间分辩荧光测定技术相结合，当标记的抗体和抗原结合，稀土元素在紫外光（340nm）激发下，不仅发射出高强度的荧光（613 nm）而且衰变时间也较长，利用延缓测量时间，待样品中蛋白质自然发生的短寿命荧光全部衰变后，再测稀土

43、元素的特异荧光，可排除非特异本底荧光的干扰。是一种新型的非放射性的微量免疫分析技术，具有灵敏度高、示踪物发光稳定、标准曲线范围宽、 检测重复性好等优点，可测定内分泌激素、肿瘤标志物、病毒血清标志物、药物等。（二） 荧光偏振免疫分析和酶免疫荧光分析仪1 荧光偏振免疫分析 荧光偏振免疫分析技术（fluorescence polarization immunoassay,FPIA）是利用荧光物质经单一波长的偏振光照射后，能吸收光能并发射出相应的偏振荧光。FPIA法常用于测定半抗原药物的浓度。反应系统内除待测药物外同时加入一定量用荧光标记的相应药物（小分子），使两者与有限的特异性抗体（大分子）进行竞争

44、结合。为此，荧光偏振光强度与药物浓度呈反比。如Abbott公司生产的TDx是用于药物浓度监测的荧光偏振免疫分析仪。 2 酶免疫荧光分析系统微粒子酶免疫测定（microparticle enzyme immunoassay,MEIA）法是用塑料微粒作为固相载体，其直径为0。5m，表面多孔，从而大大增加了反应的表面积，提高了反应的灵敏度。用单克隆抗体包被塑料微粒，用碱性磷酸酶标记多克隆抗体，甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）为荧光底物。微粒在参与抗原、抗体反应后需同过玻璃纤维进行分离和洗涤。结合在玻璃纤维上的塑料微粒与加入的底物发生反应，去掉磷酸基团生成4-MU，它被激发光照射后发出荧光。MEIA荧光

45、信号强度与待测物浓度呈正比。如Abbott公司生产的AxSym酶免疫荧光分析仪可用于病毒血清标志物、肿瘤标志物和内分泌激素等定量检测。（三） 干式荧光酶免疫分析系统 VIDAS全自动干式荧光酶免疫分析仪是由法国生物梅里埃公司生产，以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，用固相管（SPR）作为固相载体，待测样品加入试剂条的样品孔内，再插入仪器内由仪器自动完成各操作步骤，以4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）为荧光底物，他被酶标抗体上的碱性磷酸酶分解，脱磷酸基团生成4-MU，发出荧光，经荧光测读仪记录，并计算出所测物质的含量。适用于急诊检验，随到随做。四. 化学发光分析 化学发光分析系统是利用在化学反应中释放大

46、量自由能产生激发态的中间体,当其回到稳定的基态时,同时发射出光子,这种现称为化学发光(chemiluminescence,CL)。化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA）或免疫化学发光分析(immunochemiluminometric assay,ICMA)是结合了化学发光反应与免疫反应,既具有免疫反应的特异性又兼有发光反应的高灵敏性.测试方法简便、快速，成为非放射性免疫分析中最有前途的方法之一。20世纪90年代后各种CLIA自动分析仪相继问世,适用于临床免疫各种定量检测。现介绍几种国内普遍使用并具有代表的类型.（一） 吖叮酯标记的化学发光免疫

47、分析检测原理和特性 所用固相戴体是磁微粒，标记用的化学发光底物为吖叮酯（acridinium ester,AE）它是一个三环的有机化合物，容易氧化，且氧化反应无需催化剂。当在碱性介质中氧化时，经过一个二氧酮的中间体，产生一个电激发的10-甲基吖叮酮，当它回复到基态时释放出光子。检测小分子抗原使用竞争法，检测大分子抗原使用夹心法。如由德国Bayer 公司生产的全自动化学发光免疫分析ACS180，2000年又推出新一代的ADVIA Centaur 均为此型。（二） 过氧化物酶标记的化学发光免疫分析检测原理和特性 采用锥形小杯为固相戴体，所有反应过程均在小杯内进行，无需与固相戴体分离。并采用增强化学

48、发光检测技术，在辣根过氧化物酶（HRP）和光增强剂存在的情况下、发光剂（luminol）经快速催化与过氧化氢发生氧化分解反应，转变为激发态，随即释放出光子。在氧化过程中起催化作用，大大提高了光信号度和发光持续时间。这是美国强生公司生产的Vitro ECI 全自动免疫分析系统专利技术。（三） 硷性磷酸酶标记的化学发光免疫分析检测原理和特性 采用粒径<7m的磁微粒为固相戴体,用以包被抗体或抗原。以Dioxetane磷酸酯作为底物简称AMPPD，是高度灵敏、稳定的发光剂，它在硷性磷酸酶的催化作用下，迅速脱去磷酸根，生成不稳定的中间体AMPD。当AMPD分解时就产生持续而稳定的发光。检测大分子物

49、质采用夹心法，检测小分子物质采用竞争法或抗体捕获法进行分析。现有美国Beckman Coulter的商品Access全自动化学发光免疫分析和美国Diagnostic product Corporation(DPC) 公司应用同一原理生产的 Immulite全自动化学发光免疫分析仪。（四） 电化学发光免疫分析检测原理和特性 电化学发光（electro chemiluminescence,ECL）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光两个过程。采用带有磁性的直径为2.8m的聚苯乙烯微粒为固相戴体,其特点是表面积大,吸附效率高;并带有磁性,在分离游离标记物与结合标记

50、物时只需用磁铁吸引。以三联吡啶钌作为标记物，标记抗体或抗原，通过免疫反应及ECL反应，即可进行电化学发光免疫测定（ECLIA）。在实际应用中有特定的仪器和配套试剂。瑞士Roche公司的ElecsysECLIA系统，是目前在医学检验中应用的唯一的电化学发光免疫分析仪。 五 胶体金免疫测定 固相膜免疫测定（solid phase membrane based immunoassay）的特点是以微孔膜作为固相，标记物可用酶和各种有色微粒子如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等，以红色胶体金最为常用。在固相膜免疫测定中，穿流形式的称为免疫渗试验（immunofiltration assay）; 横流形式的称为免

51、疫层析试验(immunochromatographic assay,ICA)。因常用胶体金标记，统称为“金标“。（一） 试验模式 1抗原检测 大分子抗原的检测常用双抗体夹心法。应用最广的为尿液HCG测定。小分子抗原的检测采用竞争法，多为ICA试验，如药物和毒品的检测。2抗体检测 一般应用间接法，即用胶体金标记抗人IgG，在硝酸纤维膜（NC）上加特异性抗原。这种方法适用于IFA。 （二） 临床应用 胶体金免疫测定由于快速、简便，在临床上已广泛应用，特别是ICA试剂品种日益增多，主要的临床应用有下例几方面：1各种蛋白质检测 血清甲胎蛋白、癌胚抗原、肌红蛋白、肌钙蛋白、尿微量白蛋白、粪血红蛋白等2感

52、染性疾病抗原、抗体检测 如乙肝表面抗原和抗体、抗HIV抗体、抗结核抗体、抗幽门杆菌抗体等3激素检测 包括人绒毛膜促性腺激素（HCG）、促黄体生成素（LH）、促卵泡成熟激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）等。4药物检测 以毒品为主，如吗啡、可卡因、鸦片等。现ICA试验的定量分析仪也已问世，有利于胶体金免疫测定的广泛应用.六. 流式细胞分析仪 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM )是一种单细胞或其它生物粒子膜表面以及内部的化学成份进行定量分析和分选的检测手段,可高速分析上万个细胞,并能从一个细胞中测得多个参数,是当代最先进的细胞定量分析仪。（一） 基本原理 通常以激光作为激发光源，

53、经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧。光散射信号在前向小角度进行检测，反映了细胞体积大小；荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转变为电信号。（二） 基本结构1流动系统 流动系统是流式细胞仪的心脏。细胞悬液和鞘液分别进入流动室，鞘液的作用是使样品悬液中的粒子组成单一纵列方式通过测量区，保证每个细胞通过基光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。2激光光源 多采用氢离子激光器。使发射光在可见光谱泛围内488nm激发。3光学和电子系统 有两个光散射参数需要收集，前向角散射光用于检测细胞体积大

54、小；侧向散射光用于检测细胞膜、细胞质、核膜等细胞内部结构及胞质内颗粒。荧光信号是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受到激光激发后发射的。荧光波长与激光波长不同，因此要使用光学滤片去除非荧光信号并使用灵敏的检测器。4数据储存和计算计放大系统 利用计算计作多种图行来表明各参数间的相互作用，以单参数直方图、双参数二维点图、等高图等方式显示。5细胞分选 细胞分选可使被指定的细胞从细胞群体中分离出来，被选出来的细胞的均一性与所测参数有关。（三） 流式细胞术的临床应用流式细胞仪的功能决定了其在医学领域中的地位，目前在临床上主要用于细胞表型分析、造学系统肿瘤诊断和分型、移植前配型、与免疫有关疾病的分型等。1与

55、CD 抗原相关的试验：包括与T细胞有关的CD及起所表达的细胞；与B细胞和造血细胞前体细胞有关的CD抗体；NK细胞标志；IgFC受体；与学小板相关的CD抗原。2白血病和淋巴瘤的分型和诊断 FCM是血液病MIC分型法中免疫表型分析的重要手段。包括白血病系列分化抗原和白血病系列非特异性抗原。3对血液病化疗的指导作用 通过对DNA周期分析或DNA/RNA图型分析，能迅速获得细胞增殖状态的信息，为治疗提供有效信息。4免疫缺陷病的诊断和监测5感染性疾病辅助诊断和疗效监测6自身免疫病的监测 如HLA-B27；HLA-DR 的检测。7化疗药物用药指导8实体器官移植配型和排异监测9肿瘤的诊断、预后判断和化疗监测

56、10细胞凋亡的检测 利用光散射和荧光染色能够通过检测细胞光散射的改变、膜结构和转运功能的改变、DNA含量变化和DNA断裂点的标记，从多方面分析和鉴定凋亡。 第四节 临床微生物学检验 临床微生物学检验分析主要包括自动血培养检测系统、微生物培养、鉴定和药敏系统等。一 自动血培养检测系统 （一） 检测原理 主要有以下三种检测技术：1放射性碳14C标记 将待测样品接种于含碳14C标记底物的培养基瓶中，如有细菌生长，细菌在代谢过程中将利用14C标记的底物，而产生14CO2。当仪器检测到的14CO2。量超过规定界限时即报告细菌培养阳性。2二氧化碳感受器 每一个培养瓶底部都有一种称为Novel的感受器，当培养瓶内有微生物生长，即释放出CO2并渗透至CO2感应器，改变感应器的酸硷值，使其从原来的深绿色变为黄色，由计算机记录颜色变化并报告细菌培养阳性。3均质荧光 在液体培养瓶内含有荧光物质的分子。在培养过程中，若有微生物生长，其代谢过程中将会产生一些物质导致荧光衰减，一旦被仪器检测，即提示有细菌生长。（二） 自动血培养仪的要求 准确、及时的血培养检查对败血症等全身性感染的诊断和治疗具有十分重要意义。理想的血培养检测系统应达到下列要求：1 应同时能检